Summary
הקלטות תאיים של הפעילות העצבית באמצעות בדיקות סיליקון החולדה הרדים יתוארו. טכניקה זו מאפשרת לקבל מידע על אזורי מוח מרובים יותר מ 100 נוירונים בו זמנית. הוא מספק מידע עם רזולוציה של תא בודד על הדינמיקה בתוך מעגלים עצביים הרכבים מקומיים רבים.
Abstract
בקנה מידה גדול הקלטות אלקטרו מן הרכבים העצבית מציעים את ההזדמנות כדי לחקור כיצד המוח מנצח מגוון רחב של התנהגויות מפעילות spiking של נוירונים שלה. אחת השיטות האפקטיביות ביותר כדי לפקח spiking פעילות ממספר רב של נוירונים מרובים מעגלים עצביים מקומיים בעת ובעונה אחת היא באמצעות אלקטרודה סיליקון מערכים 1-3.
פוטנציאל פעולה גדול לייצר מתח הטרנסממברני שינויים בסביבת somata התא. אותות אלה הפלט ניתן למדוד על ידי הצבת מנצח בסמיכות של נוירון. אם יש הרבה פעילים (spiking) נוירונים באזור קצה, אלקטרודה הרשומות אות בשילוב של כולם, היכן התרומה של נוירון יחיד משוקלל על פי "המרחק חשמל" שלה. בדיקות הסיליקון הם אלקטרודות הקלטה אידיאלי כדי לפקח על נוירונים מרובים בגלל מספר רב של אתרי הקלטה (64) ואת נפח קטן. Furthermoמחדש, באתרים מרובים ניתן לארגן על פני מרחק של מילימטרים, ובכך מאפשר את הקלטות בו זמנית של הפעילות העצבית בקליפת המוח בשכבות שונות או בעמודות מרובות קליפת המוח (איור 1). חשוב לציין, את חלוקת מדויק גאומטרית של אתרי הקלטה מאפשר גם להגדרה של היחסים המרחביים של 4 נוירונים בודדים בודד. כאן, אנו מתארים חריפה, בקנה מידה גדול הקלטה העצבית של קליפת המוח הימני והשמאלי החושית forelimb במקביל עכברוש הרדים עם בדיקות סיליקון (איור 2).
Protocol
1. כירורגיה הכנה
- להרדים את העכברוש עם סוג מנה מתאימה של חומרי הרדמה. כאן אנו משתמשים urethane (1.5 גרם / ק"ג, Sigma-Aldrich ושות', סנט לואיס, מיזורי) - מוכן כפתרון 20% על ידי דילול של 20 גרם urethane ב 100 מ"ל של בופר פוספט (PBS), כלומר בעלי חיים יקבלו 7.5 מ"ל / ק"ג של urethane פתרון intraperitonealy (IP). בשל עקומת המינון שלה, בתגובה, במינון כולל של urethane מחולק לארבעה יישומים, כל אחד בנפרד על ידי כ 30 דקות. לפני שני היישומים הראשונים של urethane, חיה הוא הרדים עם isoflurane מנוהל בריכוז של 3-4% (חמצן 2 ליטר לדקה) ומתוחזק על% 2 (חמצן במהירות של עד 2 ליטר לדקה) כדי למנוע מן החי מקבל הדגיש בזריקה. במהלך הניתוח, הממשל נוספת של isofluorane (בריכוז של 2% למשך 2 דקות) ניתן להשתמש בו במידת הצורך.
- לגלח את הפרווה לאורך באתר חתך (צד הגב של הראש) על מנת להבטיח כיהפרווה לא יזהמו את הפצע כי שטח מספיק ניתן לחטא את החתך סביב האתר.
- הכן את אתר כירורגית חיטוי באמצעות יוד אורגני או סבון chlorhexidine ו חיטוי (אתנול).
