Summary
anesthetized 쥐의 실리콘 프로브를 사용하는의 연결 활동의 세포외 녹음이 설명됩니다. 이 기법은 동시에 100 개 이상의 뉴런에서 여러 뇌 영역에 걸쳐 정보를 얻을 수 있습니다. 그것은 여러 지역의 회로에의 연결을 ensembles 역학에 대한 단세포 해상도 정보를 제공합니다.
Abstract
의 연결을 ensembles에서 대규모 electrophysiological 녹음 두뇌는 뉴런의 급상승 활동에서 행동의 다양한 orchestrates 방법을 조사할 수있는 기회를 제공합니다. 여러 지역의 연결 회로의 뉴런 다수의 활동을 급상승 모니터 가장 효과적인 방법 중 하나는 동시에 1-3 실리콘 전극 배열을 사용하는 것입니다.
액션 잠재력은 세포 somata의 주변에 대형 transmembrane 전압 변화를 생산하고 있습니다. 이러한 출력 신호는 신경 세포의 가까이에 지휘자를 배치하여 측정할 수 있습니다. 팁 주변에 많은 활성 (급상승) 뉴런이있다면, 전극은 단일 신경 세포의 기여가 자사의 '전기 거리'에 의해 가중치를 어디에 모두에서 결합된 신호를 기록합니다. 실리콘 프로브 때문에 기록 사이트 (64)과 작은 볼륨 다수의 여러 뉴런을 모니터 이상 기록 전극입니다. Furthermo다시, 여러 사이트는 따라서 다양한 대뇌 피질의 레이어 또는 여러 피질 열에의 연결 활동의 동시 기록 (그림 1) 수 있도록 밀리미터의 거리 이상의 배열 수 있습니다. 중요한 것은 기록 사이트의 기하학적으로 정확한 분포는 또한 분리된 단일 뉴런 4의 공간 관계의 결정을 허용합니다. 여기, 우리는 실리콘 프로브 (그림 2)와 anesthetized 쥐에서 동시에 왼쪽과 오른쪽 forelimb somatosensory의 피질에서 급성, 대규모의 연결 녹음을 설명합니다.
Protocol
1. 수술 준비
- anesthetics의 적절한 종류와 복용량과 쥐를 마취. 여기에 우리가 우레탄을 (1.5 g / kg, 시그마 - 올드 리치 (주), 세인트 루이스, MO)를 사용 - 인산 100 ML에 우레탄 20 G를 diluting 20 %의 솔루션으로 준비한 동물 즉, 식염수 (PBS)를 버퍼는 7.5을받을 것이다 ML / 우레탄 솔루션 intraperitonealy (IP)의 kg. 때문에 선량 - 반응 곡선의 우레탄의 총 복용량은 네개의 응용 프로그램, 약 30 분 정도로 구분하여 각각에 나뉘어져 있습니다. 우레탄의 처음 두 응용 프로그램을하기 전에 동물에서 동물을 막기 위해 isoflurane 3~4%의 농도 (분당 2리터에서 산소)에 투여 (최대 분당 2리터로에서 산소) 2 %로 유지 함께 anesthetized입니다 주입에 의한 스트레스를 받고. 수술 동안, isofluorane (2 분 2 % 농도)의 추가적인 관리가 필요한 경우 사용할 수 있습니다.
- 그것을 보장하기 위해 절개 사이트 (머리 지느러미 쪽)을 따라 털이 쉐이브털이 상처를 오염시키고 충분한 공간이 절개 사이트 주위 소독 수 없습니다.
- antiseptically 유기 요오드 또는 chlorhexidine의 비누와 소독제 (에탄올)을 사용하여 외과 사이트를 준비합니다.
- 실리콘 프로브를 (NeuroNexus 기술, 앤 아버, MI) 준비. 프로브는 증류수와 rinsing 다음 70 % 에탄올을 사용하여 소독 수 있습니다. 필요한 경우, 프로브는 나중 histological 분석 프로브의 위치를 나타내기 위해 형광 마커 (예 : 염료 I, Invitrogen 주) antiseptically 준비와 그린 수 있습니다. 이렇게하려면 우리는 작고 매우 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 정교한 염료와 실리콘 프로브의 뒷면을 터치. 이 절차는 항상 프로브가 손상되거나 구부 러되고 있지 않은지 확인하기 위해 현미경을 통해 수행되어야합니다. 항상 염색이 채널 중 하나를 차단하고 있지 않은지 확인하십시오. 프로브에 남아있는 잔류 염료는 나중에 물로 rinsing 다음, 알코올로 제거할 수 있습니다.
