Summary
Enregistrements extracellulaires de l'activité neuronale en utilisant des sondes de silicium chez le rat anesthésié seront décrites. Cette technique permet d'obtenir des informations à travers de multiples zones du cerveau de plus de 100 neurones simultanément. Il fournit des informations avec une résolution cellule unique sur la dynamique des ensembles neuronaux dans de multiples circuits locaux.
Abstract
À grande échelle à partir des enregistrements électrophysiologiques ensembles neuronaux offrent l'occasion d'étudier comment le cerveau orchestre de la grande variété des comportements de l'activité de dopage de ses neurones. Une des méthodes les plus efficaces pour surveiller l'activité de dopage à partir d'un grand nombre de neurones dans plusieurs circuits neuronaux locaux est à la fois en utilisant des tableaux électrode de silicium 1-3.
Les potentiels d'action de produire de grandes variations de tension transmembranaire dans le voisinage de corps cellulaires. Ces signaux de sortie peut être mesurée en plaçant un conducteur à proximité d'un neurone. Si il ya beaucoup d'actifs (fortification) neurones dans le voisinage de la pointe, l'électrode de signal combiné dossiers de chacun d'eux, où la contribution d'un seul neurone est pondéré par sa "distance électrique". Sondes de silicium sont électrodes d'enregistrement idéal pour surveiller les neurones multiples en raison d'un grand nombre de sites d'enregistrement (64) et un petit volume. Furthermore, plusieurs sites peuvent être organisées sur une distance de quelques millimètres, permettant ainsi l'enregistrement simultané de l'activité neuronale dans les différentes couches corticales ou plusieurs colonnes corticales (fig. 1). Surtout, la distribution géométrique précise des sites d'enregistrement permet également pour la détermination de la relation spatiale des 4 isolés neurones individuels. Ici, nous décrivons une affection aiguë, à grande échelle d'enregistrement des neurones du cortex gauche et à droite forelimb somatosensoriel simultanément dans un rat anesthésié avec des sondes de silicium (Fig. 2).
Protocol
1. Préparation Chirurgie
- Anesthésier le rat avec le type et la dose d'anesthésiques. Ici, nous utilisons l'uréthane (1,5 g / kg, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) - préparé comme solution à 20% en diluant 20 g d'uréthane dans 100 ml de tampon phosphate salin (PBS) à savoir les animaux recevront 7,5 ml / kg par voie intrapéritonéale solution d'uréthane (IP). En raison de sa courbe dose-réponse, la dose totale d'uréthane est divisé en quatre applications, chacune séparée par environ 30 minutes. Avant les deux premières demandes d'uréthane, un animal est anesthésié avec l'isoflurane administré à une concentration de 3-4% (oxygène à 2 litres par minute) et maintenu à 2% (oxygène jusqu'à 2 litres par minute) pour empêcher un animal de stressée par injection. Pendant la chirurgie, une administration supplémentaire de isofluorane (concentration de 2% pendant 2 minutes) peuvent être utilisés si nécessaire.
- Rasez les poils le long du site d'incision (face dorsale de la tête) afin de s'assurer quela fourrure ne sera pas contaminer la plaie et qu'une superficie suffisante peut être désinfectée à travers le site de l'incision.
- Préparer site chirurgical antiseptique à l'aide d'iode organique ou du savon de chlorhexidine et antiseptiques (éthanol).
- Préparer les sondes de silicium (Technologies NeuroNexus, Ann Arbor, MI). Les sondes peuvent être désinfectés à l'aide d'éthanol à 70%, suivi par un rinçage à l'eau distillée. Si nécessaire, les sondes peuvent être peintes avec un marqueur fluorescent préparé antiseptique (teinture par exemple moi, Invitrogen Co.), au plus tard, révèlent la position de la sonde dans l'analyse histologique. Pour ce faire nous utilisons un petit pinceau et très douce et délicatement toucher l'arrière de la sonde de silicium avec le colorant. Cette procédure devrait toujours être faite sur un microscope pour s'assurer que la sonde n'est pas d'être endommagé ou plié. Toujours vérifier pour s'assurer que le colorant n'est pas bloquant l'un des canaux. Tout colorant résiduel laissé sur la sonde peut être enlevée plus tard avec de l'alcool, suivi d'un rinçage avec de l'eau.
