Summary
Extrazelluläre Aufnahmen von neuronaler Aktivität unter Verwendung von Silizium-Sonden in der narkotisierten Ratte beschrieben. Diese Technik ermöglicht Auskünfte über mehrere Hirnareale aus mehr als 100 Neuronen gleichzeitig. Es stellt Informationen über einzelne Zelle Auflösung zu neuronalen Ensembles Dynamik in mehreren lokalen Schaltungen.
Abstract
Groß angelegte elektrophysiologischen Ableitungen von neuronalen Ensembles bieten die Möglichkeit zu untersuchen, wie das Gehirn die Vielzahl von Verhaltensweisen aus dem Aufstocken Aktivität seiner Neuronen orchestriert. Eine der effektivsten Methoden zur Überwachung spiking Aktivität aus einer großen Zahl von Neuronen in mehreren lokalen neuronalen Schaltkreise gleichzeitig wird durch Verwendung von Silizium Elektroden-Arrays 1-3.
Aktionspotentiale produzieren große transmembrane Spannung ändert sich in der Nähe von Zell-Somata. Diese Ausgangssignale können, indem ein Leiter in der Nähe eines Neurons gemessen werden. Wenn es viele aktive (Aufstocken) Neuronen in der Nähe der Spitze sind, zeichnet der Elektrode kombinierte Signal aus allen von ihnen, wo Beitrag eines einzelnen Neurons durch seine "elektrische Distanz 'gewichtet wird. Silicon Sonden sind ideal Aufnahme Elektroden auf mehrere Neuronen aufgrund einer großen Anzahl von Aufnahme-Websites (+64) und einem kleinen Volumen zu überwachen. Furthermore, können mehrere Websites über eine Distanz von Millimeter angeordnet werden, so dass für die gleichzeitige Aufnahmen von neuronaler Aktivität in den verschiedenen kortikalen Ebenen oder in mehreren kortikalen Säulen (Abb. 1). Wichtig ist, dass die geometrisch genaue Verteilung der Aufnahme Websites ermöglicht auch die Bestimmung der räumlichen Beziehung der isolierten einzelnen Neuronen 4. Hier beschreiben wir eine akute, groß angelegten neuronalen Aufnahme aus dem linken und rechten Vorderbein somatosensorischen Kortex gleichzeitig in einer narkotisierten Ratten mit Silizium-Sonden (Abb. 2).
Protocol
1. Chirurgie Vorbereitung
- Anesthetize der Ratte mit der entsprechenden Art und Dosis des Anästhesie. Hier verwenden wir Urethan (1,5 g / kg, Sigma-Aldrich Co., St. Luis, MO) - hergestellt, wie 20% ige Lösung durch Verdünnen von 20 g Urethan in 100 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), dh das Tier erhalten 7,5 ml / kg Urethan-Lösung intraperitoneal (IP). Aufgrund der Dosis-Wirkungs-Kurve wird die Gesamtdosis von Urethan in bis vier Anwendungen, die jeweils von etwa 30 Minuten voneinander getrennt sind. Bevor die ersten zwei Anträge von Urethan-, ist Tier mit einer Konzentration von 3-4% (Sauerstoff bei 2 Litern pro Minute) Isofluran verabreicht und bei 2% (Sauerstoff bei bis zu 2 Liter pro Minute) narkotisiert, ein Tier zu verhindern, immer durch Injektion betont. Während der Operation kann eine zusätzliche Gabe von Isofluoran (2% Konzentration für 2 Minuten) bei Bedarf verwendet werden.
- Shave das Fell entlang der Inzisionsstelle (Rückenseite des Kopfes), um sicherzustellen, dassdas Fell wird nicht verunreinigen die Wunde, und dass eine ausreichende Fläche können rund um die Inzisionsstelle desinfiziert werden.
- Bereiten Operationsstelle antiseptisch mit organischen Jod oder Chlorhexidin Seife und Antiseptika (Ethanol).
- Bereiten Silizium-Sonden (NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI). Probes können desinfiziert mit 70% igem Ethanol durch Spülen mit destilliertem Wasser folgen. Bei Bedarf können Sonden mit einem fluoreszierenden Marker antiseptisch (z. B. Dye I, Invitrogen Co.) vorbereitet, um später zeigen die Position der Sonde in die histologische Analyse lackiert werden. Dazu verwenden wir einen kleinen und sehr weichen Pinsel und zart berühren die Rückseite des Silizium-Sonde mit dem Farbstoff. Dieses Verfahren ist stets auf ein Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Sonde nicht beschädigt oder verbogen durchgeführt werden. Immer überprüfen, um sicherzustellen, dass der Farbstoff nicht blockiert einen der Kanäle. Ein verbleibender Farbstoff auf die Sonde links kann später mit Alkohol entfernt werden, gefolgt von Spülen mit Wasser.
