Summary
Sivrisinek örneklerden kalitesi sıtma parazit ve vektör DNA ayıklamak için bir hızlı ve ekonomik bir şekilde açıklanmıştır. Basit bir yöntem sivrisinek orta bağırsak ve tükürük bezi aşamalarında sıtma parazitlerinin genotipleme yanı sıra moleküler tanımlanması, Chelex reçine çelatlama özelliklerine etkinleştirir sermaye
Abstract
Endemik ülkede giderek kontrol programlarının 1,2,3,4,5 ayrılmaz bir parçası olarak, verimli yazarak, tanımlama ve sıtma parazitleri ve vektör sivrisineklere karşı gözetim için moleküler araçlar benimsiyor. Işlemleri bu doğru yaklaşımların sürdürülebilir kurulması için sıtma ve hasis reaktif ve ekipman ihtiyaçları ile eleme çabaları, basit ve ekonomik yöntem, güçlendirmek için araştırma 6,7,8 gereklidir. Burada alanda toplanan sivrisinek örneklerden sıtma parazit ve vektör DNA ayıklamak için basit bir Chelex tabanlı tekniğinin sunulması.
Biz morfolojik 72 Anofel gambiae sl belirlenmiştir. Piretrum sprey Macha de Sıtma Enstitüsü 2.000 km 2 civarı içinde evlerin odalarında uyku yakalar tarafından yakalanan 156 sivrisinek. Diseksiyonu 72 Anofel gam için karından baş ve toraks ayırmak için sonrabiae sl. sivrisinekler, iki ayrı bölümden 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirilir ve deiyonize su içinde 20 ul batık edildi. Steril bir pipet ucu kullanarak, her bölüm ayrı ayrı sivrisinek deiyonize su içinde homojen bir süspansiyon ile homojenize edildi. 10 ul başka bir ayrı otoklavlanmış 1.5 ml tüpüne nakledilir iken her bir sivrisinek bölümünden sonraki Homojenat, 10 ul muhafaza edildi. Ayrı alikotları ekstraksiyon protokolü 9,10 salting out basitleştirilmiş Chelex veya standart ya tarafından DNA ekstraksiyonu tabi tutuldu. Bu DNA ekstraksiyon 9 sırasında protein çökeltme adımı için zararlı organik çözücüler (örneğin, fenol ve kloroform gibi) yerine yüksek tuz konsantrasyonları kullanır çünkü dışarı tuzlama protokol olarak adlandırılan ve yaygın olarak kullanılmaktadır.
Özler eklembacaklı mitokondriyal nikotinamid adenin dinükleotid dehidrojenaz hedefleme primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu için şablon olarak kullanıldıKaraburun (NADH) altbirim 4 gen (ND4) Plasmodium falciparum enfeksiyonu 12 yazmak için DNA kalitesi 11, Anofel gambiae türler 10 tespiti için PCR ve nested PCR kontrol etmek. DNA kalitesi (ND4) kullanarak Karşılaştırma PCR kurulan dışarı tuzlama protokolü göreli Chelex yaklaşım için% 93 duyarlılık ve% 82 özgüllük gösterdi. Duyarlılık ve özgüllük Sorumlu değerleri P. için sırasıyla, türler tanımlama PCR ve% 92 ve% 80 ile, sırasıyla,% 100 ve% 78 idi falciparum tespiti PCR. Chelex veya düzenli her üç PCR uygulamalarında protokolü üzerinden tuzlama ile Amplikon sinyal vererek örneklerin oranları arasında anlamlı farklılık saptanmadı. Chelex yaklaşım üç basit reaktifler ve tamamlamak için 37 dakika gerekli iken bir gecede adım dahil, 10 farklı reaktifler ve 2 saat ve 47 dk 'işlem süresi gerektirdiği protokol üzerinde tuzlama. Bizim sonuçlarımız th gösterChelex yöntem de mevcut tuzlama dışarı çıkarma ile karşılaştırılabilir ve sabit bir reaktif tedarik zinciri çoğu kez muhafaza edilmesi güçtür kaynak sınırlı olduğu ortam içinde basit ve sürdürülebilir bir yaklaşım olarak ikame edilebilir.
