Summary
一种快速，经济实惠的方式来提取质量疟疾寄生虫的蚊子标本与载体DNA的方法。利用Chelex树脂螯合性能，简单的方法使基因分型疟疾寄生虫的蚊子中肠和唾液腺阶段，以及分子鉴定
Abstract
疾病流行的国家越来越多地采用高效的打字，识别和监视对疟疾寄生虫和媒介蚊虫的分子工具，作为一个组成部分，其控制方案1,2,3,4,5。可持续发展建立在操作这些准确的方法研究，以加强控制和消除疟疾的努力，简单又经济实惠的方法，吝啬的试剂和设备的要求是必不可少的6,7,8。在这里，我们提出了一个简单的Chelex从现场采集的蚊虫标本中提取疟疾寄生虫与载体DNA为基础的技术。
形态确定了72， 冈比亚按蚊SL。从156，由除虫菊喷雾捕获卧室的家庭在2,000 平方公里 ，附近的马查疟疾研究所在捕获的蚊子。经过解剖，分离的头部和胸部，腹部所有72个按蚊GAM两个部分BIAE sl的蚊子，单独放置在1.5毫升微量离心管中，并浸没在20微升的去离子水。使用无菌移液管尖，每个蚊子部分分别均匀的匀化的去离子水的悬浮液中。 10微升的随后从每个蚊子部匀浆中，被保留，而其他的10微升转移到一个单独的蒸压1.5 ml管。独立的等分试样进行DNA提取，不论是由简化的Chelex或标准盐析萃取协议9,10。盐析协议是所谓的和广泛使用的，因为它采用高盐浓度代替有害的有机溶剂（如苯酚和氯仿），用于DNA提取过程中的步骤9的蛋白质沉淀。
提取物被用作PCR扩增的模板，使用引物针对节肢动物线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶检查DNA的质量激酶（NADH）亚单位基因（ND4）11，PCR鉴定冈比亚按蚊亲缘种10和巢式PCR分型恶性疟原虫感染12。比较使用DNA质量（ND4），PCR结果显示93％的敏感性和特异性82％Chelex方法相对于既定的盐析协议。相应的值的敏感性和特异性分别为100％和78％，分别使用近缘种鉴定PCR和92％和80％，分别为P.恶性疟原虫检测PCR。有给扩增子的的Chelex或定期盐析协议在所有三个PCR应用与信号的样本比例无显着差异。 Chelex方法需要三个简单的试剂和37分钟完成，而盐析协议entailed 10个不同的试剂和2小时47分钟的处理时间，包括一晚一步。我们的研究结果表明Chelex法是与现有的盐析提取，并可以取代一个简单的和可持续的方法在资源有限的环境中恒定试剂的供应链往往是难以维持的。
Protocol
1。筹备的蚊子标本解剖
- 将切割封口膜，并安装在解剖显微镜下的小蚊子。
- 量的去离子水软化组织在下拉。
- 切开的蚊子尸体正是在胸部和腹部之间的联合，从而刻痕的头部和胸部，腹部。
- 每个解剖蚊子节转移到一个干净的高压灭菌1.5毫升离心管中prelabeled蚊子ID号码的细节和适当的标记来表示的主体部分（ 例如，“m”为中肠部分，头部和胸部部分的“HT”）。
- 丢弃封口膜处理下一个蚊子之前，仔细地擦拭显微镜载物台与70％酒精蘸Kimwipe。
2。蚊子标本的DNA提取
- 吸取20微升的样品管和去离子水，使用移液器吸头研磨成联合国淹没蚊子节iform暂停。
- 中加入100μl，蒸压1X PBS / 1％皂素的解决方案样品匀浆和组合，温柔的瞬间涡旋。
- 在室温下孵育20分钟。
- 离心20000×g离心2分钟，弃去上清液。
- 在100μL1X PBS重悬浮颗粒。
- 在20,000×g离心2分钟，再次离心，弃去上清液。
- 通过轻轻涡旋（5秒），20％w / v的Chelex-100树脂的去离子水的悬浮液中重悬沉淀，将75μl无菌去离子水和25μl。
- 皮尔斯孔盖样品管，用无菌23G注射器针头在本生灯火焰。
- 煮沸样品悬浮液的浮动机架在水浴中10分钟（或在加热块）。
- 在20,000 xg离心离心，1分钟和转让随后的DNA溶液作为PCR应用的模板用于成prelabeled储存小瓶。
3。恶性疟原虫基因分型和按蚊SPP。分子生物学鉴定
- Chelex DNA提取25微升的PCR反应中加入2.5μl检查DNA，确定质量11的 按蚊种10和基因型P.恶性疟原虫 12月中旬肠道和唾液腺感染。