- Silicon electrodes Pflege: Aufgrund ihrer geringen Größe sind Silizium-Sonden zart und extrem anfällig zu brechen, auch wenn Sie ihn mit großer Sorgfalt. Wir empfehlen daher, die Überwachung potenzieller Gefahren zu allen Zeiten, wie zum Beispiel: (i) Halten Sie die Sonden in einem entsprechend benannten Feld, (ii) verhindern Abstürzen oder Fallenlassen Sonden beim Umgang mit ihnen; (iii) Stellen Sie sicher, dass die stereotaktische Manipulatoren fest sind um Unfälle zu vermeiden, (iv) Bei der Aufnahme, das umliegende Gewebe und / oder Blut können die Sonden zu befestigen. Deshalb ist es wichtig, dass man auch vorsichtig, wenn Sie die Sonden nach der Aufnahme. Mit einem konstanten Fluss von PBS oder Kochsalzlösung wird dringend empfohlen, (v) Reinigen Sie die Sonden nach der Aufnahme. Zum Reinigen der Sonden ist es dringend zu versinken sie in einer Flüssigkeit enzymatischer Reiniger (Boston, Bausch & Lomb) für ein paar Minuten empfohlen. Spülen Sie die Sonden mit destilliertem Wasser und bringt sie zu ihren engagierten Box. Nach unserer Erfahrung sorgt für eine ausreichende Versorgung der Silizium-Sondenguter Qualität Aufnahmen für mehr als 10 Experimente. Wenn ein Kanal 'wird laut' während des Gebrauchs, sollte es von nachfolgenden Analysen ausgeschlossen werden. Wir haben festgestellt, dass cross-talk zwischen den Kanälen ist minimal, daher eine laute Kanal hat in der Regel nur sehr wenig Einfluss auf ein Signal in andere Kanäle.
2. Chirurgie
- Tragen Sie eine Augen-Salbe auf Augenoberfläche vor jeder Operation Manipulationen.
- Verwalten Dexamethason 5 mg / ml subkutan Entzündung des Gehirns reduzieren.
- Fix das Tier in stereotaktischen Rahmen während der Operation.
- Verwalten Lidocain HCl 2% mit Adrenalin (2-4 mg / kg bis 0,5% igen Lösung verdünnt) subkutan in die Inzisionsstelle vor dem Schnitt gemacht, um das potenzielle Risiko der Wunde blutet und zur Lokalanästhesie zu reduzieren.
- Machen Sie ein 2 cm langer Schnitt durch die Kopfhaut Mittellinie und verdrängen die Haut seitlich am Schädel Oberfläche freizulegen.
- Deaktivieren Sie das dorsale Kopfhaut von der Faszie durch stumpfe Präparation und Kontrolledie Blutung durch microcautery oder mit Knochen Wachs.
- Machen Sie zwei Löcher bohren, um kleine Schrauben in dem Hinterhauptbein des Schädels für die tierische Grundlage und Referenz zu befestigen. Die Referenz Schraube muss in Kontakt mit dura werden. Um elektrische Störungen während der Aufnahmen zu reduzieren, empfiehlt es sich, die Schrauben stets feucht zu halten. Um dies zu tun, kann eine kleine Acryl-Barriere rund um die Schrauben gebaut werden, oder die Schrauben können mit Agar abgedeckt werden.
- Machen Sie eine 1-2 mm Durchmesser Kraniotomie in den Koordinaten entsprechend der kortikalen und / oder subkortikale (e) von Interesse 5. Mit Druckluft Knochen Staub zu entfernen, da während der Kraniotomie (Bohrloch) benötigt. Prevent Schädel aus aufwärmen, Bohren, indem Tropfen PBS. Machen Sie eine zweite Kraniotomie, wenn nötig, um die zweite Sonde einzusetzen. In diesem Video stellen wir eine Aufnahme von zwei kortikalen Arealen gleichzeitig, also zwei Kraniotomien gemacht werden.
- Bauen Sie ein kleines Hindernis aus Acrylharz (zB: Lang DentalManufacturing, Co., Inc., Wheeting, IL) um die beiden Kraniotomien um PBS oben auf freigelegte Dura zu halten, verhindern, dass es vor dem Austrocknen. Übernehmen PBS ständig während des gesamten Experiments.
- Öffnen Sie die Dura Materie beider Kraniotomien. Zwei Nadeln (30 ½ gauge) gebogen an den Spitzen (Bildung eines Hakens), kann für diese Manipulation verwendet werden.
- Schließen Sie den Stecker des Silizium-Sonden zur stereotaktischen manipulatiors. Die Anschlüsse sind an einer Stange befestigt, um die Schäfte der Sonden völlig parallel zur stereotaktischen Manipulators haben. Dies ist entscheidend für stabile Aufnahmen zu erhalten und zu vermeiden Sonde beschädigen.