- הכן בדיקות סיליקון (NeuroNexus טכנולוגיות, אן ארבור, מישיגן). בדיקות ניתן לחטא באמצעות אתנול 70% ואחריו שטיפה עם מים מזוקקים. במידת הצורך, בדיקות יכול להיות צבוע עם סמן פלואורסצנטי מוכן חיטוי (למשל אני דיי, Invitrogen ושות), מאוחר יותר כדי לחשוף את המיקום של החללית בניתוח היסטולוגית. לשם כך אנו משתמשים במברשת צבע קטנה ורכה מאוד לגעת בעדינות את החלק האחורי של החללית סיליקון עם צבע. הליך זה תמיד צריך להיעשות על מיקרוסקופ כדי לוודא בדיקה לא נמצא פגום או כפוף. בדוק תמיד כדי לוודא שהצבע לא חוסמת כל הערוצים. לצבוע כל שיורי השאיר על החללית ניתן להסיר עם אלכוהול מאוחר יותר, ואחריו שטיפה עם מים.
- הסיליקון electrodטיפול es: בגלל גודלם הקטן, בדיקות סיליקון הם עדין רגיש מאוד לשבור, גם כאשר השימוש בו בזהירות רבה. לכן, מומלץ לעקוב אחר הסיכונים האפשריים בכל עת, כגון: (i) שמור על בדיקות בתיבה המיועדת כראוי (ii) מניעת נשירה מתרסק או בדיקות במהלך הטיפול בהם; (iii) ודא כי המניפולטורים stereotaxic מקובעים היטב כדי למנוע תאונות; (ד) כאשר הקלטה, הרקמה שמסביב ו / או דם ניתן לצרף את הבדיקות. לכן, חשוב להיזהר גם בעת הסרת בדיקות לאחר ההקלטה. באמצעות זרם בלתי פוסק של פתרון PBS או תמיסת מלח מומלץ מאוד; (v) תמיד לנקות את הבדיקות לאחר ההקלטה. כדי לנקות את הבדיקות, מומלץ מאוד להטביע אותם שואב האנזימטית נוזלי (בוסטון, Bausch & Lomb) במשך כמה דקות. תמיד לשטוף את הבדיקות עם מים מזוקקים ולהחזיר אותם תיבת ייעודי שלהם. מניסיוננו, טיפול הולם של בדיקות סיליקון מבטיחהאיכות ההקלטות טוב במשך יותר מ -10 ניסויים. אם ערוץ "מקבל רועש" במהלך השימוש, הוא צריך להיות מחוץ ניתוחים שלאחר מכן. מצאנו כי צולבות לדבר בין הערוצים היא מינימלית, ולכן ערוץ רועש בדרך כלל יש השפעה מועטה מאוד על אות בערוצים אחרים.
2. כירורגיה
- החלת העין משחה על פני העין לפני כל המניפולציות הניתוח.
- ניהול dexamethasone 5 מ"ג / מ"ל מתחת לעור כדי להפחית את הדלקת במוח.
- תקן את חיה בתוך מסגרת stereotaxic לאורך הניתוח.
- ניהול HCl לידוקאין 2% עם אפינפרין (2-4 מ"ג / ק"ג בדילול לפתרון 0.5%) תת עורי באתר חתך לפני החתך עשוי להפחית את הסיכון הפוטנציאלי של הדימום את הפצע עבור הרדמה מקומית.
- ביצוע חתך 2 ס"מ דרך קו האמצע הקרקפת לעקור את העור רוחבית כדי לחשוף את פני הגולגולת.
- נקה את הקרקפת הגבי מ fascia ידי לנתיחה מלאה בוטהאת הדימום על ידי microcautery או באמצעות שעווה העצם.
- הפוך את קידוח שני חורים לצרף ברגים קטנים בעצמות העורפית של הגולגולת עבור הארקה בעלי חיים התייחסות. בורג הפניה חייבת להיות במגע עם הדורה. על מנת להפחית את הרעש חשמל במהלך ההקלטות, מומלץ לשמור את הברגים רטוב כל הזמן. כדי לעשות זאת, מחסום אקריליק קטנים המקיפים את הברגים יכול להיות בנוי או את הברגים יכול להיות מכוסה אגר.