Protocol
1. Sivrisinek Örneklerinin Hazırlık Diseksiyon
- Mikroskop diseksiyon üzerine parafilm ve montaj küçük bir kesim üzerinde yer sivrisinek.
- Doku yumuşatmak için deiyonize su damla kaplayın.
- Böylece karın kısmından baş ve toraks kapalı nicking, toraks ve abdomen arasındaki eklem tam sivrisinek karkas kesilirken.
- Sivrisinek kimlik numarası bilgilerini ve uygun gövde bölümünde (; kafa ve göğüs bölümü için "ht" mid-gut bölüm için örnek: "m") belirtmek için işaretlenmiş olan prelabeled temiz otoklava 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içine her disseke sivrisinek bölüm aktarın.
- Parafilm atın ve dikkatlice sonraki sivrisinek işlemeden önce% 70 alkol nemlendirilmiş Kimwipe ile mikroskop sahne silin.
2. Sivrisinek örneklerden DNA Ekstraksiyonu
- Örnek tüpü ve bir un içine daldırılmış sivrisinek bölümüne öğütmek için kullanıma pipet içine deiyonize su Pipet 20 uliform süspansiyon.
- Otoklavlanmış 1X PBS / nazik anlık vorteks tarafından numune Homojenat ve karıştırmak için 1% saponin çözeltisinden 100 ul ekleyin.
- 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- 2 dakika boyunca 20.000 xg'de santrifüjleyin ve supernatant atın.
- 100 ul 1X PBS içinde yeniden süspanse pelet.
- 2 dakika boyunca 20.000 xg'de tekrar santrifüj ve supernatant atın.
- Yumuşak vorteks (5 sn), 75 ul steril deiyonize su içinde tekrar süspansiyon pelet ve deiyonize su içinde% 20 w / v Chelex-100 reçine süspansiyon 25 ul ile.
- Bunsen beki de Alevli steril 23G derialtı iğne kullanılarak örnek tüpünün kapağını Pierce delik.
- 10 dakika boyunca kayan raf üzerindeki su banyosu içinde kaynatılır örnek süspansiyon (veya ısıtma bloğu).
- PCR uygulamalarında şablon olarak kullanmak için prelabeled saklama kabı içine 1 dk ve transfer eden DNA çözümü için, 20,000 x g'de santrifüjleyin.
3. Plasmodium falciparum genotipleme ve Anofelspp. Moleküler Tanımlanması
- Anofel türleri 10 belirlemek ve genotip P., DNA kalitesi 11 kontrol etmek için 25 ul PCR reaksiyonlarında Chelex DNA ekstraktı 2.5 ul ekleyin falciparum 12 orta bağırsak ve tükürük bezi enfeksiyonları.
- Özellikle P. için Amplikon verimi maksimize etmek için falciparum algılama, PCR in (BSA), 1.5x bovin serum albümin yer alır. Aşağıdaki reaksiyon bileşim tavsiye edilmektedir: (2.5 ul şablon, 0.25 uM primerler, 1.5 mM magnezyum klorid, 200 uM dNTP, 1X PCR Tamponu, 1.5x BSA ve 1.0U Taq DNA polimeraz, 25 ul hacim içinde).
- Özü DNA kalite kontrol etmek için, eklembacaklı mitokondriyal nikotinamid adenin dinükleotid dehidrogenaz (NADH) altbirim 4 (ND4) gen (primerleri ND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR SKK AA-3 '] ve ND4RV [5' bölgesi amplifiye -CTT ÇGD CTT CCW ADW CGT TC-3 ']; ürünün 400bp) 11,13 bekliyoruz.
- Anofel gambia ayırt etmeke sl. türler (An. gambiae ss ve An. arabiensis sadece), intergenik boşluk (IGS) bölgesinde, (SNP sınırdaş bölgede yükseltmek primerler BM [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; ürün 390bp bir gambiae ss, 315bp bir arabiensis) 10,11 beklenmektedir.