- Schließen Sie das Referenz-Schraube, um die Silizium-Sonde Bezugsstifts. ; Ii) das Gehäuse von dem Aufnahmegerät, und iii) die stereotaktischen Rahmen i) den Boden der Sonde Stecker: Zur elektrischen Rauschen der Erde Schrauben müssen verbunden werden zu reduzieren.
- Setzen Sie die Spitze des Silizium-Sonden nur in Kontakt mit der Pia.
- Langsam einführen the Silizium-Sonden und stellen Sie sicher, dass die Schenkel der Silizium-Sonden (Abb. 1 & 2) in das Gehirn kann ohne Widerstand oder Verbiegen eingeführt werden.
- Sie vorsichtig die Sonden bis zum Erreichen gewünschten Aufnahmebereich. Wenn nötig, fügen Tropfen PBS auf der Oberseite des Kraniotomien zu vermeiden Trocknung des Gewebes.
- Da Urethannarkose sollte nur für Terminal-Verfahren verwendet werden, wird das Tier mit einem ip-Injektion von mindestens 200mg/kg von Natrium-Pentobarbital eingeschläfert verdünnt auf eine Konzentration von nicht mehr als 60 mg / ml. Dies ist durch Enthauptung des Tieres verfolgt.
3. Repräsentative Ergebnisse:
Vertreter Aufnahmen von lokalen Bereich Potenziale und Spike-Aktivität sind in Abbildung 3A dargestellt. Nach der Durchführung spike sorting (diskriminierende Spitzen aus verschiedenen Neuronen, Abb. 3b, c, 6, 7, 8) Silizium-Sonde Aufnahmen bieten die Möglichkeit, neuronale Aktivität Bevölkerung beteiligt zu untersuchen, among anderen, die folgenden Prozesse: Gedächtnis und Entscheidungsfindung 9, Plastizität 10, Stimulus-Codierung 11, spontane Aktivität 12 und Wirkungen der verschiedenen Drogen 13.
Abbildung 1. A. Beispiel eines Silizium-Sonde mit einem Schaft ist eine Montage aus rekonstruierten Neuronen (mit freundlicher Genehmigung von S. Sakata 14) überlagert. B. Beispiel einer Sonde mit einer Tetrode Konfiguration an jedem der 8 Schäfte. C. Schematische Darstellung eines Ratte Schädel. Die grünen Felder stellen das Ausmaß der Kraniotomie über den rechten und linken somatosensorischen Kortex.
Abbildung 2. Beispiel für Experiment mit Silizium-Sonden in den präfrontalen Kortex und Hippocampus eingefügt. Drops of PBS decken die Kraniotomie der exponierten br schützenain vor dem Austrocknen. Zwei Schrauben über das Kleinhirn entfernt werden, um Grund-und Referenz angeschlossen werden, bzw..
Abbildung 3. A. Bild zeigt 500ms einer repräsentativen elektrophysiologische Ableitung von Local Feldpotential (LFP) von einem Tetrode (Anmerkung: negative Spannung wird auf der Ordinate). Legen Sie zeigt - eine Wellenform eines Spikes B. zwei-dimensionale Ansichten der Einheit Cluster im Merkmalsraum von 1 Tetrode.. Jedes Cluster stellt Spikes aus einer einzigen Einheit (Neuron). C. Durchschnittliche spike Wellenformen aus repräsentativen Einheiten (farbcodiert) an jedem der vier Aufnahmen Sites von einem einzigen Tetrode. D. Waveform Energie (bezogen auf Amplitude) der aufgezeichneten Spitzen im Laufe der Zeit . Beachten Sie die relativ konstante Energie-Werte für jede Einheit, dies deutet auf eine stabile Aufzeichnung über die Dauer des angezeigten Zeitraums.
Discussion
Dieses Papier zeigt, wie die Silizium-Elektroden-Arrays zu verwenden, um aus großen Population von Neuronen (> 100) in mehreren kortikalen Arealen gleichzeitig aufzunehmen. Um in der Chirurgie und Aufnahme erfolgreich ist, sollten folgende Punkte beachtet werden:
- Einführung der Sonden zu einem gewünschten Bereich: Beim Einsetzen der Sonden im Hirngewebe, ist es möglich, erhebliche Schäden verursachen. Dies kann in einer niedrigen Qualität der aufgenommenen Einheiten führen. Um dieses Problem zu vermeiden, empfehlen wir die folgenden: (i) Einführung der Sonden zu einem bestimmten Grad-Winkel (empfohlen, um eine 10-Grad-Winkel verwenden). Auf diese Weise können dendritische Beschädigung der aufgezeichneten Neuronen reduziert werden, (ii) Nach der Sonden in das Hirngewebe eingesetzt sind, werden sie zunächst mit einer schnelleren Rate (ca. 50 bis 100 Mikrometer pro 10-30 Sekunden) abgesenkt, bis sie bekommen näher an die gewünschte Stelle der Aufzeichnung. Wenn die Sonden etwa 200 Mikron aus dem Zielgebiet sind, ist die Position langsamer (ca. angepasstimately 10 Mikrometer alle 2 oder 3 Minuten).