- הפוך craniotomy בקוטר 1-2 מ"מ קואורדינטות המקביל לאזור קליפת המוח ו / או קורטיקליים (ים) של עניין 5. השתמש באוויר דחוס כדי להסיר אבק עצם לפי הצורך במהלך craniotomy (חור הקידוח). מניעת הגולגולת להתחמם מקידוחי על ידי יישום טיפות PBS. הפוך craniotomy השני אם צריך להכניס את החללית השניה. בסרטון הזה, אנו מציגים הקלטה משני אזורים בקליפת המוח בו זמנית, ולכן two craniotomies נעשים.
- בניית מכשול קטן של שרף אקרילי (כגון: לנג שינייםייצור, ושות' בע"מ, Wheeting, IL) המקיף את שני craniotomies כדי לשמור PBS על גבי חשוף הדורה, ומונע ממנו ייבוש. החל PBS ללא הרף במהלך הניסוי כולו.
- פתח את הדורה עניין של craniotomies שניהם. שתי מחטים (30 וחצי מד) bended על קצות (להרכיב וו), עשויה לשמש מניפולציה זו.
- חבר את מחבר של בדיקות סיליקון ל manipulatiors stereotaxic. מחברים מחוברים מוט כדי לקבל את שוקי של בדיקות מקבילות לחלוטין המניפולטור stereotaxic. זה חיוני כדי לשמור על הקלטות יציבה למנוע נזק בדיקה.
- חבר את הבורג התייחסות סיכה התייחסות בדיקה סיליקון. כדי להפחית את הרעש החשמלי את הברגים הקרקע צריך להיות מחובר: א) הקרקע של התקע בדיקה; ii) את הקרקע מארז ממכשיר ההקלטה, ו iii) את המסגרת stereotaxic.
- הניחו את קצה בדיקות סיליקון רק במגע עם פיה.
- לאט לאט להציג את הדואר בדיקות סיליקון לוודא כי שנקס של בדיקות סיליקון (איור 1 & 2) יכול להיות מוכנס לתוך המוח ללא התנגדות או כיפוף.
- בזהירות להוריד את הבדיקות עד שמגיעים לאזור ההקלטה הרצוי. במידת הצורך, להוסיף טיפות של PBS על החלק העליון של craniotomies כדי למנוע התייבשות של הרקמה.
- בגלל הרדמה urethane יש להשתמש רק עבור הליכים הטרמינל, החיה היא להרדים בזריקה ip של 200mg/kg לפחות של נתרן pentobarbital מדולל לריכוז של מ"ג לא יותר מ 60 / מ"ל. זה ואחריו עריפת ראש של החיה.
3. נציג תוצאות:
הקלטות נציג פוטנציאלים בתחום הפעילות המקומית spiking מומחשים איור 3A. לאחר ביצוע מיון ספייק (קוצים להפלות שמקורם נוירונים שונים; איור 3 ב ', ג', 6, 7, 8) סיליקון הקלטות בדיקה לספק את היכולת לחקור את הפעילות העצבית אוכלוסיה מעורבת, אניאונג אחרים, את התהליכים הבאים: זיכרון וקבלת החלטות 9, 10 פלסטיות, גירוי קידוד 11, פעילות ספונטנית 12 ואת ההשפעות של תרופות שונות 13.
באיור 1. דוגמה א 'של בדיקה סיליקון עם שוק יחיד על גבי מונטאז' של נוירונים משוחזר (באדיבות ס סקטה 14). דוגמה ב' של בדיקה עם תצורה tetrode בכל אחד 8 שוקי. סכמטי של C. עכברוש בגולגולת. הקופסאות הירוקות מייצגות את היקף craniotomy מעל קליפת החושית על ימין ועל שמאל.