- 실리콘 electrod초밖에 관리는 : 때문에 그들의 작은 크기의 실리콘 프로브는 섬세하고 상당한 신경을 써서 그것을 사용하는 경우에도 위반 매우 취약하고 있습니다. 따라서, 우리는 다음과 같은 모든 시간에서 잠재적인 위험을 모니터링하는 것이 좋습니다 : (I) 적절하게 지정 상자에 프로브를 유지하고, (ii) 충돌하거나 그들을 다룰 때 프로브를 포기 방지, (3) stereotaxic manipulators 잘 고정되었는지 확인합니다 모든 사고를 방지하기 위해, (4) 기록, 주변 조직 및 / 또는 혈액이 프로브에 연결할 수 있습니다. 따라서, 녹음 후 프로브를 제거 때도 조심해야하는 것이 중요합니다. PBS 또는 생리 식염수의 일정한 흐름을 사용하는 것은 좋습니다, (V) 항상 녹화 후 프로브를 청소하십시오. 프로브를 청소하려면, 그것은 강력하게 몇 분 동안 액체 효소 세제 (보스턴, Bausch & Lomb)에 잠수함 그들에게 권장합니다. 항상 증류수로 프로브를 씻어하고 전용 상자로 돌아갑니다. 우리의 경험에서 실리콘 프로브의 적절한 관리가 보장10 개 이상의 실험을위한 양질의 녹음. 채널이 사용 중 '시끄러운 도착'을한다면, 그것은 이후 분석에서 제외해야합니다. 우리는 채널 간의 상호 대화가 최소 것으로 나타났습니다, 따라서 시끄러운 채널은 일반적으로 다른 채널의 신호에 거의 영향을했습니다.
2. 외과
- 모든 수술 조작하기 전에 눈 표면에 눈을 연고를 바릅니다.
- 뇌의 염증을 줄이기 위해 5 밀리그램 / ML subcutaneously Dexamethasone을 관리할 수 있습니다.
- 수술 전반에 걸쳐 stereotaxic 프레임에서 동물을 고정.
- 절개는 상처의 출혈 및 국소 마취에 대한 잠재적 위험을 줄이기 위해 만들어진되기 전에 절개 사이트에서 subcutaneously 에피네프린 (2-4은 MG / kg 0.5 % 용액으로 희석)와 Lidocaine HCL에게 2 % 관리할 수 있습니다.
- 두피의 중간선을 통해 2cm의 절개를 만들어 두개골 표면을 노출 옆으로 피부를 치환.
- 무딘 절개 및 제어에 의한 근막의 지느러미 두피를 삭제microcautery 또는 뼈 왁스를 사용하여 출혈.
- 동물의 접지 및 참조 두개골의 후두 골에는 작은 나사를 첨부 두 드릴링 구멍을 만듭니다. 참조 나사는 경질과 연락해야합니다. 녹음하는 동안 전기 노이즈를 줄이기 위해, 그것은 항상 서부 유럽 표준시 나사를 유지하는 것이 좋습니다. 이렇게하려면 나사를 둘러싼 작은 아크릴 장벽을 건설하거나 나사는 한천으로 덮여 수 있습니다.
- 관심 5 피질 및 / 또는 subcortical 영역 (들)에 해당하는 좌표에 1-2mm의 직경 craniotomy을 만듭니다. craniotomy (드릴링 구멍) 동안 필요에 따라 뼈 먼지를 제거하는 압축 공기를 사용하십시오. 두개골은 PBS의 방울을 적용하여 시추에서 데워 방지합니다. 두 번째 프로브를 삽입하는 데 필요한 경우 두 번째 craniotomy하십시오. 이 비디오에서는, 우리들은 두 craniotomies이 만들어진, 동시에 두 피질 영역에서 기록을 보여주고 있습니다.
- 랭 치과 : 아크릴 수지의 작은 장벽 (예를 구축제조, 주식 회사, 주식 회사, Wheeting, IL)은 건조에서 예방, 노출 경질 위에 PBS를 유지하기 위해서는 두 craniotomies 주변. 전체 실험 기간 동안 지속적으로 PBS를 적용합니다.
- 두 craniotomies의 경질 물질을 엽니다. 두 바늘 (30 게이지 ½) 팁 (훅을 형성)에 bended,이 조작에 사용할 수 있습니다.
