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Immunology and Infection

डीएनए निष्कर्षण के लिए एक सरल Chelex से प्रोटोकॉल Published: January 9, 2013 doi: 10.3791/3281
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Malaria Institute at Macha, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

Summary

एक तेजी से और सस्ती मच्छर नमूनों से गुणवत्ता मलेरिया परजीवी और वेक्टर डीएनए निकालने में वर्णित है. Chelating Chelex राल के गुण पर Capitalizing, सरल विधि मच्छर मध्य पेट और लार ग्रंथि चरणों में मलेरिया परजीवी के जीनोटाइपिंग, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से की आणविक पहचान के लिए सक्षम बनाता है

Protocol

1. मच्छर नमूनों की तैयारी विच्छेदन

  1. खुर्दबीन विदारक पर एक parafilm और माउंट के छोटे काटने पर जगह मच्छर.
  2. विआयनीकृत ऊतक नरम पानी की बूंद में कवर.
  3. मच्छर लोथ ठीक छाती और पेट के बीच संयुक्त पर, इस तरह से पेट अनुभाग से सिर और छाती nicking काटकर अलग कर देना.
  4. एक साफ autoclaved 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge मच्छर आईडी संख्या विवरण और उचित शरीर अनुभाग (, "ht" सिर और छाती अनुभाग के लिए जैसे मध्य - आंत अनुभाग के लिए "मीटर") को निरूपित करने के रूप में चिह्नित के साथ prelabeled ट्यूब में प्रत्येक dissected मच्छर अनुभाग स्थानांतरण.
  5. त्यागें और parafilm ध्यान से 70% शराब सिक्त Kimwipe के साथ अगले मच्छर प्रसंस्करण से पहले मंच खुर्दबीन पोंछे.

2. मच्छर नमूनों से डीएनए निष्कर्षण

  1. पिपेट विआयनीकृत जल के 20 μl नमूना ट्यूब और उपयोग विंदुक टिप करने के लिए एक संयुक्त राष्ट्र में जलमग्न मच्छर अनुभाग पीसने मेंiform निलंबन.
  2. Autoclaved 1X पीबीएस / 1% saponin नमूना और कोमल क्षणिक vortexing द्वारा homogenate मिश्रण करने के लिए समाधान के 100 μl जोड़ें.
  3. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  4. 2 मिनट के लिए 20,000 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  5. 100 μl 1X पीबीएस में Resuspend गोली.
  6. फिर 2 मिनट के लिए 20,000 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  7. कोमल (5 सेकंड) vortexing, 75 μl बाँझ विआयनीकृत पानी में resuspend गोली और 20% w / v Chelex 100 विआयनीकृत पानी में राल निलंबन के 25 μl.
  8. पियर्स नमूना Bunsen बर्नर में flamed बाँझ 23g चमड़े के नीचे सुई का उपयोग ट्यूब के ढक्कन में छेद.
  9. उबाल लें नमूना चल रैक पर नहाने के पानी में 10 मिनट के लिए (या हीटिंग ब्लॉक में) निलंबन.
  10. 20,000 XG पर 1 मिनट और पीसीआर अनुप्रयोगों में टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने के लिए स्थानांतरण आगामी डीएनए समाधान prelabeled भंडारण शीशी में, अपकेंद्रित्र.

3. प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम जीनोटाइपिंग और एनोफ़ेलीज़एसपीपी. आण्विक पहचान