- Silicon Electrodees de soins: en raison de leur petite taille, les sondes de silicium sont délicats et extrêmement sensibles à la rupture, même lorsque vous l'utilisez avec un soin considérable. Ainsi, nous recommandons de surveiller les dangers potentiels, à tout moment, tels que: (i) Gardez les sondes dans une boîte appropriée désignée, (ii) Empêcher s'écraser ou de laisser tomber les sondes lors de leur manipulation, (iii) S'assurer que les manipulateurs stéréotaxique sont bien fixés pour prévenir tout accident, (iv) Lors de l'enregistrement, les tissus environnants et / ou de sang peut se rattacher à des sondes. Par conséquent, il est important d'être aussi prudent lorsque vous retirez les sondes après l'enregistrement. Utiliser un flux constant de solution de PBS ou de solution saline est fortement recommandé, (v) Il faut toujours nettoyer les sondes après l'enregistrement. Pour nettoyer les sondes, il est fortement recommandé de les submerger dans un détergent liquide enzymatique (Boston, Bausch & Lomb) pendant quelques minutes. Toujours rincer les sondes avec de l'eau distillée et les retourner à leur boîte dédiée. Dans notre expérience, des soins adéquats des sondes de silicium assureenregistrements de bonne qualité depuis plus de 10 expériences. Si un canal »devient bruyant" lors de l'utilisation, il devrait être exclu des analyses ultérieures. Nous avons constaté que la diaphonie entre canaux est minime; donc un canal bruyant a généralement très peu d'effet sur un signal dans les autres canaux.
2. Chirurgie
- Appliquer une pommade sur les yeux surface de l'œil avant toute manipulation chirurgicale.
- Administrer dexaméthasone 5 mg / ml par voie sous cutanée pour réduire l'inflammation cérébrale.
- Fixer l'animal dans toute la chirurgie cadre stéréotaxique.
- Administrer chlorhydrate de lidocaïne 2% avec épinéphrine (2-4 mg / kg dilué à une solution à 0,5%) sous-cutanée à l'endroit de l'incision, avant l'incision est faite pour réduire le risque potentiel de l'hémorragie de la plaie et pour l'anesthésie locale.
- Faire une incision de 2 cm grâce à la ligne médiane du cuir chevelu et de déplacer la peau en dehors pour exposer la surface du crâne.
- Effacer le cuir chevelu dorsale du fascia par dissection et le contrôlel'hémorragie en microcautery ou en utilisant de la cire d'os.
- Faites deux trous de forage à attacher de petites vis dans l'os occipital du crâne pour les animaux et la terre de référence. La vis de référence doit être en contact avec mère. Afin de réduire le bruit électrique pendant les enregistrements, il est recommandé de garder les vis humide en tout temps. Pour ce faire, une petite barrière qui entoure la vis en acrylique peuvent être construits ou les vis peuvent être couverts avec de l'agar.
- Faire une craniotomie 1-2 mm de diamètre dans les coordonnées correspondant à la zone corticale et / ou sous-corticales (s) d'intérêt 5. Utiliser l'air comprimé pour enlever la poussière d'os au besoin pendant une craniotomie (trou de forage). Empêcher le crâne échauffement du forage en appliquant des gouttes de PBS. Faire une craniotomie secondes si nécessaire pour insérer la deuxième sonde. Dans cette vidéo, nous vous présentons un enregistrement à partir de deux aires corticales simultanément, donc deux craniotomies sont faites.
- Construire une petite barrière de résine acrylique (par exemple: Lang dentaireFabrication, Co., Inc, Wheeting, IL) qui entoure les deux craniotomies afin de garder PBS sur le dessus de dure-mère exposée, l'empêchant de se dessécher. Appliquer PBS constante pendant toute l'expérience.
- Ouvrez la dure-mère des deux craniotomies. Deux aiguilles (30 ½ gauge) plié sur la pointe (formant un crochet), peuvent être utilisés pour cette manipulation.
