Summary
Una forma rápida y asequible para extraer parásito calidad malaria y ADN del vector a partir de muestras de mosquitos se describe. Capitalizando en las propiedades quelantes de resina Chelex, el simple método permite el genotipado de parásitos de la malaria en mosquitos fases glándula del intestino medio y salivales, así como la identificación molecular de los
Abstract
Los países endémicos están adoptando cada vez más herramientas moleculares para la tipificación eficiente, identificación y vigilancia contra parásitos de la malaria y los mosquitos vectores, como parte integral de sus programas de control de 1,2,3,4,5. Para el establecimiento sostenible de estos enfoques precisos en las operaciones de investigación para fortalecer el control de la malaria y los esfuerzos de eliminación, métodos sencillos y asequibles, con el reactivo parsimonioso y requerimientos de equipo son esenciales 6,7,8. Aquí les presentamos una sencilla técnica basada en Chelex para la extracción de parásito de la malaria y el ADN vector de muestras de campo mosquitos recolectados.
Hemos identificado morfológicamente 72 Anopheles gambiae sl. Desde 156 mosquitos capturados por piretro spray de capturas en los dormitorios de los hogares dentro de 2.000 km 2 cerca del Instituto de Malaria en Macha. Después de la disección para separar la cabeza y el tórax del abdomen para todos los gam 72 AnophelesBIAE sl. mosquitos, las dos secciones se colocaron individualmente en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga y se sumergieron en 20 l de agua desionizada. Utilizando una punta de pipeta estéril, cada sección de mosquito se homogeneizó por separado a una suspensión uniforme en el agua desionizada. Del homogeneizado resultante de cada sección de mosquito, 10 l se retuvo mientras que el otro 10 l se transfirió a un tubo esterilizado en autoclave por separado 1,5 ml. Las alícuotas separadas se sometieron a extracción de ADN ya sea por el Chelex simplificado estándar o la salazón a cabo la extracción protocolo de 9,10. El protocolo de salificación es llamado y utilizado ampliamente debido a que emplea altas concentraciones de sal en lugar de disolventes orgánicos peligrosos (tales como fenol y cloroformo) para la etapa de precipitación de la proteína durante la extracción de ADN 9.
Los extractos fueron utilizados como plantillas para la amplificación por PCR usando cebadores dirigidos artrópodo deshidrogenasa mitocondrial nicotinamida adenina dinucleótidonase (NADH) subunidad gen 4 (ND4) para comprobar la calidad del ADN 11, una PCR para la identificación de las especies de Anopheles gambiae hermanos de 10 y una PCR anidada para la tipificación de infección por Plasmodium falciparum 12. La comparación con la calidad del ADN (ND4) PCR mostró 93% de sensibilidad y 82% especificidad para el enfoque Chelex en relación con lo establecido desalado protocolo. Los valores correspondientes de sensibilidad y especificidad fueron del 100% y 78%, respectivamente, utilizando hermano de identificación de especies PCR y 92% y 80%, respectivamente, para P. falciparum detección por PCR. No hubo diferencias significativas en la proporción de muestras en las que la señal de amplicón con el Chelex o el desplazamiento salino normal protocolo en las tres aplicaciones de la PCR. El enfoque Chelex requiere tres reactivos simples y 37 min en completarse, mientras que el. Desalado protocolo implicó 10 diferentes reactivos y 2 h 47 min y el tiempo de «tratamiento, incluyendo una etapa durante la noche Nuestros resultados muestran then el método de Chelex es comparable a la existente salazón a cabo la extracción y pueden estar sustituidos como un enfoque sencillo y sostenible en entornos con recursos limitados donde una cadena de suministro constante reactivo a menudo es difícil de mantener.
Protocol
1. Disección Preparatoria de muestras de mosquitos
- Lugar de mosquito en un pequeño corte de parafina y de montaje en microscopio de disección.
- Cubrir en gota de agua desionizada para ablandar el tejido.
- Incisión de la carcasa mosquito precisamente en la unión entre el tórax y el abdomen, por lo tanto mellar la cabeza y el tórax de la sección abdominal.
- Transfiera cada sección mosquitos disecados en un lugar limpio autoclave 1,5 ml tubo de microcentrífuga prelabeled con mosquitos detalles de identificación de números y debidamente marcados para indicar la sección del cuerpo (por ejemplo, "m" para mediados de intestino sección; "ht" para la cabeza y el tórax sección).
- Deseche parafilm y limpie cuidadosamente platina del microscopio con un 70% de alcohol humedecido Kimwipe antes de procesar el siguiente mosquito.
2. Extracción de ADN a partir de muestras de mosquitos
- Pipetear 20 l de agua desionizada en un tubo de muestra y la punta de pipeta de uso para moler la sección de mosquito sumergido en una ONUsuspensión iform.
- Añadir 100 l de autoclave 1X PBS / 1% de solución de saponina al homogeneizado de la muestra y mezclar mediante agitación suave momentánea.
- Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
- Centrifugar a 20.000 xg durante 2 min y desechar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento en 100 l de 1X PBS.
- Centrifugar de nuevo a 20.000 xg durante 2 min y desechar el sobrenadante.
- Por agitación suave (5 segundos), se resuspende el precipitado en 75 l de agua desionizada estéril y 25 l de w / v 20% de suspensión de resina Chelex-100 en agua desionizada.
- Pierce agujero en la tapa del tubo de muestra con aguja hipodérmica estéril 23G flameado en el quemador Bunsen.
- Hervir suspensión de la muestra en un baño de agua sobre una rejilla flotante (o en bloque de calentamiento) durante 10 min.
- Centrifugar a 20.000 xg, durante 1 min y la transferencia subsiguiente solución de ADN en el vial de almacenamiento prelabeled para su uso como plantilla en aplicaciones de la PCR.
3. La genotipificación Plasmodium falciparum y Anophelesspp. Identificación molecular
- Añadir 2,5 l de extracto de ADN Chelex en 25 mu l reacciones de PCR para comprobar la calidad del ADN 11, identificar las especies de Anopheles 10 y el genotipo P. falciparum 12 del intestino medio y salival infecciones de la glándula.
- Para maximizar el rendimiento del amplicón, especialmente para P. detección falciparum, 1,5 X incluyen albúmina de suero bovino (BSA) en el ensayo de PCR. La composición de reacción se recomienda la siguiente: (2,5 l plantilla, 0,25 cebadores mu M, cloruro de magnesio 1,5 mM, dNTPs 200 mu M, 1X tampón de PCR, BSA 1,5 X y 1.0U Taq ADN polimerasa, en 25 volúmenes mu l).
- Para comprobar la calidad del ADN en extracto, amplificar la región de la deshidrogenasa mitocondrial de artrópodos dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH) subunidad 4 (ND4) gen (ND4FW cebadores [5'-GTD YAT TTA TGA CCT TTR AA-3 '] y ND4RV [5' -CTT CTT CAC EGC ADW CGT TC-3 ']; esperan que el producto 400 pb) 11,13.
- Para diferenciar Anopheles gambiae sl. especies hermanas (An. gambiae ss y An. arabiensis. solamente), amplificar región de acompañamiento SNPs en el espaciadoras intergénicas (IGS) región (primers de la ONU [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; esperar 390bp productos An. SS gambiae, 315bp An. arabiensis) 10,11.
- Para escribir P. falciparum antifolato polimorfismos de resistencia a fármacos, realizar la PCR anidada para amplificar la región flanqueante codones de aminoácidos 108, 51, 59, 16 y 164 en la dihidrofolato reductasa parásito (DHFR):
Cebadores primarios redondas: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] y M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
Secondary cebadores redondas: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] con F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
O
F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] con M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
También amplificar la región que contiene los codones de aminoácidos 436, 437, 540, 581 aº 613 en la P. falciparum dihidropteroato sintetasa (DHPS) de genes:
Primaria ronda primers R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] con R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
Secundaria primers redondo
J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] con K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']
O
K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] con K /,
O
L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] con L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] 12. - Tema 4 amplicón l a alelo-específicos digestiones de enzimas de restricción en 30 reacciones mu l siguiendo las instrucciones del fabricante, para detectar fármacos antifolato asociadas a la resistencia 12 polimorfismos.
- Tema 5 l de amplificación de PCR (o 15 l de digestión de restricción) por carril de etidio teñido con bromuro de 2% en gel de agarosa para electroforesis (100 - 120V) y visualizar las bandas con transiluminación UV.
Representative Results
Los ejemplos de los resultados de los ensayos de PCR para la calidad del mosquito extracto de ADN (Figura 1), Anopheles arabiensis identificación molecular (Figura 2) y P. falciparum de detección (Figura 3) muestran que el método de Chelex simplificado produce resultados similares a la norma salificación protocolo 10, a pesar de los pasos mucho menos (Tabla 1). Con una calidad de ADN comparable en los extractos respectivos, no es sorprendente que las tasas de muestra positividad con respecto a una. gambiae especies de hermanos, así como las tasas de infección por el parásito no fue estadísticamente diferente en función de chi-cuadrado de McNemar prueba (Figura 3).
Sensibilidad (%) se calculó como TP / (TP + FN) * 100, donde TP indica verdaderos positivos y falsos negativos FN marca. Especificidad (%) se determinó como TN / (TN + FP) * 100, donde TN indica un resultado negativo y FP denota falsos positivos. La calidad del ADN (ND4) PCR mostró 93% de sensibilidad y 82% especificidad para el enfoque Chelex en comparación con el protocolo establecido desalado como estándar de oro. Los valores correspondientes de sensibilidad y especificidad fueron del 100% y 78%, respectivamente, utilizando hermano de identificación de especies PCR y 92% y 80%, respectivamente, para P. falciparum detección por PCR.
