Summary
Een snelle en betaalbare manier om de kwaliteit malariaparasiet en vector-DNA extraheren uit mug exemplaren beschreven. Voortbouwend op chelerende eigenschappen van Chelex hars, maakt de eenvoudige methode genotypering van malariaparasieten in mug mid-darmkanaal en speekselklier fasen en moleculaire identificatie van de
Abstract
Endemische landen worden in toenemende mate de aanneming van moleculaire tools voor efficiënte typen, identificatie en bewaking tegen malaria parasieten en vector muggen, als een integraal onderdeel van de bestrijdingsprogramma's 1,2,3,4,5. Voor een duurzame inrichting van deze nauwkeurige benaderingen in operationeel onderzoek naar de bestrijding van malaria en eliminatie inspanningen, eenvoudige en betaalbare methode, met karig reagens en apparatuur aan te scherpen zijn essentieel 6,7,8. Hier presenteren we een eenvoudig Chelex-gebaseerde techniek voor de extractie van malariaparasiet en vector-DNA van veld verzamelde muggen exemplaren.
We morfologisch geïdentificeerd 72 Anopheles gambiae sl. Vanaf 156 muggen gevangen genomen door pyrethrum spuiten vangsten in slaapkamers van de huishoudens binnen een 2.000 km 2 nabijheid van de Malaria Instituut in Macha. Na dissectie van de kop en thorax scheiden van de buik voor alle 72 Anopheles gambiae sl. muggen werden de twee delen afzonderlijk geplaatst in 1,5 ml microcentrifuge buizen en ondergedompeld in 20 pl gedeioniseerd water. Met behulp van een steriele pipet tip, werd elke mug sectie afzonderlijk gehomogeniseerd tot een uniforme suspensie in de gedeïoniseerd water. Van de daaropvolgende homogenaat van elke sectie muggen, werd 10 ul behouden, terwijl de andere 10 pi werd overgebracht naar een afzonderlijk geautoclaveerd 1,5 ml buis. De afzonderlijke monsters werden onderworpen aan DNA extractie door ofwel de vereenvoudigde Chelex of de standaard uitzouten extractieprotocol 9,10. De uitzouten protocol is de zogenaamde en veel gebruikt omdat het werk hoge zoutconcentraties in plaats van gevaarlijke organische oplosmiddelen (zoals fenol en chloroform) voor het eiwit tijdens precipitatiestap DNA extractie 9.
Extracten werden gebruikt voor de PCR amplificatie met behulp van primers gericht geleedpotige mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subeenheid 4 gen (ND4) om DNA kwaliteit 11, een PCR voor de identificatie van Anopheles gambiae broer of zus soorten 10 en een geneste PCR controleren op het typen van Plasmodium falciparum infectie 12. Vergelijking met behulp van DNA-kwaliteit (ND4) PCR toonde 93% sensitiviteit en 82% specificiteit voor de Chelex benadering ten opzichte van de gevestigde uitzoutingsconstante protocol. Corresponderende waarden van gevoeligheid en specificiteit was 100% en 78%, respectievelijk met sibling soortidentificatie PCR en 92% en 80%, respectievelijk P. falciparum detectie PCR. Er waren geen significante verschillen in percentage monsters die amplicon signaal met de Chelex of regelmatig uitzouten protocol alle drie PCR toepassingen. De Chelex aanpak vereist drie eenvoudige reagentia en 37 minuten in beslag, terwijl de uitzoutingsconstante protocol hield 10 verschillende reagentia en 2 uur en 47 min 'verwerkingstijd, met inbegrip van een overnachting stap. Onze resultaten tonen aan ede Chelex methode is vergelijkbaar met de bestaande uitzouten extractie en kan worden vervangen als een eenvoudige en duurzame aanpak met beperkte middelen waar een constante reagens keten is vaak moeilijk te handhaven.
Protocol
1. Voorbereidende Dissectie van Mosquito Specimens
- Plaats mug op een klein snijden van parafilm en monteren op ontleden microscoop.
- Dekking druppel gedeïoniseerd water om weefsel te verzachten.
- Precies Incise de mug karkas bij de verbinding tussen de thorax en de buik, waardoor knikken van de kop en de thorax van de buik gedeelte.
- Breng elke ontleed mug sectie in een schone geautoclaveerd 1,5 ml microcentrifugebuis prelabeled met mug ID-nummer gegevens en doelmatig zijn gekenmerkt aan het lichaam sectie (bijvoorbeeld "m" voor mid-gut sectie; "ht" voor de kop en borst sectie) aan te duiden.
- Gooi parafilm en zorgvuldig microscoop podium af met 70% alcohol bevochtigd Kimwipe voor het verwerken van de volgende mug.
2. DNA-extractie van Mosquito Specimens
- Pipetteer 20 ul van gedeïoniseerd water in monsterbuis en gebruik pipet tip om de verzonken mug sectie vermalen tot een uniForm schorsing.
- Voeg 100 ul van geautoclaveerd 1X PBS / 1% oplossing saponine monster homogenaat en meng door voorzichtig vortexen momentane.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 2 min en verwijder het supernatant.