- stereotaxic manipulatiors에 실리콘 프로브의 커넥터를 연결합니다. 커넥터는 stereotaxic 조작하는 사람에 완벽하게 병렬 프로브의 정강이를 위해 기둥에 붙어 있습니다. 이것은 안정적인 레코딩을 유지하고 프로브 손상을 방지하는 데있어 매우 중요합니다.
- 실리콘 프로브 참조 핀에 대한 참조 나사를 연결합니다. , II) 섀시 녹음 장치에서 지상, 그리고 3) stereotaxic 프레임 I) 프로브 플러그의 접지 : 접지 나사가 연결해야 전기 노이즈를 줄일 수 있습니다.
- 단지 PIA 접촉 실리콘 프로브의 끝부분을 놓습니다.
- 천천히 일을 소개합니다전자 실리콘 프로브와 실리콘 프로브 (그림 1 & 2)의 정강이가 저항이나 굽힘없이 두뇌에 삽입될 수 있는지 확인하십시오.
- 조심스럽게 원하는 녹음 영역에 도달 때까지 프로브를 낮춥니다. 필요한 경우, 조직의 건조하지 않도록 craniotomies의 상단에 PBS의 방울을 추가합니다.
- 우레탄 마취에만 터미널 절차에 사용해야하기 때문에, 동물은 나트륨의 최소 200mg/kg의 IP 주입하여 euthanized이다 pentobarbital 더 이상 60 이상의 MG / ML의 농도로 희석. 이것은 동물의 잘린옵니다.
3. 대표 결과 :
현지 필드 잠재력과 요동 치고 활동의 대표 녹음 그림 3A의 그림입니다. 스파이크 정렬을 (; 그림 3B, C, 다른 뉴런에서 발생하는 차별 스파이크 6, 7, 8) 수행 후 실리콘 프로브 녹음은 오전에 관련된 인구의 연결 활동을 조사할 수있는 능력을 제공다른 긴 사연이 다음과 같은 과정 : 9 만들고 메모리와 의사 결정, 소성 10, 자극 코딩 11, 자발적인 활동 12 여러 가지 약물 효과 13.
그림 1. 하나의 칼을 들고 실리콘 프로브의 A. 예제는 재건축 뉴런 (S. 사카타 14 호의)의 몽타주에 겹쳐있다. 8 정강이의 각에서 tetrode 구성과 프로브의 B. 예가.의 C. 도식은 쥐 두개골. 녹색 상자는 오른쪽과 왼쪽 somatosensory 피질 이상 craniotomy의 범위를 나타냅니다.
그림 2. 전두엽 피질과 해마에 삽입된 실리콘 프로브와 실험의 예. PBS의 방울이 노출된 BR을 보호하기 위해 craniotomy를 커버건조에서 아무것도. 소뇌에 두 개의 나사는 각각 지상 및 참조로 연결됩니다.
그림 3. A. 이미지 한 tetrode (부정적인 전압 종좌표에 역모를 참고)에서 현지 필드 잠재력 (LFP)의 대표 electrophysiological 녹음 500ms 보여줍니다. 삽입 보여줍니다 -. 대못 B.의 파형 2 차원 1 tetrode의 기능 공간에서 단위 클러스터의 전망. 각 클러스터는 단일 장치 (신경 세포)의 스파이크를 나타냅니다. 시간이 지남에 따라 하나의 tetrode에서 네 개의 레코딩 사이트의 각 대표 단위에서 C. 평균 스파이크 파형 (컬러 코드).의 D. 파형 에너지 (진폭에 관한) 기록 스파이크가 . 각 단위에 대해 상대적으로 일정한 에너지 값을 참고, 이것은 표시 기간의 기간 동안 안정적인 레코딩을 나타냅니다.
Discussion
본 논문은 동시에 여러 피질 영역에서 뉴런 (> 100)의 대규모 인구에서 기록 실리콘 전극 배열을 사용하는 방법을 보여줍니다. 수술 및 녹화에서 성공하기 위해서는, 다음과 같은 문제가 고려되어야합니다
- 원하는 지역에 프로브 소개 : 뇌 조직에 프로브를 삽입하면, 그것이 상당한 피해를 입을 수 있습니다. 이것은 기록 단위의 낮은 품질이 발생할 수 있습니다. 이 문제를 피하려면 우리는 다음을 추천 :은 (i)는 어느 정도 각도에서 프로브를 (10도 각도를 사용하는 것이 좋습니다) 소개합니다. 이렇게하면 기록된 뉴런의 돌기 피해를 줄일 수 있으며, 프로브는 뇌 조직에 삽입 후 그들이 올 때까지 (2), 그들은 처음에 빠른 속도 (10-30 초 당 약 50-100 마이크론)에서 가만히있어 가까이 녹음의 원하는 영역에. 프로브는 대상 지역에서 200 마이크론에 대해되면 위치 (약 더 느리게 조정됩니다imately 10 미크론 매 2 ~ 3 분).