  1. 25 μl पीसीआर प्रतिक्रियाओं में Chelex डीएनए निकालने के 2.5 μl जोड़ें करने के लिए डीएनए 11 गुणवत्ता की जांच, 10 एनोफ़ेलीज़ प्रजातियों की पहचान और जीनोटाइप पी. फाल्सीपेरम 12 मध्य पेट और लार ग्रंथि में संक्रमण.
  2. Amplicon उपज, पी. के लिए विशेष रूप से अधिकतम फाल्सीपेरम का पता लगाने, 1.5X पीसीआर परख में गोजातीय सीरम albumin (BSA) शामिल हैं. निम्नलिखित प्रतिक्रिया संरचना की सिफारिश की है: (2.5 μl टेम्पलेट, 0.25 सुक्ष्ममापी प्राइमरों, 1.5 सुक्ष्ममापी मैग्नीशियम क्लोराइड, 200 सुक्ष्ममापी dNTPs, 1X पीसीआर बफर, 1.5X BSA और 1.0U Taq डीएनए पोलीमरेज़, 25 μl खंडों में).
  3. निकालने में डीएनए की गुणवत्ता की जांच करने के लिए, सन्धिपाद mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide डिहाइड्रोजनेज (NADH) सबयूनिट 4 (ND4) जीन (प्राइमरों ND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR ए.ए.-3 CCT '] और ND4RV [5' के क्षेत्र बढ़ाना सीटीटी CGD सीटीटी CCW ADW CGT TC-3 ']; 11,13 400bp उत्पाद) की उम्मीद है.
  4. एनोफ़ेलीज़ गाम्बिया अंतरई sl भाई प्रजातियों (An. gambiae एस एस और एक ही. arabiensis), intergenic (IGS) स्पेसर क्षेत्र, (SNPs flanking क्षेत्र बढ़ाना प्राइमरों संयुक्त राष्ट्र [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 ', GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT 3 ', ए.आर. [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3', उत्पाद 390bp एक gambiae एस एस, 315bp एक arabiensis) 10,11 उम्मीद.
  5. टाइपिंग पी. के लिए फाल्सीपेरम antifolate दवा प्रतिरोध बहुरूपताओं, पीसीआर नेस्टेड प्रदर्शन क्षेत्र एमिनो एसिड 108 codons, 51, 59, 16 और परजीवी dihydrofolate (DHFR) रिडक्टेस जीन में 164 flanking बढ़ाना:
    प्राथमिक दौर प्राइमरों: एम 1 'और M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3] [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3]'
    माध्यमिक दौर प्राइमरों: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] / एफ [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
    या
    एफ [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] M4 के साथ [3 5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC ']).
    इसके अलावा क्षेत्र है जिसमें अमीनो एसिड codons 436, 437, 540, 581 एक बढ़ानापी. एन डी 613 में फाल्सीपेरम dihydropteroate synthetase जीन (DHPS):
    प्राथमिक दौर प्राइमरों R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] आर / के साथ [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
    माध्यमिक दौर प्राइमरों
    जम्मू: 5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3 'कश्मीर /] [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3']
    या
    कश्मीर / के साथ [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3],: कश्मीर
    या
    एल [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] / एल के साथ [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] 12.
  6. विषय एलील विशिष्ट प्रतिबंध 30 μl प्रतिक्रियाओं में एंजाइम digestions, निर्माता के निर्देशों का पालन करने के लिए 4 μl amplicon antifolate दवा प्रतिरोध से जुड़े बहुरूपताओं 12 का पता लगाने के लिए.
  7. विषय ethidium ब्रोमाइड से सना हुआ 2% agarose वैद्युतकणसंचलन जेल (100 - 120V) के प्रति लेन पीसीआर amplicon (या प्रतिबंध डाइजेस्ट के 15 μl) के 5 μl और यूवी transillumination के तहत बैंड कल्पना.

Representative Results

मच्छर डीएनए निकालने गुणवत्ता के लिए पीसीआर assays (1 चित्रा), एनोफ़ेलीज़ arabiensis आणविक पहचान (2 चित्रा) और पी. से परिणामों के उदाहरण फाल्सीपेरम का पता लगाने (3 चित्रा) दिखाने के लिए कि सरलीकृत विधि Chelex बहुत कम कदम (1 टेबल) के बावजूद मानक प्रोटोकॉल 10 नमक भुरकना इसी तरह के परिणाम, पैदावार. संबंधित निष्कर्षों में तुलनीय डीएनए गुणवत्ता के साथ यह आश्चर्य की बात नहीं है कि नमूना एक करने के लिए सम्मान के साथ धनात्मकता दर. gambiae भाई के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रजातियों परजीवी संक्रमण दरों सांख्यिकीय अलग McNemar ची के वर्ग परीक्षण (3 चित्रा) पर आधारित नहीं थे.