- Fixez le connecteur de la sonde de silicium pour l'manipulatiors stéréotaxique. Les connecteurs sont attachés à un poteau afin d'avoir les jarrets des sondes parfaitement parallèle au manipulateur stéréotaxique. Ceci est crucial pour maintenir les enregistrements stable et éviter d'endommager la sonde.
- Connectez-vis de référence à la broche de silicium sonde de référence. Pour réduire le bruit électrique de la vis de terre doivent être connectés à: i) la terre de la prise de sonde; ii) la masse du châssis de l'appareil d'enregistrement, et iii) le cadre stéréotaxique.
- Placez l'extrémité des sondes de silicium juste en contact avec la pie-mère.
- Introduire lentement èmesondes de silicium électronique et s'assurer que les tiges des sondes de silicium (fig. 1 et 2) peuvent être insérés dans le cerveau sans résistance ou de flexion.
- Abaisser avec précaution les sondes jusqu'à atteindre la zone d'enregistrement désiré. Si nécessaire, ajouter quelques gouttes de PBS sur le haut de craniotomies pour éviter le dessèchement des tissus.
- Parce anesthésie à l'uréthane ne doit être utilisé pour des procédures terminales, l'animal est euthanasié par une injection IP d'au moins 200mg/kg de pentobarbital de sodium dilué à une concentration qui ne dépasse pas 60 mg / ml. Elle est suivie par la décapitation de l'animal.
3. Les résultats représentatifs:
Enregistrements représentant des potentiels de champ local et des activités de dopage sont illustrés dans la Figure 3A. Après avoir effectué le tri pointe (pointes discrimination provenant de différents neurones; fig 3B, C, 6, 7, 8) de silicium enregistrements de sonde offrent la possibilité d'étudier l'activité de la population neuronaux impliqués dans, hd'autres ong, les processus suivants: la mémoire et la prise de décision 9, plasticité 10, relance de codage 11, 12 et l'activité spontanée des effets de divers médicaments 13.
Figure 1. A. Exemple d'une sonde de silicium avec une tige unique est superposé à un montage de neurones reconstruits (courtoisie de S. Sakata 14). B. Exemple d'une sonde avec une configuration tétrode à chacun des huit pattes. C. Schéma d'un le crâne de rat. Les cases vertes représentent l'étendue de la craniotomie sur le cortex somatosensoriel droit et gauche.
Figure 2. Exemple d'expérience avec des sondes de silicium insérés dans le cortex préfrontal et l'hippocampe. Les gouttes de PBS couvrir la craniotomie pour protéger les personnes exposées brain de sécher. Deux vis situées sur le cervelet sera relié à la terre et de référence, respectivement.
Figure 3. A. Image montre 500ms d'un enregistrement électrophysiologiques représentative du potentiel de champ local (LFP) d'une tétrode (note: tension négative est tracée sur l'axe des ordonnées). Insérer montre - une forme d'onde d'un pic B. vues en deux dimensions des grappes unité dans l'espace caractéristique de 1 tétrode.. Chaque cluster représente les pointes d'une seule unité (neurone). C. Moyenne des formes d'onde pic d'unités représentatives (code couleur) à chacun des quatre sites d'enregistrement d'une tétrode unique. D. Waveform énergie (liée à l'amplitude) des pointes enregistrées au cours du temps . Notez les valeurs de l'énergie relativement constante pour chaque unité, ce qui indique un enregistrement stable sur la durée de la période affichée.
Discussion
Ce document montre comment utiliser les réseaux d'électrodes de silicium pour enregistrer à partir grande population de neurones (> 100) dans de multiples aires corticales simultanément. Afin de réussir dans la chirurgie et l'enregistrement, les questions suivantes devraient être envisagées:
- Introduction de la sonde à un endroit désiré: Lors de l'insertion des sondes dans le tissu cérébral, il est possible de causer des dommages considérables. Cela peut entraîner une mauvaise qualité d'unités enregistrées. Pour éviter ce problème, nous recommandons ce qui suit: (i) Introduire les sondes à un angle de certaine (recommandé d'utiliser un angle de 10 degrés). En faisant cela, les dommages dendritiques des neurones enregistrés peuvent être réduites, (ii) Après les sondes sont insérées dans le tissu cérébral, ils sont d'abord abaissé à un rythme plus rapide (environ 50 à 100 microns par 10-30 sec) jusqu'à ce qu'ils obtiennent proche de la zone souhaitée de l'enregistrement. Lorsque les sondes sont environ 200 microns de la zone cible, la position est ajustée plus lentement (environron 10 microns tous les 2 ou 3 minutes).