- 녹음의 안정화가 : 프로브가 지정된 지역에 있고 상당한 활동 (채널의 대부분에 독특한 스파이크)을 감지하면, 그것은 녹음을 시작하기 전에 약 30 분 후에하는 것이 좋습니다. 이것은 뇌 조직이 기계적으로 프로브의 삽입 후 안정화와보다 안정적인 레코딩을 보장하기 위해 수 있습니다.
- 두뇌 맥동 : 때때로 크게 녹음의 품질을 줄일 수 있습니다 뇌 맥동을 볼 수도 있습니다. 작은 craniotomy (프로브에 맞게 충분 공간) 기록 영역에서 뇌 맥동을 줄일 수 있습니다. 필요한 경우, cisterna 마그나는 구멍 수 있습니다. 이것은 중추 신경계의 압력을 감소하고 붓기와 맥동 감소.
- 실리콘 프로브 구성 : 실리콘 프로브는 모양과 기록 사이트 다양한 구성을 할 수 있습니다. 예를 들면, 그들은 정강이, 정강이의 길이와 두께의 수를 다양, 및 수기록 사이트 (; : www.neuronexustech.com 볼 수 예 tetrode 대 선형 구성)의 배열. 특정 구성과 함께 사용 프로브의 선택은 답변에 필요한 과학적인 문제에 따라 다릅니다. 예를 들어, 목표는 한 특정 계층 (이러한 레코딩에 표시)에 여러 위치에서 뉴런의 인구를 기록하는 경우, 최선의 선택 여덟 정강이와 tetrode 구성과 프로브를 사용하는 것입니다. 이것은 1.4mm 기간에 걸쳐 여덟 각각의 위치 tetrode 및 샘플링 번에 여러 개의 단일 단위 기록을 허용합니다. 누군가가 대뇌 피질의 레이어에 걸쳐 활동 propagations를 공부하고자하는 경우 다른 인스턴스에서, 최선의 선택은 여러 피질 레이어에 녹음이 동시에 14 수 칼을 함께 정기적으로 배포 녹음 사이트를 하나의 칼을 들고 프로브를 사용하는 것입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NSERC & AHFMR에 의해 지원되었다. 저자는 수술 준비에 도움을 원고와 Hiroe 야마자키에 대한 의견을 마리암 Alaverdashvili 아만다 Mauthe - Kaddoura 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urethane | Sigma-Aldrich | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Isoflurane | Benson Medical Instruments | 02241315 | |
| Silicon probes | NeuroNexus Technologies | A 4 X 2 - Tet - 5mm - 150 - 200 – 312 | |
| Dye I (DiIC18(3)) | Invitrogen | 617830 | |
| Dexamethasone 5 | Vétoquinol | 0A0640B | |
| Eye ointment | Vétoquinol | 005165414 | |
| Lidocaine HCl 2% with Epinephrine | Bimeda-MTC | 00141984 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | 1430-B | |
| Electrode manipulator and holder | Kopf Instruments | 960 | |
| Rat ear-bars | Kopf Instruments | 1955 | |
| Rat adaptor | Kopf Instruments | 920 | |
| Anaesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Scalpel | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Scalpel blades | Paragon | 0086 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910 | |
| Screws | Gould Pasteners Limited | 14084701 | |
| Hemostatic forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7130 RS-7211 | |
| 30½ gauge needles | BD Biosciences | 305115 | |
| Micromotor control | Foredom | HP4-917 | |
| Dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5237 | |
| Bone wax | Lukens | M263500 | |
| Compressed air bottle | Falcon BD | 50-10521C | |
| Enzymatic cleaner | Bausch and Lomb | BAUSCH497628 | |
| Distilled water | |||
| Dental acrylic powder | Lang Dental | 1220 | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental | 1404 | |
| Digital Lynx SX System | Neuralynx Inc. | 4SX-Z400 | |
| Cheeta Softwere | Neuralynx Inc. | ||
| Alligator cables |
References
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