La adición de BSA a las mezclas de reacción dio como resultado un aumento general de positivos de PCR (Figura 3) debido al alivio de los inhibidores de la PCR 14, tanto para el Chelex simplificado y regular salificación protocolo. Sin embargo, este aumento no fue estadísticamente significativo, excepto para la calidad del ADN (PCR ND4) en extractos de Chelex (p = 0,039). El alelo-específica restricción de la digestión enzimática de la P. falciparum DHFR (o gen diana otro) amplicón permite el genotipado de las infecciones de malaria del intestino medio y de las glándulas salivales para los alelos de resistencia a fármacos (Figura 4, los datos de las glándulas salivales no se muestra).
| Procedimiento simple Chelex | Estándar Ensanchamiento Procedimiento | ||
| Pasos | Reactivos | Pasos | Reactivos |
| PBS
Chelex-100 perlas |
| Dietilpirocarbonato (DEPC)
8 M de acetato de potasio Etanol 0,1 X citrato salino sódico (SSC) de amortiguación RNAsa (10 mg / ml) |
| TIEMPO TOTAL: 37 min | Tiempo total: 2 horas 47 minutos, y durante la noche | ||
Tabla 1. Paso a paso comparación de los reactivos y el tiempo requerido para el protocolo Chelex simple y soportarard desalado método de extracción de ADN a partir de muestras de mosquitos.
Figura 1. ND4 mitocondrial PCR comparación de la calidad del ADN de Chelex simplificado "C" y estándar de precipitación salina "M" extractos de las muestras de Anopheles arabiensis de campo. NC, control negativo; M1 y C1, C2 y M2, M3 y C3, y C4 y M4 están emparejados desalado y extractos Chelex de un mismo. especímenes arabiensis mosquitos. L, escalera de 100 pb de ADN.
Figura 2 Molecular PCR para la identificación Anopheles arabiensis C1 y M1, M2 y C2, C3 y M3, M4 y C4 denotar amplicón correspondiente de la salazón a cabo "M" y simplificado Chelex "C" extractos de ADN de las muestras de mosquitos mismos;.. AR, Anopheles arabiensiscontrol positivo, L, escalera de 100 pb de ADN.
Figura 3. Detección de positivos en Chelex y desalado extractos de ADN de muestras de campo de mosquitos, con los ensayos de PCR para la identificación molecular de Anopheles arabiensis (AR) 10, artrópodos genes NADH deshidrogenasa 4 (ND4) Prueba de ADN de calidad 11, y P antifolato resistencia a los medicamentos . falciparum DHFR genotipado 12 (F-M4). Los resultados mostrados para los ensayos se ejecutan con o sin BSA en la mezcla de reacción. Chi-cuadrado de McNemar se utilizó la prueba para determinar si las diferencias entre ciento de PCR positiva de ADN extraído de la Chelex simplificado y el estándar de precipitación salina protocolos fueron estadísticamente significativas.
Discussion
El método de Chelex simplificada presentada aquí permite la extracción de la calidad Anopheles spp y P. falciparum ADN de las muestras de mosquitos susceptibles de diversas aplicaciones de la PCR. Esta técnica se puede emplear para la identificación molecular de los mosquitos vectores de la malaria y la vigilancia de resistente a los medicamentos P. alelos falciparum en los mosquitos para los programas nacionales de control de la malaria. Las ventajas de la técnica de Chelex simplificado incluyen la simplicidad, menos reactivos y, por tanto costo, seguridad y tiempo de procesamiento más corto (37 min) que los protocolos estándar tales como el método de precipitación salina 10 (2 hr 47 min y una etapa durante la noche, Tabla 1). Las ventajas antes mencionadas y los requisitos mínimos de reactivo (3 reactivos) en comparación con el actual protocolo estándar (10 reactivos, Tabla 1) 11,15, que el protocolo Chelex simplificado particularmente amigable para los laboratorios del país endémicas donde un reactivo constantecadena de suministro es a menudo difícil de mantener. Una limitación de este método es que como el protocolo estándar, que fue también objeto de inhibidores de la PCR sabe que se producen en el integumento mosquito 16. Sin embargo, esto es fácilmente aliviado por la inclusión de BSA en los ensayos. BSA también se ha empleado con éxito como un potenciador de la amplificación en contra de inhibidores en otras aplicaciones de la PCR 17,18.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores están en deuda con los jefes, jefes y comunidades de Macha para su unwaveing cooperar durante los mosquitos colecciones de campo de muestra. Dr. Doug Kent Norris y Rebeca ofreció invaluable experiencia en el protocolo de desalado. Este trabajo fue financiado por la Universidad Johns Hopkins Malaria Research Institute sistema piloto de subvención. Mosquitos y parásitos patrones de ADN de laboratorio fueron donados amablemente por MR4, American Type Culture Collection y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
| Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
| BSA | New England Biolabs | B9001S |
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