באיור 2. דוגמה של ניסוי עם בדיקות סיליקון מוכנס בקליפת המוח הקדם חזיתית ההיפוקמפוס ו. טיפות PBS לכסות את craniotomy להגן על br חשוףעין מהתייבשות. שני ברגים ממוקמים מעל במוח הקטן יהיה מחובר לקרקע התייחסות, בהתאמה.
באיור 3. תמונה א 'מראה 500ms של הקלטת אלקטרו נציג פוטנציאל שדה מקומיות (LFP) מ tetrode אחד (שימו לב: מתח שלילי הוא זמם על לתאם). הכנס מציג - צורת גל של עלייה ב 'דו מימדי צפיות של אשכולות יחידה במרחב תכונה tetrode 1.. מקבץ מייצג קוצים מיחידה אחת (נוירון). ג ממוצע ספייק גל מיחידות נציג (בצבעים שונים) בכל אחד מארבעת האתרים הקלטה מ tetrode אחת. ד Waveform אנרגיה (הקשורים אמפליטודה) של קוצים רשמה לאורך זמן . הערה ערכי אנרגיה קבועה יחסית לכל יחידה, זה מעיד על הקלטה יציבה לאורך משך הזמן של התקופה המוצגת.
Discussion
מסמך זה מדגים כיצד להשתמש אלקטרודה arrays סיליקון להקליט אוכלוסייה גדולה של נוירונים (> 100) קליפת המוח באזורים מרובים בו זמנית. על מנת להצליח ניתוח הקלטה, הנושאים הבאים צריך להיחשב:
- מבוא של בדיקות לאזור הרצוי: כאשר מכניסים את בדיקות ברקמת המוח, אפשר לגרום נזק רב. זה יכול לגרום איכות נמוכה של יחידות מוקלט. כדי להימנע מבעיה זו אנו ממליצים על הבאות: (i) הציגו בדיקות בזווית מסוימת (מומלץ להשתמש זווית תואר 10). בעשותם זאת, הנזק הדנדריטים של הנוירונים מוקלט יכול להיות מופחת (ii) לאחר הבדיקות מוכנסים רקמת המוח, הם הוריד תחילה בקצב מהיר (כ 5-10 מיקרון ל 10-30 שניות), עד שהם מקבלים קרוב יותר לאזור הרצוי של ההקלטה. כאשר בדיקות כ -200 מיקרון מאזור היעד, המיקום הוא מותאם יותר לאט (כimately 10 מיקרון כל 2 או 3 דקות).
- ייצוב של הקלטות: כאשר הבדיקות הן באזור המיועד ופעילות רבה מזוהה (דוקרנים בולטים ברוב הערוצים), מומלץ להמתין כ 30 דקות לפני תחילת ההקלטה. זה יאפשר רקמת המוח כדי לייצב מכנית אחרי הכניסה של בדיקות להבטיח הקלטה יציבה יותר.
- פעימה המוח: מדי פעם אפשר לראות פעימה המוח יכול להפחית באופן משמעותי את איכות ההקלטה. Craniotomy קטן (מספיק מקום כדי להתאים את החללית) יכול להפחית את הפעימה המוח באזור ההקלטה. אם יש צורך, צ'יסטרנה magna ניתן ניקב. פעולה זו מפחיתה את הלחץ הנוזל השדרתי ומפחית נפיחות פעימה.