- Die Stabilisierung der Aufnahmen: Wenn die Sonden in dem bezeichneten Gebiet sind und erhebliche Aktivität festgestellt wird (ausgeprägte Spitzen in der Mehrzahl der Kanäle), empfiehlt es sich, ca. 30 Minuten vor dem Start einer Aufnahme warten. Dies ermöglicht Hirngewebe mechanisch nach dem Einsetzen von Sonden zu stabilisieren und damit zu mehr Aufnahme.
- Gehirn Pulsation: Gelegentlich ist es möglich, Gehirn Pulsation deutlich reduzieren kann die Qualität einer Aufnahme zu sehen. Eine kleine Kraniotomie (gerade genug Platz, um die Sonde passen) können Gehirn Pulsation in einer Aufnahme zu reduzieren. Falls erforderlich, kann die Cisterna magna punktiert werden. Dies reduziert Liquor Druck und verringert Schwellungen und Pulsieren.
- Silicon-Sonde Konfiguration: Silicon Sonden können eine Vielzahl von Formen und Aufnahme vor Ort Konfigurationen haben. Zum Beispiel können sie in der Anzahl der Schäfte, die Länge und Dicke von Schäften variieren, und indie Anordnung der Aufnahme Standorten (z. B. Tetrode vs lineare Konfiguration, siehe: www.neuronexustech.com). Die Wahl der Sonde mit einer bestimmten Konfiguration verwendet wird, hängt die wissenschaftliche Frage zu müssen beantwortet werden. Zum Beispiel, wenn die Zielsetzung der Populationen von Neuronen an mehreren Standorten Datensatz in einer bestimmten Schicht (wie in diesen Aufnahmen vorgestellt) ist, ist die beste Wahl, um eine Sonde mit acht Schäften und einem Tetrode Konfiguration verwenden. Dies ermöglicht Aufnahmen aus mehreren einzelnen Einheiten an jedem Tetrode und die Entnahme von acht Standorten über eine 1,4 mm Spannweite. In einem anderen Fall, wenn jemand möchte Aktivität Ausbreitungen über kortikale Schichten studieren, wäre die beste Wahl sein, um eine Sonde mit einem Schaft Verwendung mit regelmäßig verteilten Aufnahme Standorten entlang, dass Schaft die Aufnahme in mehrere kortikale Schichten gleichzeitig 14 ermöglicht.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NSERC & AHFMR unterstützt. Die Autoren bedanken sich Mariam Alaverdashvili und Amanda Mauthe-Kaddoura für Anmerkungen zum Manuskript und Hiroe Yamazaki um Hilfe auf dem OP-Vorbereitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urethane | Sigma-Aldrich | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Isoflurane | Benson Medical Instruments | 02241315 | |
| Silicon probes | NeuroNexus Technologies | A 4 X 2 - Tet - 5mm - 150 - 200 – 312 | |
| Dye I (DiIC18(3)) | Invitrogen | 617830 | |
| Dexamethasone 5 | Vétoquinol | 0A0640B | |
| Eye ointment | Vétoquinol | 005165414 | |
| Lidocaine HCl 2% with Epinephrine | Bimeda-MTC | 00141984 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | 1430-B | |
| Electrode manipulator and holder | Kopf Instruments | 960 | |
| Rat ear-bars | Kopf Instruments | 1955 | |
| Rat adaptor | Kopf Instruments | 920 | |
| Anaesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Scalpel | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Scalpel blades | Paragon | 0086 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910 | |
| Screws | Gould Pasteners Limited | 14084701 | |
| Hemostatic forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7130 RS-7211 | |
| 30½ gauge needles | BD Biosciences | 305115 | |
| Micromotor control | Foredom | HP4-917 | |
| Dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5237 | |
| Bone wax | Lukens | M263500 | |
| Compressed air bottle | Falcon BD | 50-10521C | |
| Enzymatic cleaner | Bausch and Lomb | BAUSCH497628 | |
| Distilled water | |||
| Dental acrylic powder | Lang Dental | 1220 | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental | 1404 | |
| Digital Lynx SX System | Neuralynx Inc. | 4SX-Z400 | |
| Cheeta Softwere | Neuralynx Inc. | ||
| Alligator cables |
References
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