- 为了最大限度地提高扩增产物的产率，特别是对体育恶性疟原虫的检测，包括1.5X牛血清白蛋白（BSA）的PCR检测。下面的反应组合物的建议的：（2.5微升模板，0.2510μM的引物，1.5μM的氯化镁，200μM的dNTPs，1X PCR缓冲液，1.5X BSA和1.0U Taq DNA聚合酶，在25微升的体积）。
- 要检查的DNA提取物质量在节肢动物线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（NADH）亚基4（ND4）基因（引物ND4FW [5'-GTD一TTA TGA TTR建AA-3']和ND4RV [5'，放大区域CTT CGD CTT CCW ADW CGT TC-3'];期望产品400bp的）11,13。
- 为了区分按蚊冈比亚E SL近缘 种（An.冈比亚ss和阿拉伯按蚊只），扩增侧翼区域SNP位点的基因间隔区（IGS），（引物UN [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT 3]，GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT 3']，AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']期望产品的390bp 的冈比亚β，315bp的阿拉伯按蚊 ）10,11。
- 对于打字P.恶性疟原虫抗叶酸剂的耐药性基因多态性，进行巢式PCR扩增侧翼区域的氨基酸的密码子108，51，59，16和164中的寄生虫的二氢叶酸还原酶（DHFR）基因：
主轮引物 ：M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3']和M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
中学轮引物：M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3']与F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
或
F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3与']）。
含氨基酸的密码子436，437，540，581一个，也放大区域ND 613的P.恶性疟原虫二氢喋呤合成酶（，DHPS），基因：
主轮引物 R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3']与R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
二级轮引物
J：[5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3']与K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3']
或
K：与K / [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3']，
或
L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3']与L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] 12。 - 主题4微升的扩增子检测抗叶酸药耐药相关多态性等位基因特异的限制性内切酶消化，按照制造商的说明，在30μl的反应12。
- 主题5μl的PCR扩增子（或15微升限制性消化）每车道溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶电泳（100 - 120V）和可视化条带在紫外透照。
Representative Results
结果PCR检测蚊子的DNA提取物质量（ 图1）， 阿拉伯按蚊的分子鉴定（ 图2），P. 的例子恶性疟原虫的检测（ 图3）表明，简化的的Chelex方法产生相似的结果的标准盐析协议10，尽管少得多的步骤（ 表1）。在各自的提取物具有可比性的DNA的质量，这是不足为奇的，样品阳性率相对于至An。冈比亚按蚊亲缘种以及寄生虫感染率差异无统计学意义的基础上麦克尼马尔的卡方检验（ 图3）。