- Hersuspendeer pellet in 100 pi 1X PBS.
- Centrifugeer opnieuw bij 20.000 xg gedurende 2 min en verwijder het supernatant.
- Door voorzichtig vortexen (5 sec), Hersuspendeer pellet in 75 ul steriel gedeïoniseerd water en 25 pi van 20% w / v Chelex-100 hars suspensie in gedeïoniseerd water.
- Pierce gat in het deksel van het monster buis met behulp van steriele 23G injectienaald geflambeerd met bunsenbrander.
- Kook monster suspensie in een waterbad op drijvende rack (of verwarmingsblok) gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 1 min en daaropvolgende overdracht DNA oplossing in prelabeled opslag flesje voor gebruik als matrijs in PCR toepassingen.
3. Plasmodium falciparum Genotypering en Anophelesspp. Moleculaire identificatie
- Voeg 2,5 ul van de Chelex DNA extract in 25 pi PCR-reacties om DNA kwaliteit 11 controleren, Anopheles species identificeren 10 en genotype P. falciparum 12 mid-darm en speekselklier infecties.
- Om amplicon opbrengst, vooral voor P. maximaliseren falciparum detectie bevatten 1.5X runderserumalbumine (BSA) in de PCR assay. De volgende reactie samenstelling wordt aanbevolen: (2,5 ul mal, 0,25 pM primers, 1,5 uM magnesiumchloride, 200 uM dNTPs, 1X PCR Buffer, 1.5X BSA en 1.0U Taq DNA polymerase, in 25 pl volumes).
- Om te controleren voor DNA-kwaliteit in het extract, versterken regio van de geleedpotigen mitochondriale nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subeenheid 4 (ND4) gen (primers ND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR CCT AA-3 '] en ND4RV [5' -CTT CTT CGD CCW ADW CGT TC-3 ']; verwachten product 400bp) 11,13.
- Om Anopheles gambia onderscheidene sl. broer of zus soorten (An. gambiae ss en An. arabiensis alleen), versterken regio flankeren SNPs in het intergene spacer (IGS) regio, (primers VN [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; verwachten product 390bp Een gambiae ss, 315bp Een arabiensis) 10,11.
- Voor het typen P. falciparum antifolaat resistentie polymorfismen, voert geneste PCR met flankerende regio aminozuur codons 108, 51, 59, 16 en 164 in de parasiet dihydrofolaatreductase (DHFR) gen te amplificeren:
Eerste ronde primers: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] en M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
Secundaire ronde primers: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] met F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
Of
F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] met M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
Ook versterken regio aminozuur codons 436, 437, 540, 581 eennd 613 in de P. falciparum dihydropteroate synthetase (DHPS) gen:
Eerste ronde primers R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] met R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
Secundaire ronde primers
J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] met K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']
Of
K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] met K /,
Of
L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] met L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] 12. - Betreft 4 ui amplicon te allelspecifieke restrictie-enzym digestie in 30 pl reacties volgens de instructies van de fabrikant te detecteren antifolaat geneesmiddelresistentie-geassocieerde polymorfismen 12.
- Betreft 5 pi PCR amplicon (of 15 pi restrictiedigest) per rijstrook van ethidiumbromide gekleurde 2% agarose gel elektroforese (100 - 120 V) en visualiseren banden onder UV-licht.
Representative Results
Voorbeelden van resultaten van PCR assays voor mug DNA extract kwaliteit (figuur 1), Anopheles arabiensis moleculaire identificatie (figuur 2) en P. falciparum detectie (figuur 3) blijkt dat de vereenvoudigde Chelex werkwijze vergelijkbaar resultaat levert het standaard protocol uitzouten 10, ondanks veel minder stappen (tabel 1). Met vergelijkbare DNA-kwaliteit in de betreffende extracten is het niet verwonderlijk dat monster positiviteit tarieven met betrekking tot een. gambiae broertje soorten en parasitaire infectie tarieven waren niet statistisch verschillend op basis van McNemar-chi-kwadraat test (Figuur 3).
Gevoeligheid (%) werd berekend als TP / (TP + FN) * 100, waar TP betekent het ware positieven en valse negatieven FN geeft. Specificiteit (%) werd bepaald als TN / (TN + FP) * 100, waar TN betekent het ware negatieven en FP geeft valse positieven. De DNA kwaliteit (ND4) PCR toonde 93% sensitiviteit en 82% specificiteit voor de Chelex benadering ten opzichte van de gevestigde uitzoutingsconstante protocol als gouden standaard. Corresponderende waarden van gevoeligheid en specificiteit was 100% en 78%, respectievelijk met sibling soortidentificatie PCR en 92% en 80%, respectievelijk P. falciparum detectie PCR.
