Summary
Быстрый и доступный способ извлечения паразита малярии качества и векторной ДНК из образцов комаров описано. Опираясь на свойства хелатирующие смолы Chelex, простой метод позволяет генотипирования малярийных паразитов в комара средней кишки и слюнных желез фаз, а также молекулярная идентификация
Protocol
1. Подготовительные Препарирование Mosquito Образцы
- Место комаров на небольшой резке парафильмом и крепление на рассекает микроскопом.
- Крышка в капле деионизированной водой, чтобы смягчить ткань.
- Надрезать комаров туши именно в стык между грудной клеткой и животом, таким образом, никующие от головы и грудной клетки от брюшной части.
- Передача каждого расчлененный комаров раздел в чистую автоклаве 1,5 мл микроцентрифужных трубки prelabeled с москитной ID номер детали и соответствующие указатели для обозначения секции кузова (например, «М» для средней кишки разделе; "HT" для головы и грудной клетки разделе).
- Откажитесь парафильмом и тщательно протрите столик микроскопа с 70% алкоголя, смоченной Kimwipe перед обработкой следующего комаров.
2. Экстракции ДНК из образцов Mosquito
- Внесите 20 мкл деионизированной воды в трубку образца и использование пипетки для измельчения подводных комаров раздел в ООНiform подвески.
- Добавить 100 мкл из автоклавного 1X PBS / 1% сапонина решение гомогената образца и микс от нежного мгновенного встряхиванием.
- Выдержите при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Центрифуга при 20000 х г в течение 2 минут и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют осадок в 100 мкл 1X PBS.
- Центрифуга раз при 20000 х г в течение 2 минут и отбросить супернатант.
- По нежным встряхивания (5 сек), ресуспендируют осадок в 75 мкл стерильной деионизированной воды и 25 мкл 20% вес / объем Chelex-100 смола подвеска в деионизированной воде.
- Пирс отверстие в крышке пробирки с использованием стерильной иглой 23G подкожных вспыхнул в горелку.
- Кипятите образец подвески на водяной бане с плавающей стойки (или в нагревательный блок) в течение 10 мин.
- Центрифуга на 20000 мкг, в течение 1 мин и передачи последующие раствор ДНК в prelabeled флаконе хранение для использования в качестве шаблона в приложениях ПЦР.
3. Plasmodium тропической генотипирования и AnophelesSPP. Молекулярная идентификация
- Добавить 2,5 мкл экстракта ДНК Chelex в 25 мкл реакции ПЦР, чтобы проверить качество ДНК 11, выявлению видов Anopheles 10 и генотип P. 12 тропической средней кишки и слюнных желез инфекций.
- Чтобы максимизировать доходность ампликона, особенно для P. тропической обнаружения, включают 1.5X бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ПЦР. Следующие реакционной смеси рекомендуется: (2,5 мкл шаблон, 0,25 мкМ праймера, 1,5 мкМ хлорида магния, 200 мкМ дНТФ, 1X ПЦР буфера, 1,5 BSA и 1.0U Taq ДНК-полимеразы, в 25 мкл объема).
- Чтобы проверить качество ДНК в экстракте, усиливать области членистоногих митохондриальной дегидрогеназы никотинамид-аденин-динуклеотид (NADH) субъединицы 4 (ND4) гена (праймеры ND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR CCT AA-3 '] и ND4RV [5' СТТ-CGD СТТ против часовой стрелки ADW CGT TC-3 ']; ожидать продукта 400bp) 11,13.
- Чтобы отличить Anopheles Гамбииэлектронной SL. видов-двойников (an. gambiae СС и. arabiensis только), усиливают области фланговые SNPs в межгенные прокладку (IGS) области, (праймеры ООН [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; ожидать продукта 390bp gambiae сс, 315bp arabiensis) 10,11.