संवेदनशीलता (%) के रूप में गणना की गई टी.पी. / (टी.पी. + FN) 100 *, जहां टी.पी. सच सकारात्मक अर्थ और FN झूठी नकारात्मक अर्थ. विशिष्टता (%) / TN के रूप में निर्धारित किया गया था (TN + एफ पी) 100 *, जहां तमिलनाडु सच नकारात्मक अर्थ और एफपी झूठी सकारात्मक अर्थ. डीएनए (गुणवत्ताND4) पीसीआर स्थापित बाहर नमक भुरकना प्रोटोकॉल सोने के मानक की तुलना में 93% और 82% विशिष्टता Chelex दृष्टिकोण के लिए संवेदनशीलता दिखाई. संवेदनशीलता और विशिष्टता के अनुरूप मूल्यों थे 100% और 78%, क्रमशः, भाई प्रजातियों की पहचान की पीसीआर और 92% और 80%, क्रमशः पी. के लिए फाल्सीपेरम का पता लगाने पीसीआर.

BSA की प्रतिक्रिया मिश्रण के अलावा पीसीआर सकारात्मक पीसीआर 14 inhibitors की राहत के कारण एक सामान्य वृद्धि (3 चित्रा) में दोनों सरलीकृत Chelex है और नियमित रूप से बाहर प्रोटोकॉल नमक भुरकना के लिए हुई. हालांकि, इस वृद्धि के सांख्यिकीय महत्वपूर्ण Chelex अर्क (पी 0.039 =) पर डीएनए गुणवत्ता (ND4 पीसीआर) के लिए छोड़कर नहीं था. पी. पर प्रतिबंध ऐल्लि विशेष एंजाइम पाचन फाल्सीपेरम DHFR (या अन्य लक्ष्य जीन) amplicon दवा प्रतिरोध alleles (लार ग्रंथि डेटा नहीं दिखाया चित्रा 4) के लिए मध्य पेट और लार ग्रंथि मलेरिया संक्रमण की जीनोटाइपिंग के लिए सक्षम बनाता है.

सरल Chelex प्रक्रिया मानक प्रक्रिया के बाहर नमकीन
कदम अभिकर्मकों कदम अभिकर्मकों
  1. 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब नमूना जोड़ें और 1X पीबीएस / 1% Saponin समाधान (2 मिनट) के 100 μl में homogenize.
  2. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए छोड़ दें.
  3. 2 मिनट के लिए 20,000 XG पर स्पिन और तैरनेवाला त्यागें.
  4. 1X पीबीएस के 100 μl जोड़ें और क्षण भर vortexing (3 सेकंड) धीरे मिश्रण.
  5. 2 मिनट के लिए 20,000 XG पर स्पिन और तैरनेवाला त्यागें.
  6. विआयनीकृत पानी और 75 μl बाँझ विआयनीकृत पानी में 20% w / v Chelex की 25 μl जोड़ें.
  7. पियर्स नमूना 10 मिनट के लिए गर्म, बाँझ 23g चमड़े के नीचे सुई और फोड़ा ट्यूब सामग्री का उपयोग ट्यूब के ढक्कन में छेद.
  8. 2 microfuge ट्यूब स्पिन1 मिनट के लिए 0000 XG.
  9. बाँझ prelabeled और -20 ° सी (25 μl पीसीआर प्रतिक्रिया में 2.5 μl) का उपयोग करें जब तक दुकान डीएनए समाधान शीशी में तैरनेवाला स्थानांतरण.