De toevoeging van BSA aan reactiemengsels tot een algemene verhoging van PCR positieve (figuur 3) door verlichting van PCR remmers 14 voor zowel de vereenvoudigde Chelex en regelmatige uitzouten protocol. Deze toename was niet statistisch significant behalve DNA kwaliteit (ND4 PCR) op Chelex extracten (p = 0,039). Allelspecifieke restrictie-enzymdigestie op P. falciparum DHFR (of andere doelgen) amplicon kan de genotypering van mid-darm en speekselklier malaria infecties resistentie allelen (figuur 4; speekselklier data niet getoond).
| Eenvoudige Chelex Procedure | Standaard Zouten uit Procedure | ||
| Stappen | Reagentia | Stappen | Reagentia |
| PBS
Chelex-100 kralen |
| Diethylpyrocarbonaat (DEPC)
8 M kaliumacetaat Ethanol 0,1 x Saline natriumcitraat (SSC) buffer RNAse (10 ug / ml) |
| Totale tijd: 37 min | Totale tijd: 2 uur 47 min, plus girale | ||
Tabel 1. Stap voor stap vergelijking van de reagentia en de tijd eisen voor eenvoudige Chelex protocol en staanard uitzoutingsconstante methode voor DNA-extractie van muggen exemplaren.
Figuur 1. ND4 mitochondriale DNA PCR vergelijking van de kwaliteit van vereenvoudigde Chelex "C" en standaard uitzouten "M" extracten Anopheles arabiensis veldmonsters. NC, negatieve controle, M1 en C1, M2 en C2, M3 en C3, en de M4 en C4 zijn gekoppeld zouten uit en Chelex uittreksels uit dezelfde An. arabiensis mug specimens. L, 100 bp DNA ladder.
Figuur 2 Moleculaire identificatie PCR voor Anopheles arabiensis C1 en M1, M2 en C2, C3 en M3, M4 en C4 duiden respectieve amplicon van uitzouten "M" en vereenvoudigde Chelex "C" DNA extracten dezelfde mosquito specimens;.. AR, Anopheles arabiensispositieve controle, L, 100 bp DNA-ladder.
Figuur 3. Detectie van positieven, op Chelex en zouten uit DNA-extracten voor muggen veldmonsters, met PCR assays voor de moleculaire identificatie van Anopheles arabiensis (AR) 10, geleedpotigen NADH dehydrogenase-gen 4 (ND4) DNA-kwaliteit te testen 11 en antifolaat resistentie P . falciparum DHFR genotypering 12 (F-M4). resultaten getoond voor assays uitgevoerd met of zonder BSA in het reactiemengsel. McNemar-chi-kwadraattest werd gebruikt om te bepalen of de verschillen tussen percentage positieve PCR van DNA geëxtraheerd uit de vereenvoudigde Chelex en de standaard uitzouten protocollen waren statistisch significant.
Discussion
De vereenvoudigde Chelex methode hier gepresenteerde maakt winning van kwaliteit Anopheles spp en P. falciparum DNA van mug specimens vatbaar diverse PCR toepassingen. Deze techniek kan worden gebruikt voor moleculaire identificatie van malaria vector muggen en de bewaking van resistente P. falciparum allelen in muggen voor nationale malaria controleprogramma's. De voordelen van de vereenvoudigde Chelex techniek zijn eenvoud minder reagentia en dus kosten, veiligheid en kortere verwerkingstijd (37 min) dan standaardprotocollen zoals uitzouten werkwijze 10 (2 uur 47 min en een nacht stap, tabel 1). De genoemde voordelen en minimale reagens eisen (3 reagentia) in vergelijking met de huidige standaard protocol (10 reagentia, tabel 1) 11,15, de vereenvoudigde Chelex protocol bijzonder vriendelijk naar endemisch land laboratoria waar een constante reagensketen is vaak moeilijk te handhaven. Een beperking van de methode is dat als de standaard protocol, dat onderhevig is aan PCR remmers bekend bij de mug integument 16. Dit is echter gemakkelijk verlicht door opname van BSA in de assays. BSA is ook met succes toegepast als een versterking enhancer tegen inhibitoren in andere toepassingen PCR 17,18.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs zijn dank verschuldigd aan de leiders, hoofdmannen en gemeenschappen van Macha van hun unwaveing samenwerken tijdens mug veld monstercollecties. Dr Doug Norris en Rebekka Kent aangeboden onschatbare expertise op de uitzoutingsconstante protocol. Dit werk werd gefinancierd door de Johns Hopkins Malaria Research Institute piloot subsidie systeem. Mosquito en parasiet DNA-laboratorium normen werden gedoneerd door MR4, American Type & Culture Collection.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
| Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
| BSA | New England Biolabs | B9001S |
References
- Bonnet, M., et al. Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore. Malar. J. 6, 54 (2007).
- Nsimba, B., et al. Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy. Malar. J. 7, 31 (2008).
- Oyewole, I. O., et al. Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria. J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).
- Harris, I., et al. A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting. Malar. J. . 9, 254 (2010).
- Ouedraogo, A. L., et al. Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission. PLoS ONE. 4, e8410 (2009).
- Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery. Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).
- Ishengoma, D. R., et al. Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases. Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).
- Alonso, P. L., et al. A research agenda for malaria eradication: vector control. PLoS Med. 8, e1000401 (2011).
- Grimberg, J., et al. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 17, 8390 (1989).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion. Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).
- Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).
- Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).
- Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).
- Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes. Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).
- Al-Soud, W. A., Radstrom, P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR. J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).