- Для набора P. тропической антифолат полиморфизмов лекарственной устойчивостью, выполнить ПЦР для амплификации области фланговые аминокислотных кодонов 108, 51, 59, 16 и 164 в паразита дигидрофолатредуктазы (DHFR) генов:
Первичный праймеры тура: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] и M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
Вторичный круглый праймеров: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] с F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
Или
F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] с M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
Также усиливаются области, содержащей аминокислотных кодонов 436, 437, 540, 581м 613 в P. тропической дигидроптероатсинтазы синтетазы (ДГП) генов:
Первичный круглый праймеры R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] с R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
Вторичный круглый праймеры
J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] с K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']
Или
K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] с K /,
Или
L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] с L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3 »] 12. - Тема 4 мкл ампликонов в аллель-специфических ферментов рестрикции пищеварения в 30 мкл реакции в соответствии с инструкциями завода-изготовителя, для обнаружения наркотиков антифолат, связанные с резистентностью полиморфизм 12.
- Тема 5 мкл ПЦР ампликона (или 15 мкл ограничение дайджест) на полосу бромистого этидия окрашенных 2% агарозном геле для электрофореза (100 - 120В) и визуализации полос в УФ-просвечивания.
Representative Results
Примеры результатов ПЦР для комаров качество экстракта ДНК (рис. 1), Anopheles arabiensis молекулярной идентификации (рис. 2) и P. тропической обнаружения (рис. 3) показывает, что упрощенный метод Chelex дает аналогичные результаты в стандартный протокол высаливания 10, несмотря на гораздо меньшее число шагов (табл. 1). При сопоставимом качестве ДНК в соответствующие выдержки это не удивительно, что положительный пример цены по отношению к. gambiae видов-двойников, а также цены паразитарной инфекции не были статистически отличаться в зависимости от теста хи-квадрат McNemar (Рисунок 3).
Чувствительность (%) рассчитывали как TP / (TP + FN) * 100, где TP означает истинно положительных и FN обозначает ложные негативы. Специфичность (%) была определена как TN / (TN + FP) * 100, где TN обозначает истинную негативов и FP обозначает ложных срабатываний. ДНК качества (ND4) ПЦР показал 93% чувствительность и 82% специфичность для Chelex подхода по сравнению с установленными высаливания протокол как золотой стандарт. Соответствующие значения чувствительность и специфичность составили 100% и 78%, соответственно, с использованием идентификации видов-двойников ПЦР и 92% и 80%, соответственно, для P. тропической обнаружения ПЦР.
Кроме того БСА в реакционной смеси в результате общего увеличения положительных ПЦР (рис. 3) в связи с рельефом ПЦР ингибиторов 14, как для упрощенного Chelex и регулярно высаливания протокол. Однако это увеличение не было статистически значимым, за исключением ДНК качества (ND4 ПЦР) на Chelex экстракты (р = 0,039). Аллель конкретные ограничения ферментативного расщепления на P. тропической DHFR (или другого гена-мишени) ампликона позволяет генотипирования средней кишки и слюнных желез заболевания малярией лекарственной устойчивости аллели (рис. 4; слюнных желез данные не показаны).
| Простая процедура Chelex | Стандартная процедура высаливания | ||
| Шаги | Реагенты | Шаги | Реагенты |
| PBS
Chelex-100 бусин |
| Диэтилпирокарбонатом (DEPC)
8 М ацетата калия Этанол 0,1 X Saline цитрат натрия (SSC) буфера РНКазы (10 мкг / мл) |
| Общее время: 37 мин | Общее время звучания: 2 часа 47 мин, плюс ночь | ||
Таблица 1. Шаг за шагом сравнению реагентов и времени требования к простой протокол Chelex и стоятьARD высаливания метод для выделения ДНК из образцов комаров.
