Summary
En rask og rimelig måte å hente kvalitet malariaparasitten og vektor-DNA fra mygg prøver er beskrevet. Utnytte chelaterende egenskaper Chelex harpiks, muliggjør den enkle metoden genotyping av malariaparasitter i mygg midten gut og spyttkjertel faser samt molekylær identifisering av
Abstract
Endemiske land blir stadig vedta molekylære verktøy for effektiv skriving, identifisering og overvåking mot malaria parasitter og vektor mygg, som en integrert del av deres kontrollprogrammer 1,2,3,4,5. For bærekraftig etablering av disse nøyaktige tilnærminger i drift forskning for å styrke malaria kontroll og eliminering innsats, enkle og rimelige metoder, med parsimonious reagens og utstyr krav er avgjørende 6,7,8. Her presenterer vi en enkel Chelex-basert teknikk for å trekke malariaparasitten og vektor-DNA fra feltet samlet mygg prøver.
Vi morfologisk identifiserte 72 Anopheles gambiae sl. Fra 156 mygg fanget av pyrethrum spray fanger i sove rom av husholdninger innenfor en 2000 km 2 nærhet av Malaria Institute ved Macha. Etter disseksjon å skille hodet og thorax fra magen for alle 72 Anopheles gambiae sl. mygg, ble de to seksjoner individuelt plassert i 1,5 ml mikrosentrifugerør og neddykket i 20 pl deionisert vann. Ved hjelp av en steril pipettespiss ble hver mygg seksjon separat homogenisert til en ensartet suspensjon i deionisert vann. Av den påfølgende homogenatet fra hver mygg seksjon ble 10 pl beholdes mens andre 10 ul ble overført til en separat autoklaverte 1,5 ml rør. De separate aliquoter ble underkastet DNA-ekstraksjon av enten forenklet Chelex eller standarden utsalting ekstraksjon protokoll 9,10. Den utsalting protokollen er såkalte og mye brukt fordi den benytter høye saltkonsentrasjoner i stedet for farlige organiske løsningsmidler (som for eksempel fenol-og kloroform) for proteinet utfellingstrinnet under DNA ekstraksjon 9.
Ekstrakter ble brukt som maler for PCR forsterkning ved hjelp av primere rettet arthropod mitokondrie nikotinamidadenindinukleotid dehydrogenase (NADH) subenheten 4 genet (ND4) for å sjekke DNA kvalitet 11, en PCR for identifisering av Anopheles gambiae søsken arter 10 og en nestet PCR for å skrive av Plasmodium falciparum infeksjon 12. Sammenligning med DNA kvalitet (ND4) PCR viste 93% sensitivitet og 82% spesifisitet for Chelex tilnærmingen forhold til den etablerte utsalting protokollen. Tilsvarende verdiene av sensitivitet og spesifisitet var 100% og 78%, henholdsvis, ved hjelp av søsken artsidentifikasjon PCR og 92% og 80%, henholdsvis for P. falciparum deteksjon PCR. Det var ingen signifikante forskjeller i andelen av prøver gir amplikon signal med Chelex eller vanlig utsalting protokoll tvers av alle tre PCR applikasjoner. Den Chelex tilnærming kreves tre enkle reagenser og 37 min for å fullføre, mens salting ut protokollen innebar 10 forskjellige reagenser og 2 t og 47 min 'saksbehandlingstid, inkludert en overnatting trinn. Våre resultater viser thpå Chelex metoden er sammenlignbar med den eksisterende utsalting ekstraksjon og kan være substituert som en enkel og bærekraftig tilnærming i ressurs-begrensede settinger hvor en konstant reagens forsyningskjede er ofte vanskelig å opprettholde.
Protocol
1. Forberedende Disseksjon av Mosquito Prøver
- Sted mygg på en liten klippe av parafilm og montere på disseksjonsmikroskop.
- Dekker i dråpe av avionisert vann for å mykne vev.
- Incise mygg kadaveret nettopp ved skjøten mellom brystkasse og buk, og dermed nicking av hodet og thorax fra buk delen.
- Overfør hver dissekerte mygg avsnitt i en ren autoklaveres 1,5 ml mikrosentrifugerør prelabeled med mygg ID-nummeret detaljer og riktig merket for å betegne hoveddel (for eksempel "m" for mid-gut delen, "ht" for hode og thorax-delen).
- Kast parafilm og tørk forsiktig mikroskop scenen med 70% alkohol-fuktet Kimwipe før behandlingen av neste mygg.
2. DNA-ekstraksjon fra Mosquito Prøver
- Pipetter 20 ul avionisert vann i prøverøret og bruk pipettespissen å male det nedsenkede mygg avsnitt i en uniform suspensjon.
- Legg 100fil autoklaverte 1X PBS / 1% Saponin løsning til prøven homogenat og bland ved skånsom momentan virvling.
- Inkuber ved romtemperatur i 20 min.
- Sentrifuger ved 20.000 xg i 2 min og kast supernatant.
- Gjensuspender pellet i 100 ul 1X PBS.