灵敏度（％）被计算为TP /（TP + FN）* 100，其中TP表示真阳性和FN表示假阴性。特异性（％）被确定为TN /（TN + FP）* 100，TN表示真阴性和FP为假阳性。 DNA的质量（ND4）PCR结果显示93％的敏感性和82％的特异性的Chelex方法相比既定的盐析协议为金标准。相应的值的敏感性和特异性分别为100％和78％，分别使用近缘种鉴定PCR和92％和80％，分别为P.恶性疟原虫检测PCR。
到反应混合物中，加入BSA导致在一般的PCR阳性增加（ 图3）由于对救济PCR抑制剂14，为简化的Chelex，定期盐析协议。然而，这增加没有统计学意义，除了DNA的质量（ND4 PCR）Chelex提取物（P = 0.039）。等位基因特异的限制性内切酶消化对P.恶性疟原虫 DHFR（或其它目标基因）扩增子可以为药物抗性等位基因（ 图4，，唾液腺数据未示出 ）中肠和唾液腺疟疾感染的基因分型。
| 简单Chelex程序 | 标准的盐析过程 | ||
| 步骤 | 试剂 | 步骤 | 试剂 |
| PBS
Chelex-100珠 |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC）
8 M乙酸钾 乙醇 0.1X盐渍柠檬酸钠（SSC）缓冲液 RNA酶（10微克/毫升） |
| 总时间：37分钟 | 总时间：2小时47分钟，再加上过夜 | ||
表1中。步骤一步所用试剂和时间要求为简单Chelex协议比较站在ARD蚊子标本的DNA提取盐析法。
图1。ND4线粒体PCR扩增的DNA质量比较从简化的Chelex的“C”和盐析“M”的提取物对阿拉伯按蚊现场样品的标准。 NC，阴性对照; M1和C1，M2和C2，M3和C3，和M4和C4是成对的盐析法和Chelex提取物相同的一个。阿拉伯按蚊的蚊子标本。 L，100 bp的DNA阶梯。
图2。C2和C1，M1，M2，C3和M3，C4和M4分别表示的扩增子从盐析“M”简化的Chelex“C”相同的蚊子标本的DNA提取物，AR， 按蚊阿拉伯按蚊的分子鉴定PCR。阿拉伯按蚊阳性对照组，L，100 bp的DNA梯状条带。
图3 Chelex和，盐析蚊子现场样品的DNA提取物， 阿拉伯按蚊 （AR）10，节肢动物NADH脱氢酶基因（ND4）DNA的质量测试11，与抗叶酸药物性 P分子鉴定的PCR检测的阳性检测。 。恶性疟原虫 DHFR基因分型12（F-M4）运行，或在反应混合物中不含BSA的测定结果所示。使用麦克尼马尔的卡方检验的，从DNA％的正的PCR之间的差异，以确定是否从简化Chelex萃取和盐析法协议的标准有统计学显着性。
Discussion
简化Chelex这里介绍的方法，使提取质量按蚊属和P.恶性疟原虫的蚊子标本，适合不同的PCR应用DNA。这种技术可以用于传播疟疾的蚊子的分子鉴定和耐药监测P.恶性疟原虫基因蚊子为国家疟疾控制计划。简化Chelex技术的优点包括简单，试剂少，因此成本，安全性和较短的处理时间比标准协议，如盐析方法10（2小时47分钟，过夜的步骤， 表1）（37分钟）。上述优势和最小的试剂要求（试剂）相比，目前的标准协议（10个试剂， 表1），11,15，简化Chelex协议，特别是友好流行国家实验室，那里的恒定试剂供应链往往是难以维护。该方法的一个限制是一样的标准协议，它也发生在蚊虫珠被16 PCR抑制剂。然而，这是容易地解除通过包含在检测的BSA。 BSA也被成功地采用作为一个放大增强剂针对在其他PCR应用程序17,18的抑制剂。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者感谢酋长，村长和马查为他们的unwaveing合作，在蚊子的现场样品采集的社区。道格·诺里斯博士和利百加肯特的盐析协议提供了宝贵的经验。这项工作是由约翰霍普金斯大学疟疾研究所试点补助金制度。蚊子和寄生虫DNA实验室标准MR4，美国的文化类型和收集捐赠。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
| Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
| BSA | New England Biolabs | B9001S |
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