Рисунок 1. ND4 ПЦР митохондриальной ДНК сравнения качества от упрощенной Chelex "C" и стандартный высаливания "M" экстрактов образцов Anopheles arabiensis поле. NC, отрицательный контроль; M1 и C1, C2 и M2, M3 и C3, и M4 и C4 в паре высаливания и Chelex выдержки из той же. Образцы arabiensis комаров. L, 100 б.п. ДНК лестнице.
Рисунок 2 Молекулярная идентификация ПЦР для arabiensis Anopheles C1 и M1, M2 и C2, C3 и M3, M4 и C4 обозначают соответствующие ампликона от высаливания "М" и упрощенного Chelex "C" ДНК экстракты для тех же образцов комаров;.. AR, Anopheles arabiensisПоложительный контроль, L, 100 б.п. ДНК лестнице.
Рисунок 3. Обнаружение срабатываний на Chelex и высаливания ДНК экстракты для комаров образцы поля, с ПЦР для молекулярной идентификации Anopheles arabiensis (AR) 10, членистоногих NADH дегидрогеназы ген 4 (ND4) ДНК-тест качества 11 и антифолат P лекарственной устойчивостью . тропической DHFR генотипирования 12 (F-M4). Результаты показали анализы для запуска с или без BSA в реакционной смеси. Хи-квадрат McNemar был использован для определения различий между процентом положительных ПЦР с ДНК, выделенной из упрощенной Chelex и стандартные высаливания протоколы были статистически значимыми.
Discussion
Упрощенный метод Chelex представленные здесь позволяет добыче качества Anopheles SPP и P. тропической ДНК из образцов комаров поддаются разнообразных приложений ПЦР. Эта техника может быть использована для молекулярной идентификации комаров переносчиком малярии и наблюдение за лекарственной устойчивостью P. аллелей в тропической комаров для национальных программ борьбы с малярией. Преимущества упрощенной техникой Chelex включают простоту, меньше реагентов и, следовательно, стоимости, безопасности и короче время обработки (37 мин), чем стандартные протоколы, такие как метод высаливания 10 (2 ч 47 мин и в течение ночи шага, таблица 1). Указанные преимущества и минимальные требования реагента (3 реагентов) по сравнению с текущим стандартным протоколом (10 реагентов, таблица 1) 11,15, сделать упрощенные Chelex протокола особенно дружелюбны к эндемичным лабораториях страны, где постоянно реагентовцепочками поставок часто трудно поддерживать. Ограничение метода является то, что, как стандартный протокол, это было также подлежат ПЦР ингибиторов известно, происходят в организме комара покрова 16. Тем не менее, это легко освобождается от включения BSA в анализах. BSA также успешно использоваться в качестве усиления усилителя с ингибиторами в других приложениях ПЦР 17,18.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность начальников, старост и общин Macha для их unwaveing сотрудничают во комаров коллекции образцов поле. Доктор Дуг Норрис и Ревекка Kent предлагается бесценный опыт на высаливания протокол. Эта работа финансировалась по борьбе с малярией Johns Hopkins научно-исследовательский институт экспериментальной системы грантов. Комар и паразитов ДНК-лаборатория стандартов, любезно подаренных MR4, американский тип и культуры Collection.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
| Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
| BSA | New England Biolabs | B9001S |
References
- Bonnet, M., et al. Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore. Malar. J. 6, 54 (2007).
- Nsimba, B., et al. Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy. Malar. J. 7, 31 (2008).
- Oyewole, I. O., et al. Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria. J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).
- Harris, I., et al. A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting. Malar. J. . 9, 254 (2010).
- Ouedraogo, A. L., et al. Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission. PLoS ONE. 4, e8410 (2009).
- Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery. Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).
- Ishengoma, D. R., et al. Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases. Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).
- Alonso, P. L., et al. A research agenda for malaria eradication: vector control. PLoS Med. 8, e1000401 (2011).
- Grimberg, J., et al. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 17, 8390 (1989).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion. Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).
- Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).
- Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).
- Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).
- Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes. Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).
- Al-Soud, W. A., Radstrom, P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR. J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).