- La stabilisation des enregistrements: Lorsque les sondes sont dans la zone désignée et de l'activité considérable est détectée (pointes distinctif dans la majorité des canaux), il est recommandé d'attendre environ 30 minutes avant de commencer un enregistrement. Cela permettra aux tissus cérébraux pour stabiliser mécaniquement après l'insertion de sondes et d'assurer un enregistrement plus stable.
- Pulsations du cerveau: Occasionnellement, il est possible de voir la pulsation du cerveau qui peut réduire considérablement la qualité d'un enregistrement. Une petite craniotomie (juste assez d'espace pour répondre de la sonde) peut réduire la pulsation du cerveau dans une zone d'enregistrement. Si nécessaire, la grande citerne peut être perforé. Ceci réduit la pression du fluide cérébro-spinal et diminue les gonflements et la pulsation.
- Silicon sonde de configuration: sondes silicium peut avoir une variété de formes et de configurations de sites d'enregistrement. Par exemple, elles peuvent varier dans le nombre de tiges, la longueur et l'épaisseur des pattes, et dansl'agencement des sites d'enregistrement (par exemple tétrode vs configuration linéaire, voir: www.neuronexustech.com). Le choix de la sonde utilisée avec une configuration spécifique dépend de la question scientifique devant être répondu. Par exemple, si l'objectif est d'enregistrer des populations de neurones dans des endroits multiples en une seule couche spécifique (tel que présenté dans ces enregistrements), le meilleur choix est d'utiliser une sonde avec huit pattes et une configuration tétrode. Cela permet des enregistrements de plusieurs unités uniques à chaque tétrode et d'échantillonnage de huit emplacements dans un laps de 1.4mm. Dans un autre exemple, si quelqu'un souhaite étudier propagations d'activité à travers les couches corticales, le meilleur choix serait d'utiliser une sonde avec une tige avec des sites d'enregistrement régulièrement réparties le long de cette tige qui permet d'enregistrer en plusieurs couches corticales simultanément 14.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé par le CRSNG et l'AHFMR. Les auteurs remercient Mariam Alaverdashvili et Amanda Mauthe-Kaddoura pour les commentaires sur le manuscrit et Hiroe Yamazaki de l'aide sur la préparation chirurgie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urethane | Sigma-Aldrich | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Isoflurane | Benson Medical Instruments | 02241315 | |
| Silicon probes | NeuroNexus Technologies | A 4 X 2 - Tet - 5mm - 150 - 200 – 312 | |
| Dye I (DiIC18(3)) | Invitrogen | 617830 | |
| Dexamethasone 5 | Vétoquinol | 0A0640B | |
| Eye ointment | Vétoquinol | 005165414 | |
| Lidocaine HCl 2% with Epinephrine | Bimeda-MTC | 00141984 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | 1430-B | |
| Electrode manipulator and holder | Kopf Instruments | 960 | |
| Rat ear-bars | Kopf Instruments | 1955 | |
| Rat adaptor | Kopf Instruments | 920 | |
| Anaesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Scalpel | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Scalpel blades | Paragon | 0086 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910 | |
| Screws | Gould Pasteners Limited | 14084701 | |
| Hemostatic forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7130 RS-7211 | |
| 30½ gauge needles | BD Biosciences | 305115 | |
| Micromotor control | Foredom | HP4-917 | |
| Dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5237 | |
| Bone wax | Lukens | M263500 | |
| Compressed air bottle | Falcon BD | 50-10521C | |
| Enzymatic cleaner | Bausch and Lomb | BAUSCH497628 | |
| Distilled water | |||
| Dental acrylic powder | Lang Dental | 1220 | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental | 1404 | |
| Digital Lynx SX System | Neuralynx Inc. | 4SX-Z400 | |
| Cheeta Softwere | Neuralynx Inc. | ||
| Alligator cables |
References
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