Summary
麻酔ラットのシリコンプローブを用いた神経活動の細胞外記録について説明する。この技術は、同時に100以上のニューロンからの複数の脳領域間で情報を得ることができる。それは、複数の局所回路における神経細胞のアンサンブルのダイナミクスについての単一細胞の解像度で情報を提供します。
Abstract
ニューロンのアンサンブルから大規模な電気生理学的記録は、脳はその神経細胞のスパイク活動から行動のさまざまな組織化する方法を調査する機会を提供しています。複数のローカル神経回路における神経細胞の数が多いからスパイク活動を監視するために最も効果的な方法の一つは、同時に1から3シリコン電極アレイを使用することです。
活動電位は細胞のsomaの複数形の近傍で大きな貫通電圧の変化をもたらす。これらの出力信号は、ニューロンの近傍に導体を配置することによって測定することができます。先端付近のアクティブな多くの（スパイキング）ニューロンが存在する場合、電極のレコードは、単一ニューロンの貢献はその"電気的距離"によって重み付けされ、それらのすべてからの信号を、組み合わせて。シリコンプローブため記録部位（64）と小容積の大きい数の複数のニューロンを監視するための理想的な記録電極です。 Furthermo再、複数のサイトはこのように様々な皮質層でも複数の皮質カラム（図1）における神経活動の同時録画を可能にする、ミリメートルの距離にわたって配置することができます。重要なのは、記録部位の幾何学的に正確な分布はまた、孤立した単一ニューロンの4の空間的関係を決定することができます。ここで、我々は、同時にシリコンプローブ（図2）で麻酔ラットにおける左と右前肢体性感覚皮質から急性、大規模なニューロンの記録を説明します。
Protocol
1。手術の準備
- 麻酔薬の適切な種類と投与量でラットを麻酔。ここでは、ウレタン（1.5 g / kgの、シグマ - アルドリッチ社、聖ルイス、MO）を使用する - リン酸塩100ml中にウレタンの20gを希釈して20％溶液として調製動物すなわち緩衝生理食塩水（PBS）は、7.5を受け取ります。ウレタンソリューション腹腔内（IP）のml / kgを。ため、その用量反応曲線の、ウレタンの合計投与量は、4つのアプリケーション、約30分で区切られた各に分割されています。ウレタンの最初の2つのアプリケーションの前に、動物は3〜4％の濃度（毎分2リットルの酸素）でイソフルランで麻酔を投与すると2％（毎分2リットルまでの酸素）で維持さから動物を防ぐために注射によるストレスばかり。手術中は、イソフルラン（2分2％の濃度）の追加投与が必要に応じて使用することができます。
- それを確実にするために切開部位（頭部の背側）に沿って毛を剃る毛皮は、傷を汚染し、十分な領域が切開部位の周囲に駆除できることはありません。
- 有機ヨウ素またはクロルヘキシジンの石鹸や消毒剤（エタノール）を使用して殺菌して手術部位を準備します。
- シリコンプローブを（NeuroNexus技術、アナーバー、MI）の準備。プローブは、蒸留水でリンスし、次いで70％エタノールを使用して駆除することができます。必要に応じて、プローブは後で組織学的分析ではプローブの位置を明らかにするために、（例えば染料I、Invitrogen社）殺菌して作成した蛍光マーカーで塗装することができます。これを行うために、我々は小さいと非常にソフトなペイントブラシを使用し、繊細な色素でシリコンプローブの背面に手を触れない。この手順は、常にプローブが破損または曲がっされていないことを確認するために顕微鏡を介して行われる必要があります。常に染料は任意のチャネルをブロックしていないことを確認してください。プローブ上に残っている残留色素は、後に水ですすぎ、続いてアルコールを除去することができます。
