Summary
모기 표본의 품질 말라리아 기생충 및 벡터 DNA를 추출 할 수 신속하고 저렴한 방법은 설명되어 있습니다. 간단한 방법은 모기 중간 창자와 침샘 단계에서 말라리아 기생충의 genotyping,뿐만 아니라의 분자 식별, Chelex 수지의 킬레이트 특성에 수 대문자로 표기
Abstract
발병 국가들은 점점 자신의 제어 프로그램 1,2,3,4,5의 중요한 부분으로, 효율적인 타이핑, 신분증과 말라리아 기생충과 벡터 모기에 대한 감시를위한 분자 도구를 채택하고 있습니다. 작업에서 이러한 정확한 접근 방식의 지속 가능한 설립 말라리아 제어 및 지극히 검소한 시약 및 장비 요건을 제거 노력 간단하고 저렴한 방법을 강화하기 위해 연구 6,7,8 필수적입니다. 여기 현장 수집 모기 표본에서 말라리아 기생충 및 벡터 DNA를 추출하기위한 간단한 Chelex 기반 기술을 제시한다.
우리는 morphologically 72 아노펠레스 gambiae SL을 확인. pyrethrum 스프레이는 마챠에서 말라리아 연구소의 2,000 킬로미터 주변에서 가정의 객실이 수면에 기하여 캡처 156 모기에서. 절개는 72 아노펠레스 할머니를 위해 복부에서 머리와 가슴을 분리하는 후biae SL. 모기는 두 섹션은 개별적으로 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 배치하고 탈 이온수 20 μl에 잠겨 있었다. 멸균 피펫 팁 사용하여 각 모기 섹션은 별도로 탈 이온수의 균일 한 현탁액으로 균질되었습니다. 다른 10 μl는 별도의 autoclaved 1.5 ML 튜브로 전송 동안 각 모기 섹션에서 다음의 homogenate 중, 10 μl이 유지되었다. 별도의 aliquots는 추출 프로토콜 9,10를 염장 단순화 Chelex하거나 표준에 의해 DNA 추출을 받게되었습니다. 이 DNA 추출 구 동안 단백질 침전 단계에 대한 유해 유기 용제 (예 : 페놀과 클로로포름 등) 대신에 높은 소금 농도를 사용하고 있기 때문에 아웃 소금의 프로토콜은 소위 광범위하게 사용됩니다.
추출물은 arthropod mitochondrial 니코틴 아마이드 아데닌 다이 뉴클레오타이드의 dehydroge을 대상으로 프리 머를 사용하여 PCR 증폭을위한 템플릿으로 사용되었습니다nase (NADH) subunit 4 유전자 (ND4)는 Plasmodium falciparum 감염 (12)의 입력을위한 DNA의 품질 11, 아노펠레스 gambiae의 형제 자매 종 (10)의 식별을위한 PCR과 중첩 된 PCR을 확인합니다. DNA 품질 (ND4)를 사용하여 비교 PCR은 기존의 아웃 소금의 프로토콜에 비해 Chelex 접근 방식 93 %의 민감도와 82 % 특이성을 보여 주었다. 감도 및 특이성의 상응하는 값은 P.에 각각, 형제 자매 종 식별 PCR, 92 %와 80 %를 사용하여 각각 100 %와 78%했다 falciparum 검출 PCR. Chelex 또는 일반은 세 PCR 응용 프로그램에서 프로토콜을 소금과 amplicon 신호를주는 샘플 비율에 큰 차이가 없었다. Chelex 접근 방식은 세 가지 간단한 시약 및 완료 37 분을 요구하면서 밤새 단계를 포함하여 10 가지 시약 및 2 시간, 47 분 '처리 시간을 entailed 프로토콜을 소금. 우리의 결과는 일을 보여Chelex 방법에서 기존 아웃 소금의 추출과 비교하고 일정한 시약 공급 체인은 종종 유지하기 어려운 자원 제한 설정에서 간단하고 지속 가능한 방식으로 대체 할 수 있습니다.