पीबीएस


Saponin

Chelex-100 मोती

  1. 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब नमूना जोड़ें और 1% DEPC (2 मिनट) के साथ 100 μl शराबी बफर * homogenize.
  2. 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. 15 μl ठंड 8 एम पोटेशियम एसीटेट जोड़ें. धीरे मिक्स और 45 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  4. Microfuge ट्यूबों में 10 मिनट और एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब तैरनेवाला स्थानांतरण के लिए 20,000 XG पर नमूना स्पिन.
  5. 100% इथेनॉल के 250 μl जोड़ें और inverting ट्यूब द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से.
  6. आरटी पर 5 मिनट के लिए नमूना सेते हैं.
  7. 15 मिनट के लिए 20,000 XG पर नमूने स्पिन.
  8. Aspirate और तैरनेवाला त्यागें, ट्यूब में गोली पूरी तरह से सूखे छोड़ने के लिए (30 मी).
  9. 0.1X एसएससी (10 ग्राम / एमएल) RNase 4 में रात भर के 20 μl में Resuspend गोली ° सी.
  10. 80 μl DEPC पानी का उपयोग करें और जब तक दुकान -20 डिग्री सेल्सियस में जोड़ें.

Diethylpyrocarbonate (DEPC)
* शराबी बफर:
0.1 एम NaCl
0.2 एम सूकरोज
0.1 एम Tris - एचसीएल


0.05 एम EDTA, पीएच 9.1


DEPC पानी में 0.5% एसडीएस

8 एम पोटेशियम एसीटेट

इथेनॉल

0.1X खारा सोडियम साइट्रेट बफर (एसएससी)

RNase (10 ग्राम / एमएल)

कुल समय: 37 मिनट कुल समय: 2 घंटे 47 मिनट, प्लस रातोंरात

तालिका 1 और अभिकर्मकों सरल Chelex प्रोटोकॉल के लिए समय की आवश्यकताओं के कदम की तुलना से कदम और खड़ेअर्द बाहर मच्छर नमूनों से डीएनए निष्कर्षण के लिए विधि नमक भुरकना.

चित्रा 1
चित्रा 1. सरलीकृत Chelex "सी" से ND4 mitochondrial डीएनए गुणवत्ता की पीसीआर और तुलना एनोफ़ेलीज़ arabiensis क्षेत्र के नमूने पर 'एम' के अर्क नमक भुरकना मानक. नेकां, नकारात्मक नियंत्रण, M1 और M2 C1 और C2, एम 3 और C3, और M4 और C4 बाहर नमक भुरकना और ही एक से Chelex निष्कर्षों बनती हैं. arabiensis मच्छर नमूनों. एल, 100 बीपी डीएनए सीढ़ी.

चित्रा 2
चित्रा 2 एनोफ़ेलीज़ arabiensis के लिए आण्विक पहचान पीसीआर C1 और C2 M1 और M2, C3 और एम 3 C4, और M4 बाहर नमकीन "एम" और सरलीकृत Chelex "सी" एक ही मच्छर के नमूनों के लिए डीएनए के अर्क से संबंधित amplicon निरूपित. ए.आर., एनोफ़ेलीज़ arabiensisसकारात्मक नियंत्रण, एल, 100 बीपी डीएनए सीढ़ी.

चित्रा 3
3 चित्रा और Chelex मच्छर क्षेत्र के नमूने के लिए डीएनए के अर्क नमक भुरकना एनोफ़ेलीज़ arabiensis (AR) 10, सन्धिपाद NADH डिहाइड्रोजनेज 4 जीन (ND4) डीएनए गुणवत्ता परीक्षण 11, और antifolate दवा प्रतिरोध पी के आणविक पहचान के लिए पीसीआर assays के साथ, पर सकारात्मक की जांच. . फाल्सीपेरम DHFR 12 जीनोटाइपिंग (F-M4) assays प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ या बिना BSA चलाने के लिए दिखाया परिणाम. है McNemar ची के वर्ग परीक्षण के लिए निर्धारित करती है कि डीएनए से सकारात्मक PCRs के प्रतिशत के बीच मतभेद सरलीकृत Chelex से निकाले और प्रोटोकॉल नमक भुरकना मानक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण थे करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