- シリコンelectrodESケア：ためサイズが小さい、シリコンプローブは、繊細でかなりの注意を払ってそれを使用する場合でも、破壊に非常に敏感です。従って、我々のような常に、で潜在的な危険を監視することをお勧めします。（i）適切に指定されたボックス内のプローブを保持し、（ii）がクラッシュしたり、それらを処理する際にプローブをドロップできないようにすること、（iii）定位マニピュレータがうまく固定されていることを確認してください事故を防止すること、（iv）記録、周囲の組織および/または血液は、プローブに接続することができます。そのため、録音後にプローブを取り外すときにも注意することが重要です。 PBSまたは生理食塩水の一定の流れを使用することを強くお勧めします。（V）は、必ず録音後にプローブを清掃。プローブをクリーニングするには、それが強く、数分間の液体酵素洗浄剤に浸し、それらを（ボストン、ボシュロム）することをお勧めします。常に蒸留水でプローブを洗い、その専用ボックスにそれらを返します。我々の経験では、シリコンプローブの適切なケアが確実に10以上の実験のための良質の録音。チャネルが使用中に"騒々しい取得"した場合、それは以降の分析から除外する必要があります。我々は、チャネル間のクロストークが最小限であることを発見したので雑音の多いチャンネルでは、通常、他のチャネルの信号にはほとんど影響を与えません。
2。手術
- どんな手術操作の前に眼の表面に目に軟膏を塗る。
- 脳の炎症を減らすために5 mg / mlの皮下デキサメタゾンを投与する。
- 手術全体に定位フレームに動物を修正。
- 切開創の出血のと局所麻酔のための潜在的なリスクを軽減するために作成される前に切開部位の皮下エピネフリン（2-4 mg / kgの0.5％溶液に希釈）とリドカイン塩酸2％を管理する。
- 頭皮の正中線を介して2cmの切開を行い、頭蓋骨の表面を露出させる横方向に皮膚を変位させる。
- 鈍的切開と制御によって筋膜から背側頭皮をクリアmicrocauteryによってまたは骨のワックスを使用して、出血。
- 動物の接地と参考のため頭蓋骨の後頭骨に小さなネジを添付するには、2つの掘削穴を作る。参照のネジは、硬膜と接触している必要があります。録音時の電気ノイズを低減するためには、それは常にウェットネジを維持することが推奨されます。これを行うには、ネジを囲む小さなアクリルバリアを構築することができますまたはねじが寒天で覆うことができます。
- 興味5の皮質および/ または皮質下領域（s）に対応する座標に1-2 mmの直径の開頭手術を行います。開頭術（ドリル穴）中に必要に応じて骨塵を除去するために圧縮空気を使用してください。頭蓋骨は、PBSの滴を適用することにより、掘削からウォームアップを防ぐ。第二のプローブを挿入するために必要な場合は、2番目の開頭術を行います。このビデオでは、我々は、ですから、二つのcraniotomiesが行われて、同時に二つの皮質領域から記録を提示している。
- アクリル樹脂の小さな障壁を構築する（例：ラング歯科乾燥からそれを防止する、露出硬膜の上にPBSを維持するために、2つのcraniotomiesを取り巻く製造業、（株）、Wheeting、イリノイ州）。全体の実験中に絶えずPBSを適用します。
- 両方craniotomiesの硬膜を開きます。ヒント（フックを形成する）上に曲がった2本の針（30 ½ゲージ）は、この操作に使用することができます。
- 定位manipulatiorsにシリコンプローブのコネクタを取り付けます。コネクタは、定位マニピュレータに対して完全に平行プローブのシャンクを持つためにポールに取り付けられている。これにより、安定した記録を維持し、プローブの損傷を避けるために不可欠です。
- シリコンプローブのリファレンスピンへの参照のネジを接続します。 、ⅱ）シャーシの録音デバイスからのグランド、及びiii）定位フレームi）プローブのプラグの接地：接地用ネジがに接続されている電気的なノイズを低減する。
- ちょうどPIAとの接触でシリコンプローブの先端を置きます。
- ゆっくりと目を導入する電子のシリコンプローブとシリコンプローブ（図1＆2）のシャンクが抵抗や曲げなく、脳に挿入できることを確認してください。
- 慎重に、目的の記録領域に到達するまでプローブを下げます。必要に応じて、組織の乾燥を避けるためにcraniotomiesの上にPBSの滴を追加します。
- ウレタン麻酔のみの端末の手続きのために使用されるので、動物はナトリウムの少なくとも200mg/kgの腹腔内注射によって安楽死されているペントバルビタールは60以上mg / mlの濃度に希釈した。これは、動物の断頭が続いている。