Protocol
1. 모기 표본의 준비 해부
- 현미경을 해부에 parafilm과 마운트의 작은 절단에 장소 모기.
- 조직을 부드럽게하기 위해 탈 이온수의 드롭에서 다룹니다.
- 따라서 복부 섹션에서 머리와 가슴을 nicking, 가슴과 복부 사이의 공동에 정확하게 모기 시체를 절개.
- 모기 ID 번호 세부 사항 및 적절 본문 섹션 (; 머리와 가슴 부분의 "HT"중간 창자 섹션의 예 : "m") 나타 내기 위해 표시와 함께 prelabeled 깨끗한 autoclaved 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 각 해부하는 모기 섹션을 전송합니다.
- parafilm을 취소하고 조심스럽게 옆에 모기을 처리하기 전에 70% 알코올 moistened Kimwipe과 현미경 무대를 닦아냅니다.
2. 모기 표본에서 DNA 추출
- 샘플 튜브 및 해제에 가라 앉아 모기 섹션을 갈기 위해 사용 피펫 팁에 탈 이온수의 피펫 20 μliform 정지.
- autoclaved 1X PBS / 부드러운 순간 vortexing하여 샘플 homogenate 및 혼합 1 %의 사포닌 솔루션 100 μl를 추가합니다.
- 20 분 동안 실온에서 알을 품다.
- 2 분에 20,000 XG에 원심 분리기와 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 100 μl 1X PBS에 Resuspend 펠릿.
- 2 분에 20,000 XG에서 다시 원심 분리기와 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 부드러운 vortexing (5 초), 75 μl 멸균 탈 이온수에 resuspend 펠렛 및 탈 이온수 20 % w / v를 Chelex-100 수지 정지의 25 μl으로.
- 분젠 버너에 골조 멸균 23G 피하 주사기 바늘을 사용하여 샘플 튜브의 뚜껑에 피어스 구멍.
- 10 분에 떠있는 랙에 물 목욕에 넣어 익히지 샘플 중지 (또는 가열 블록에서).
- PCR의 응용 프로그램에서 템플릿으로 사용할 수 prelabeled 스토리지 유리 병에 1 분 및 전송 다음의 DNA 솔루션, 20,000 XG에 원심 분리기.
3. Plasmodium falciparum Genotyping과 아노펠레스종. 분자 식별
- 아노펠레스 종 10 달러를 파악하고 유전자형 P.에, DNA 품질 11을 확인하는 25 μl PCR 반응에 Chelex DNA 추출물 2.5 μl를 추가합니다 falciparum 12 중반 내장과 침샘에 염증.
- 특히 P.에 대한 amplicon 수율을 극대화하려면 falciparum 감지는 PCR 분석에 (BSA) 1.5X 소 혈청 알부민이 포함되어 있습니다. 다음 반응 구성을 권장합니다 : (2.5 μl 템플릿, 0.25 μM 프리 머, 1.5 μM의 염화 마그네슘, 200 μM dNTPs, 1X PCR 버퍼, 1.5X BSA와 1.0U DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소를, 25 μl 권).
- 추출물의 DNA 품질을 확인하려면 arthropod mitochondrial 니코틴 아마이드 아데닌 다이 뉴클레오타이드 탈수소 효소 (NADH) subunit 4 (ND4) 유전자 (프리 머 ND4FW [5'-GTD야만 TTA TGA TTR CCT AA-3 ']와 ND4RV [5'에게의 영역을 증폭 - CTT CGD CTT CCW ADW CGT TC-3 ']; 제품 400bp) 11,13을 기대합니다.
- 아노펠레스 감비아을 차별화하려면전자 SL. 형제 종 (An. gambiae SS와. arabiensis 만), intergenic 스페이서 (IGS) 지역, (에 SNPs 측면을 노릴 지역을 증폭 프리 머 UN [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT - 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3'], 제품 390bp에게 gambiae SS, 315bp arabiensis) 10,11을 기대합니다.