चित्रा 4
पी. में आवेदन एनजी. मच्छरों में दवा प्रतिरोध alleles के लिए फाल्सीपेरम संक्रमण (मध्य आंत डेटा दिखाया गया है). BstN मैं amplicon पर पाचन पी. के 108 codon flanking फाल्सीपेरम DHFR 12 जीन मच्छर नमूने (, मध्य आंत डेटा दिखाया M1-M5) में cycloguanil प्रतिरोधी S108T म्यूटेंट से पता चलता है. यू, पचाया नहीं 522 बीपी amplicon, FCR3, प्रयोगशाला मानक पी. फाल्सीपेरम सकारात्मक नियंत्रण S108T ले जाने क्लोन, K1, पी. फाल्सीपेरम प्रयोगशाला क्लोन नकारात्मक cycloguanil संवेदनशील S108N ले नियंत्रण मानक, एल, 100 बीपी डीएनए सीढ़ी.

Discussion

सरलीकृत Chelex यहाँ प्रस्तुत विधि गुणवत्ता एनोफ़ेलीज़ एसपीपी और पी. की निकासी के लिए सक्षम बनाता है फाल्सीपेरम मच्छर विविध पीसीआर अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदायी नमूनों से डीएनए. इस तकनीक मलेरिया वेक्टर मच्छरों की आणविक पहचान और दवा प्रतिरोधी पी. की निगरानी के लिए नियोजित किया जा सकता है राष्ट्रीय मलेरिया नियंत्रण कार्यक्रम के लिए मच्छरों फाल्सीपेरम alleles. सरलीकृत Chelex तकनीक का लाभ सरलता, कम अभिकर्मकों और इसलिए लागत, सुरक्षा और कम नमक भुरकना विधि 10 (2 घंटा 47 मिनट और एक रात में कदम, टेबल 1) के रूप में इस तरह के मानक प्रोटोकॉल से प्रसंस्करण समय (37 मिनट) शामिल हैं. aforementioned फायदे और न्यूनतम अभिकर्मक आवश्यकताओं (3 अभिकर्मकों) वर्तमान मानक प्रोटोकॉल (10 अभिकर्मकों, 1 टेबल) 11,15 तुलना, सरलीकृत Chelex प्रोटोकॉल विशेष रूप से स्थानिकमारी वाले देश में, जहां एक निरंतर अभिकर्मक प्रयोगशालाओं के लिए अनुकूल बनाने केआपूर्ति श्रृंखला अक्सर को बनाए रखना मुश्किल है. विधि की एक सीमा है कि मानक प्रोटोकॉल की तरह, यह भी पीसीआर मच्छर 16 झिल्ली में हो जाता inhibitors के अधीन था. हालांकि, यह आसानी से BSA के assays में शामिल किए जाने से राहत मिली है. BSA भी सफलतापूर्वक किया गया है अन्य पीसीआर 17,18 अनुप्रयोगों में inhibitors के खिलाफ एक प्रवर्धन बढ़ाने के रूप में कार्यरत हैं.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों Macha के प्रमुखों headmen, और उनके unwaveing ​​मच्छर क्षेत्र नमूना संग्रह के दौरान सहयोग के लिए समुदायों के लिए आभारी हैं. डॉ. डौग Norris और रिबका केंट बाहर नमक भुरकना प्रोटोकॉल पर अमूल्य विशेषज्ञता की पेशकश की. इस काम जॉन्स हॉपकिंस मलेरिया अनुसंधान संस्थान पायलट अनुदान प्रणाली द्वारा वित्त पोषित किया गया था. मच्छर और परजीवी डीएनए प्रयोगशाला मानकों कृपया MR4, अमेरिकी प्रकार और संस्कृति संग्रह द्वारा दान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chelex-100, 50-100 dry mesh BioRad #143-2832
Saponin SIGMA 142-7425
BSA New England Biolabs B9001S

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References

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Musapa, M., Kumwenda, T., Mkulama,… More

Musapa, M., Kumwenda, T., Mkulama, M., Chishimba, S., Norris, D. E., Thuma, P. E., Mharakurwa, S. A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.. J. Vis. Exp. (71), e3281, doi:10.3791/3281 (2013).

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