- Sentrifuger igjen ved 20.000 xg i 2 min og kast supernatant.
- Av milde virvling (5 sek), resuspender pelleten i 75 pl sterilt avionisert vann og 25 pl av 20% w / v Chelex-100 harpiks suspensjon i deionisert vann.
- Pierce hull i lokket på prøverør ved bruk av sterilt 23G kanyle flamed i Bunsen-brenner.
- Koke prøven suspensjon i vannbad på flytende risten (eller i varmeblokk) i 10 min.
- Sentrifuger ved 20.000 xg, i 1 min og overføring påfølgende DNA-løsningen inn prelabeled lagring hetteglass for bruk som mal i PCR applikasjoner.
3. Plasmodium falciparum Genotyping og AnophelesSPP. Molekylær identifikasjon
- Legg 2,5 ul av den Chelex DNA ekstrakt i 25 pl PCR-reaksjoner for å sjekke DNA kvalitet 11, identifisere Anopheles arter 10 og til genotype P. falciparum 12 mid-gut og spyttkjertel infeksjoner.
- For å maksimere amplikon utbytte, spesielt for P. falciparum deteksjon inkluderer 1,5 X bovint serumalbumin (BSA) i PCR analysen. Følgende reaksjonstrinn sammensetning anbefales: (2,5 pl mal, 0,25 uM primere, 1,5 uM magnesiumklorid 200 uM dNTPs, 1X PCR buffer, 1,5 X BSA og 1.0U Taq DNA polymerase, i 25 pl volumer).
- For å se etter DNA kvalitet i ekstrakt, forsterke regionen i arthropod mitokondrie nikotinamidadenindinukleotid dehydrogenase (NADH) subenheten 4 (ND4) genet (primere ND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR CCT AA-3 '] og ND4RV [5' -CTT CGD CTT CCW ADW CGT TC-3 ']; forvente produkt 400bp) 11,13.
- Å skille Anopheles gambiae SL. søsken arter (An. gambiae ss og An. arabiensis bare), forsterke region flankerer SNPs i intergeniske spacer (IGS) region, (grunning FN [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; forvente produktet 390bp En gambiae ss, 315bp En arabiensis) 10,11.
- For å skrive P. falciparum antifolate resistens polymorfismer, utføre nestet PCR å forsterke region flankerer aminosyre kodon 108, 51, 59, 16 og 164 i parasitten dihydrofolatreduktase (DHFR) genet:
Primære runde primere: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] og M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
Sekundære runde primere: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] med F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
Eller
F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] med M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
Også forsterke region som inneholder aminosyren kodon 436, 437, 540, 581 and 613 i P. falciparum dihydropteroate syntetase (DHPS) genet:
Primær runde primere R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] med R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
Sekundære runde primere
J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] med K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']
Eller
K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] med K /,
Eller
L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] med L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] 12. - Subject 4 pl fragment til allel-spesifikke restriksjoner enzymet digestions i 30 ul reaksjoner etter produsentens instruksjoner, for å oppdage antifolate narkotika resistensassosierte polymorfismer 12.
- Subject 5 ul PCR fragment (eller 15 pl begrensning digest) per kjørefelt av etidiumbromid-farget 2% agarose gel elektroforese (100 - 120V) og visualisere band under UV transillumination.
Representative Results
Eksempler på resultater fra PCR-analyser for mygg DNA ekstrakt kvalitet (Figur 1), Anopheles arabiensis molekylær identifisering (figur 2) og P. falciparum deteksjon (figur 3) viser at den forenklede Chelex metode gir lignende resultater til standarden utsalting protokoll 10, til tross for mye færre trinn (tabell 1). Med sammenlignbare DNA kvalitet i de respektive ekstrakter er det ikke overraskende at prøven positivitet priser med hensyn til en. gambiae søsken arter samt parasitt infeksjon priser var ikke statistisk forskjellig basert på McNemar er chi-kvadrat-test (figur 3).
Sensitivitet (%) ble beregnet som TP / (TP + fn) * 100, hvor TP betegner sanne positive og FN betegner falske negativer. Spesifisitet (%) ble bestemt som TN / (TN + FP) * 100, hvor TN betegner sanne negativer og FP betegner falske positiver. DNA kvalitet (ND4) PCR viste 93% sensitivitet og 82% spesifisitet for Chelex tilnærming sammenlignet den etablerte utsalting protokoll som gull-standarden. Tilsvarende verdiene av sensitivitet og spesifisitet var 100% og 78%, henholdsvis, ved hjelp av søsken artsidentifikasjon PCR og 92% og 80%, henholdsvis for P. falciparum deteksjon PCR.