- 입력 P.에 대한 falciparum antifolate의 약물 저항 polymorphisms은 아미노산 codons 108, 51, 59, 기생충 dihydrofolate 환원 효소 (DHFR) 유전자 16 164 측면을 노릴 지역을 확대하려면 중첩 PCR을 수행 :
기본 원형 프리 머 : M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 ']와 M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
차 라운드 프리 머 : M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] F /과 [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
또는
F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] M4는 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
또한 아미노산 codons 436, 437, 540, 581를 포함하는 지역을 증폭P.의 차 613 falciparum dihydropteroate의 synthetase (DHPS) 유전자 :
기본 원형 프리 머 R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] R /과 [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
차 라운드 프리 머
J : [5'- 'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']와
또는
K : K /과 [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '],
또는
L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] L과 / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] 12. - 제조업체의 지침에 따라 30 μl 반응의 allele 특정 제한 효소 digestions,에 따라 4 μl amplicon은 antifolate 약물 저항 - 관련 polymorphisms 12을 감지합니다.
- 제목 5 전기에 ethidium 브로마이드 - 스테인드 2퍼센트 아가로 오스 겔 (100 - 120V)의 차선 당 PCR amplicon (또는 제한 다이제스트의 15 μl)의 μl하고 UV transillumination에서 대역을 표시합니다.
Representative Results
모기 DNA 추출물 품질에 대한 PCR assays (그림 1), 아노펠레스의 arabiensis 분자 식별 (그림 2)와 P. 결과의 예 단순화 Chelex 방법이 훨씬 적은 단계 (표 1)에도 불구하고, 프로토콜 10을 소금 표준에 유사한 결과가 산출되는 것으로 falciparum 탐지 (그림 3)를 보여줍니다. 각각의 추출물에 비해 DNA의 품질은 놀라운 일이 아니다 그와 관련하여 샘플 긍정적 인 요금. gambiae의 형제 종뿐만 아니라 기생충 감염 요금은 McNemar의 치 평방 테스트 (그림 3)에 따라 통계적으로 차이가 없었다.
감도 (%)는로 계산 TP / (TP + FN) TP 사실 탐지를 나타냅니다과 FN 거짓 제외를 나타냅니다 * 100. 특이성 (%)가 TN /로 결정했습니다 (TN + FP) TN 사실 제외 나타냅니다과 FP 거짓 탐지를 나타냅니다 * 100. DNA 품질 (ND4) PCR은 설립으로 프로토콜을 소금의 황금 표준에 비해 Chelex 접근 방식 93 %의 민감도와 82 % 특이성을 보여 주었다. 감도 및 특이성의 상응하는 값은 P.에 각각, 형제 자매 종 식별 PCR, 92 %와 80 %를 사용하여 각각 100 %와 78%했다 falciparum 검출 PCR.
반응 혼합물에 BSA의 추가 프로토콜을 소금 간소화 Chelex과 정기적 모두, 때문에 PCR 저해제 (14)의 구조에 대한 PCR의 반응에 대한 일반적인 증가 (그림 3)에되었습니다. 그러나,이 증가는 Chelex 추출물 (P = 0.039)에 DNA 품질 (ND4 PCR)을 제외하고는 통계적으로 의미가 아니 었습니다. P.의 Allele 특정 제한 효소 소화 falciparum DHFR (또는 다른 대상 유전자) amplicon 약물 저항 대립 유전자 (; 침샘에 데이터가 표시되지 그림 4) 중간 창자와 침샘에 말라리아 감염의 genotyping 수 있습니다.
| 간단한 Chelex 절차 | 표준 절차를 염장 | ||
| 단계 | 시약 | 단계 | 시약 |
| PBS
Chelex-100 구슬 |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)
8 M의 칼륨 아세테이트 에탄올 0.1X 식염 나트륨 구연산 (SSC) 버퍼 RNAse (10 μg / ML) |
| 총 소요 시간 : 37 분 | 총 소요 시간 : 2 시간 47 분, 플러스 하루 아침에 | ||
표 1. 간단한 Chelex 프로토콜에 대한 시약 및 시간 요구 사항 단계 비교에 의해 단계 서ARD는 모기 표본에서 DNA 추출을위한 방법을 소금.