- תצורה הסיליקון בדיקה: בדיקות הסיליקון יכול להיות מגוון של צורות אתר תצורות הקלטה. לדוגמה, הם יכולים להשתנות במספר שוקי, אורך ועובי שנקס, ועלההסדר של אתרים הקלטה (למשל tetrode לעומת תצורה ליניארית, וראו: www.neuronexustech.com). הבחירה לחקור בשימוש עם תצורה מסוימת תלוי בשאלה מדעית צורך להיות ענו. לדוגמה, אם המטרה היא להקליט אוכלוסיות של נוירונים במקומות רבים בשכבה אחת ספציפית (כפי שהוצג הקלטות אלה), הבחירה הטובה ביותר היא להשתמש בדיקה עם שמונה פגיונות תצורה tetrode. זה מאפשר הקלטות של יחידות מרובות בבת אחת tetrode כל דגימה של שמונה מוקדים ברחבי טווח 1.4mm. במקרה אחר, אם מישהו רוצה ללמוד propagations פעילות על פני שכבות בקליפת המוח, הבחירה הטובה ביותר תהיה להשתמש בדיקה עם שוק אחד עם אתרי הקלטה מופץ באופן קבוע לאורך שוק אשר מאפשר הקלטה בשכבות מרובות קורטיקליים 14 בו זמנית.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NSERC & AHFMR. המחברים מודים מרים Alaverdashvili ואמנדה Mauthe-Kaddoura הערות על כתב היד ועל Hiroe ימזאקי לעזרה על הכנת הניתוח.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urethane | Sigma-Aldrich | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Isoflurane | Benson Medical Instruments | 02241315 | |
| Silicon probes | NeuroNexus Technologies | A 4 X 2 - Tet - 5mm - 150 - 200 – 312 | |
| Dye I (DiIC18(3)) | Invitrogen | 617830 | |
| Dexamethasone 5 | Vétoquinol | 0A0640B | |
| Eye ointment | Vétoquinol | 005165414 | |
| Lidocaine HCl 2% with Epinephrine | Bimeda-MTC | 00141984 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | 1430-B | |
| Electrode manipulator and holder | Kopf Instruments | 960 | |
| Rat ear-bars | Kopf Instruments | 1955 | |
| Rat adaptor | Kopf Instruments | 920 | |
| Anaesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Scalpel | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Scalpel blades | Paragon | 0086 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910 | |
| Screws | Gould Pasteners Limited | 14084701 | |
| Hemostatic forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7130 RS-7211 | |
| 30½ gauge needles | BD Biosciences | 305115 | |
| Micromotor control | Foredom | HP4-917 | |
| Dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5237 | |
| Bone wax | Lukens | M263500 | |
| Compressed air bottle | Falcon BD | 50-10521C | |
| Enzymatic cleaner | Bausch and Lomb | BAUSCH497628 | |
| Distilled water | |||
| Dental acrylic powder | Lang Dental | 1220 | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental | 1404 | |
| Digital Lynx SX System | Neuralynx Inc. | 4SX-Z400 | |
| Cheeta Softwere | Neuralynx Inc. | ||
| Alligator cables |
References
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat. Neurosci. 7, 446-451 (2004).
- Kipke, D. R. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J. Neurosci. 28, 11830-11838 (2008).
- Csicsvari, J. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J. Neurophysiol. 90, 1314-1323 (2003).
- Bartho, P. Characterization of neocortical principal cells and interneurons by network interactions and extracellular features. J. Neurophysiol. 92, 600-608 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain: in stereotaxic coordinates. , 4th Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, R53-R78 (1998).
- Harris, K. D., Henze, D. A., Csicsvari, J., Hirase, H., Buzsaki, G. Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements. J. Neurophysiol. 84, 401-414 (2000).
- Luczak, A., Narayanan, N. S. Spectral representation--analyzing single-unit activity in extracellularly recorded neuronal data without spike sorting. J. Neurosci. Methods. 144, 53-61 (2005).
- Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus. Science. 321, 1322-1327 (2008).
- Fujisawa, S., Amarasingham, A., Harrison, M. T., Buzsaki, G. Behavior-dependent short-term assembly dynamics in the medial prefrontal cortex. Nat Neurosci. 11, 823-833 (2008).
- Harris, K. D. How do neurons work together? Lessons from auditory cortex. Hear. Res. 271, 37-53 (2011).
- Luczak, A., Bartho, P., Marguet, S. L., Buzsaki, G., Harris, K. D. Sequential structure of neocortical spontaneous activity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 347-352 (2007).
- Robbe, D. Cannabinoids reveal importance of spike timing coordination in hippocampal function. Nat. Neurosci. 9, 1526-1533 (2006).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64, 404-418 (2009).