Tilsetningen av BSA til reaksjonsblandinger resulterte i en generell økning av PCR positiver (figur 3) på grunn av avlastning av PCR hemmere 14, for både det forenklede Chelex og regelmessig utsalting protokollen. Men var denne økningen ikke statistisk signifikant med unntak for DNA kvalitet (ND4 PCR) på Chelex ekstrakter (p = 0,039). Allel-spesifikk restriksjonsenzym fordøyelsen på P. falciparum DHFR (eller andre mål genet) fragment muliggjør genotyping av mid-gut og spyttkjertel malaria infeksjoner for narkotika motstand alleler (figur 4; spyttkjertelsvulster data ikke vist).
| Enkel Chelex Prosedyre | Standard Salting ut Prosedyre | ||
| Trinn | Reagenser | Trinn | Reagenser |
| PBS
Chelex-100 perler |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)
8 M Kalium acetat Etanol 0.1X Saline natriumcitrat (SSC) buffer RNase (10 ug / ml) |
| TOTAL TID: 37 min | TOTAL TID: 2 t 47 min, pluss overnatting | ||
Tabell 1. Steg for steg sammenligning av reagenser og tidskrav for enkel Chelex protokollen og ståard utsalting metode for DNA-ekstraksjon fra mygg prøver.
Figur 1. ND4 mitokondrie PCR sammenligning av DNA kvalitet fra forenklet Chelex "C" og standard utsalting "M" ekstrakter på Anopheles arabiensis feltprøver. NC, negativ kontroll, M1 og C1, M2 og C2, M3 og C3, og M4 og C4 er sammenkoblet salting ut og Chelex utdrag fra samme An. arabiensis mygg prøver. L, 100 bp DNA stigen.
Figur 2 molekylær identifisering PCR for Anopheles arabiensis C1 og M1, C2 og M2, C3 og M3, C4 og M4 betegne respektive fragment frå salting ut "M" og forenklet Chelex "C" DNA ekstrakter for samme mygg prøver;.. AR, Anopheles arabiensispositiv kontroll, L, 100 bp DNA stigen.
Figur 3. Påvisning av positive på Chelex og salting ut DNA ekstrakter for mygg feltprøver, med PCR-analyser for molekylær identifisering av Anopheles arabiensis (AR) 10, arthropod NADH dehydrogenase genet 4 (ND4) DNA kvalitet 11 test, og antifolate legemiddelresistens P . falciparum DHFR genotyping 12 (F-M4). Resultatene som vises for analyser kjøres med eller uten BSA i reaksjonsblandingen. McNemar er chi-kvadrat-test ble brukt til å avgjøre om forskjellene mellom prosent av positive PCRs fra DNA ekstrahert fra den forenklede Chelex og standard utsalting protokoller var statistisk signifikant.
Discussion
Den forenklede Chelex metoden presentert her gjør utvinning av kvalitet Anopheles spp. og P. falciparum DNA fra mygg prøver mottagelig for ulike PCR-applikasjoner. Denne teknikken kan benyttes for molekylær identifisering av malaria vektor mygg og overvåking av multiresistent P. falciparum alleler i mygg for nasjonale malaria kontrollprogrammer. Fordelene med den forenklede Chelex teknikken inkluderer enkelhet, færre reagenser og dermed kostnader, sikkerhet og kortere behandlingstid (37 min) enn standard protokoller som utsalting metoden 10 (2 hr 47 min og en overnatting trinn, Tabell 1). De nevnte fordeler og minimale reagens krav (3 reagenser) i forhold til dagens standard protokoll (10 reagenser, Tabell 1) 11,15, få forenklet Chelex protokollen spesielt vennlig til endemiske land laboratorier hvor en konstant reagensforsyningskjede er ofte vanskelig å opprettholde. En begrensning av metoden er at som standard protokoll, var det også underlagt PCR-hemmere forekommer i myggen integument 16. Dette er imidlertid lett lindret av inkludering av BSA i analysene. BSA har også blitt ansatt som en forsterkning enhancer mot hemmere i andre PCR-programmer 17,18.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne står i gjeld til høvdinger, headmen og lokalsamfunn i Macha for deres unwaveing samarbeider under mygg feltet sample samlinger. Dr Doug Norris og Rebekka Kent tilbudt uvurderlig kompetanse på salting ut protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av Johns Hopkins Malaria Research Institute pilot stipendordninger. Mygg og parasitt DNA laboratorium standarder var vennlig donert av MR4, American Type & Culture Collection.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
| Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
| BSA | New England Biolabs | B9001S |
References
- Bonnet, M., et al. Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore. Malar. J. 6, 54 (2007).
- Nsimba, B., et al. Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy. Malar. J. 7, 31 (2008).
- Oyewole, I. O., et al. Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria. J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).
- Harris, I., et al. A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting. Malar. J. . 9, 254 (2010).
- Ouedraogo, A. L., et al. Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission. PLoS ONE. 4, e8410 (2009).
- Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery. Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).
- Ishengoma, D. R., et al. Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases. Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).
- Alonso, P. L., et al. A research agenda for malaria eradication: vector control. PLoS Med. 8, e1000401 (2011).
- Grimberg, J., et al. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 17, 8390 (1989).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion. Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).
- Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).
- Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).
- Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).
- Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes. Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).
- Al-Soud, W. A., Radstrom, P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR. J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).