그림 1. ND4 mitochondrial PCR의 단순화 Chelex "C"에서 DNA 품질의 비교 및 아노펠레스의 arabiensis 필드 샘플에 "M"추출물을 소금의 표준입니다. NC, 음성 제어, M1 및 C1, M2와 C2, M3 및 C3, 그리고 M4와 C4는 아웃 소금과 같은에서 Chelex 추출 짝입니다. arabiensis의 모기 표본. L, 100 BP의 DNA 사다리.
그림 2 아노펠레스의 arabiensis에 대한 분자 식별 PCR C1과 M1, C2 및 M2, C3와 M3, C4와 M4는 "M"을 소금과 같은 모기 표본에 대한 Chelex "C"DNA 추출물을 단순화에서 각각의 amplicon을 표시,.. AR, 아노펠레스 arabiensis긍정적 인 제어, L, 100 BP의 DNA 사다리.
그림 3. Chelex과 아노펠레스 arabiensis (AR) 10, arthropod NADH 탈수소 효소 유전자 4 (ND4) DNA 품질 테스트 11, 및 antifolate 약물 저항 P의 분자 식별 PCR assays와 함께 모기 필드 샘플에 대한 DNA 추출물을 소금에 탐지 검색 . falciparum DHFR genotyping 12 (F-M4). 반응 믹스에 BSA와 함께 또는없이 실행 assays에 대한 결과가 표시됩니다. McNemar의 치 평방 테스트는 DNA로부터 긍정적 인 PCRs의 비율의 차이는 간단 Chelex에서 추출 및 프로토콜을 소금 표준 통계적으로 의미가 있었다 여부를 결정하는 데 사용되었다.
Discussion
여기에 제시된 단순화 Chelex 방법은 품질 아노펠레스 균과 P.의 추출을 가능하게 다양한 PCR 응용 프로그램에 복종 할 의무가있는 모기 표본에서 falciparum의 DNA. 이 기술은 약제 내성 P.의 분자 말라리아 벡터 모기의 식별 및 감시를 위해 고용 수 있습니다 국가 말라리아 통제 프로그램에 대한 모기의 falciparum 대립 유전자. 단순화 Chelex 기술의 장점은 단순성, 적은 시약 및 따라서 비용, 안전 및 방법 (10) 아웃 소금 (2 시간 47 분, 야간 단계, 표 1)과 같은 표준 프로토콜보다 짧은 처리 시간을 (37 분) 등이 있습니다. 앞서 언급 한 장점과 최소한의 시약 요구 사항 (3 시약)은 현재의 표준 프로토콜 (10 시약, 표 1) 11,15에 비해, 일정한 시약 발병 국가 연구소로 단순화 Chelex 프로토콜은 특히 쉽게 만들공급 체인은 종종 유지하기가 어렵습니다. 방법의 한계는 표준 프로토콜처럼, 또한 모기 외피 16가 발생하는 것으로 알려져 PCR 억제제에 따라이라고합니다. 그러나, 이것은 쉽게 assays에 BSA를 포함하여 안심입니다. BSA는 성공적으로 다른 PCR 응용 프로그램 17,18의 억제제에 대한 증폭 증강으로 채용되었습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자 족장, headmen와 모기 필드 샘플 컬렉션 중 협력의 unwaveing에 대한 마챠의 지역 사회에 빚을 졌네. 박사 덕 노리스과 리브가 켄트에서 소금의 프로토콜에 귀중한 전문 지식을 제공했습니다. 이 작품은 존스 홉킨스의 말라리아 연구소 파일럿 보조금 시스템에 의해 재정 지원되었다. 모기와 기생충 DNA 실험실 기준은 친절 MR4, 미국 유형 및 문화 컬렉션에 의해 기부되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
| Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
| BSA | New England Biolabs | B9001S |
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