- Yazarak P. için falciparum antifolate ilaç direnci polimorfizmleri, amino asit, kodonlar 108, 51, 59, parazit dihidrofolat redüktaz (DHFR) geni içinde 16 ve 164 komşu bölgeyi büyütmek için iç içe PCR işlemi gerçekleştirmek:
Birincil yuvarlak primerler: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] ve M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
İkincil yuvarlak primerler: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] F / ile [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
Veya
F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
Ayrıca amino asit kodon 436, 437, 540, 581 bir içeren bölge amplifiyeP. nd 613 falciparum Dihidropteroat sentaz (DHPS) geni:
Birincil yuvarlak primerler R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
İkincil yuvarlak primerler
J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 '] ile
Veya
K: K / [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '],
Veya
L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] 12. - Üreticinin talimatları izleyerek 30 ul reaksiyon allel-spesifik restriksiyon enzim sindirim, Konu 4 ul Amplikon antifolate ilaç direnci ile ilişkili polimorfizmleri 12 algılamak için.
- Konu 5 elektroforez etidyum bromür ile boyalı% 2'lik agaroz jel (100 - 120V) ve her kulvar için PCR amplikon (veya kısıtlama sindirmek 15 ul) ul ve UV transillüminasyon altında bantları görselleştirmek.
Representative Results
Sivrisinek DNA ekstraktı kalitesi için PCR (Şekil 1), Anofel arabiensis moleküler tanımlama (Şekil 2) ve P. sonuçları örnekleri basitleştirilmiş Chelex yöntem çok daha az adımda (Tablo 1) rağmen, protokol 10 salting out standart benzer sonuçlar verdiğini falciparum algılama (Şekil 3) göstermektedir. Ilgili özler karşılaştırılabilir DNA kalitesi sayesinde şaşırtıcı olmadığını An ile ilgili örnek pozitiflik oranları. gambiae türler gibi parazit enfeksiyon oranları McNemar ki-kare testi (Şekil 3) göre istatistiksel olarak farklı değildi.
Duyarlılık (%) olarak hesaplanmıştır TP / (TP + FN) TP gerçek pozitifler gösterir ve FN yanlış negatifler gösterir * 100,. Özgünlük (%) TN / olarak saptandı (TN + FP) TN gerçek negatifler gösterir ve FP yanlış pozitiflerin gösterir * 100,. DNA kalitesi (ND4) PCR kurulmuş olarak protokolü üzerinden tuzlama altın standardına göre Chelex yaklaşım için% 93 duyarlılık ve% 82 özgüllük gösterdi. Duyarlılık ve özgüllük Sorumlu değerleri P. için sırasıyla, türler tanımlama PCR ve% 92 ve% 80 ile, sırasıyla,% 100 ve% 78 idi falciparum tespiti PCR.
Reaksiyon karışımları BSA ek protokolü üzerinden tuzlama basitleştirilmiş Chelex ve düzenli hem nedeniyle PCR inhibitörleri 14 dindirilmesi için PCR pozitif genel bir artış (Şekil 3) sonuçlandı. Ancak bu artış Chelex özler (p = 0.039) üzerinde DNA kalitesi (ND4 PCR) haricinde istatistiksel olarak anlamlı değildi. P. üzerinde Allel özel sınırlama enzimi özümlemesi falciparum DHFR (ya da diğer hedef gen) Amplikon ilaç direnci allelleri (; tükürük bezi veriler gösterilmemiştir Şekil 4) için orta-bağırsak ve tükürük bezi sıtma enfeksiyonu genotipleme sağlar.
| Basit Chelex Prosedürü | Standart Prosedür üzerinden Tuzlama | ||
| Adımlar | Reaktifler | Adımlar | Reaktifler |
| PBS
Chelex-100 boncuk |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)
8 M Potasyum asetat Etanol 0,1 X Tuzlu sodyum sitrat (SSC) tampon RNAse (10 ug / ml) |
| TOPLAM SÜRE: 37 dk | TOPLAM SÜRE: 2 saat 47 dk, artı gecede | ||
Tablo 1. Basit Chelex protokolü için reaktifler ve zaman gereksinimleri adım karşılaştırma adım ve standard sivrisinek örneklerinden DNA ekstraksiyonu için yöntemi tuzlama.
Şekil 1. ND4 mitokondriyal PCR basitleştirilmiş Chelex "C" DNA kalitesinin karşılaştırılması ve Anofel arabiensis alan numuneler üzerinde "M" özler dışarı tuzlama standart. NC, negatif kontrol; M1 ve C1, M2 ve C2, M3 ve C3, ve M4 ve C4 üzerinden tuzlama ve aynı bir araba Chelex özler eşleştirilir. arabiensis sivrisinek örnekleri. L, 100 bp DNA ladder.
Şekil 2 Anofel arabiensis için Moleküler tanımlama PCR C1 ve M1, C2 ve M2, C3 ve M3, C4 ve M4 "M" salting out ve aynı sivrisinek numuneler için Chelex "C" DNA ekstraktları basitleştirilmiş itibaren ilgili Amplikon temsil eder;.. AR, Anofel arabiensisPozitif kontrol, L, 100 bp DNA ladder.
Şekil 3. Chelex ve Anofel arabiensis (AR) 10, artropod NADH dehidrogenaz geninin 4 (ND4) DNA kalitesi testi 11 ve antifolate ilaç direnci P moleküler tespiti için PCR ile, sivrisinek alan örnekleri DNA özü dışarı Tuzlanmaya pozitiflerin Algılama . falciparum DHFR genotipleme 12 (F-M4). Reaksiyon karışımı BSA ile veya olmadan çalıştırabilirsiniz deneyleri için gösterilen sonuçlar. McNemar ki-kare testi DNA pozitif PCR yüzde arasındaki farklılıklar basitleştirilmiş Chelex çıkarılan ve protokolleri tuzlama standart istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştır.
Discussion
Burada sunulan basitleştirilmiş Chelex yöntemi kalitesi Anopheles spp ve P. çıkarılması sağlar farklı PCR uygulamaları mükellef sivrisinek örneklerden falciparum DNA. Bu teknik, ilaca dirençli P. moleküler sıtma vektör sivrisinek tespiti ve gözetim için istihdam edilebilir ulusal sıtma kontrol programları için sivrisinekler falciparum allel. Basitleştirilmiş Chelex tekniğin avantajları basitlik, daha az reaktif ve dolayısıyla maliyet, güvenlik ve bu yöntemi 10 salting out (2 saat 47 dakika ve bir gecede adım, Tablo 1) gibi standart protokolleri daha kısa işlem süresi (37 dakika) bulunmaktadır. Söz konusu avantajlar ve minimal reaktif gereksinimleri (3 reaktifler) mevcut standart protokol (10 reaktifleri, Tablo 1) 11,15 karşılaştırıldığında, sabit reaktif endemik ülke laboratuvarları basitleştirilmiş Chelex protokolü özellikle kolay haletedarik zinciri çoğu kez sağlamak zordur. Yöntemin özel bir sınırlama standart protokol gibi, aynı zamanda sivrisinek zar 16 meydana geldiği bilinmektedir PCR inhibitörleri tabi olmasıdır. Bununla birlikte, bu kolayca deneylerinde BSA dahil edilmesi ile rahatlatılır. BSA de başarıyla diğer PCR uygulamaları 17,18 inhibitörleri karşı bir amplifikasyon artırıcı olarak istihdam edilmiştir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar şefleri, muhtarları ve sivrisinek alanında örnek koleksiyonları sırasında işbirliği onların unwaveing için Macha toplulukları borçluyuz. Dr Doug Norris ve Rebekah Kent üzerinden tuzlama protokol biçilmez bir uzmanlık sundu. Bu çalışma, Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü pilotu hibe sistemi tarafından finanse edildi. Sivrisinek ve parazit DNA laboratuvarında standartlara nazik MR4, Amerikan Tip Kültür & Koleksiyon tarafından bağışlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
| Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
| BSA | New England Biolabs | B9001S |
References
- Bonnet, M., et al. Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore. Malar. J. 6, 54 (2007).
- Nsimba, B., et al. Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy. Malar. J. 7, 31 (2008).
- Oyewole, I. O., et al. Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria. J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).
- Harris, I., et al. A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting. Malar. J. . 9, 254 (2010).
- Ouedraogo, A. L., et al. Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission. PLoS ONE. 4, e8410 (2009).
- Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery. Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).
- Ishengoma, D. R., et al. Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases. Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).
- Alonso, P. L., et al. A research agenda for malaria eradication: vector control. PLoS Med. 8, e1000401 (2011).
- Grimberg, J., et al. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 17, 8390 (1989).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion. Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).
- Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).
- Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).
- Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).
- Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes. Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).
- Al-Soud, W. A., Radstrom, P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR. J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).