3。代表的な結果：
局所電場電位とスパイク活動の代表的な録音は、図3Aに示されています。スパイクソーティングを（;図3B、C、別の神経細胞から発信される識別スパイク6、7、8）を実行した後、シリコンプローブの録音は、午前、にかかわる神経細胞集団の活動を調査する機能を提供オング他、以下のプロセス：9意思メモリや意思決定、可塑性10、刺激コーディング11、自発活動12と種々の薬物13の効果。
図1。単一のシャンク付きのシリコンプローブのA.の例は、再構築された神経細胞のモンタージュ（阪田史郎14の礼儀）に重畳する。8シャンクのそれぞれにおける四極管の構成を持つプローブのB.の例は。のC.の回路図は、ラットの頭蓋骨。緑のボックスは、左右の体性感覚皮質上開頭の範囲を表しています。
図2。前頭前野と海馬に挿入されたシリコンのプローブと実験の例。 PBSの滴は、露出したBRを保護するために開頭をカバー乾燥からAIN。小脳上のネジ2本は、それぞれ、接地とリファレンスに接続されます。
図3。 （：負電圧、縦軸上にプロットされているノートは）A.イメージ一四極管から局所場電位（LFP）の代表的な電気生理学的記録の500ミリ秒を示しています。ショーを挿入- 1テトロードから特徴空間におけるユニットクラスタのスパイクB.二次元ビューの波形を。各クラスタは、単一のユニット（ニューロン）からスパイクを表しています。代表的なユニット（色分け）からC.平均スパイク波形は、単一の四極管からの4つの記録部位の各々で時間の経過に伴う記録されたスパイクのD.波形エネルギー（振幅に関係する） 。各ユニットの比較的一定のエネルギー値に注意してください、これは表示される期間の長さにわたって安定した記録を示している。
Discussion
本論文では、同時に複数の皮質領域で神経細胞の大集団（> 100）から記録するためにシリコン電極アレイを使用する方法を示します。手術と録音で成功するためには、次の問題を考慮する必要があります。
- 希望のエリアのプローブの導入：脳組織にプローブを挿入するとき、それはかなりの損傷を引き起こすことが可能です。これは、記録されたユニットの低品質になることがあります。この問題を回避するために我々は、以下を推奨します。（i）は（10度の角度を使用することをお勧めします）、ある程度の角度でプローブを導入する。こうすることにより、記録されたニューロンの樹状突起損傷を低減させることができる。プローブは脳組織に挿入された後、彼らが取得するまで（II）、それらは最初に速い速度（10〜30秒あたり約50〜100ミクロン）で下げている記録の目的のエリアに近い。プローブがターゲットエリアから200ミクロンとしているときは、位置が（約よりゆっくりと調整されimately 10ミクロン毎に2〜3分）。
- レコーディングの安定化：プローブは指定されたエリアとかなり活動している（チャネルの大部分で特徴的なスパイク）が検出され、それが記録を開始する前に、約30分を待つことをお勧めします。これは、脳組織が機械的にプローブを挿入した後安定させ、より安定した記録を確保することができます。
- 脳の脈動：時々大幅に記録の質を減らすことができる脳の拍動を確認することが可能です。小開頭術（プローブに合わせてちょうど十分なスペース）は、記録領域に脳の脈動を減らすことができます。必要に応じて、大槽に穴ができます。これは、脳脊髄液の圧力を軽減し、腫れや脈動減少する。
- シリコンプローブコンフィギュレーション：シリコンプローブは、形状と記録のサイトの様々な構成を持つことができます。例えば、彼らは、シャンク、シャンクの長さと太さの数で変化する、とでもできます記録部位の配列（例えば、四極管対リニア設定、参照してください：www.neuronexustech.com）。特定の構成で使用されるプローブの選択が回答される必要な科学的問題に依存します。例えば、目的がある特定の層（のようなこれらの録音で提示されている）の複数の場所に神経細胞の集団を記録する場合、最良の選択は、8つのシャンクとテトロード設定でプローブを使用することです。これは、1.4ミリメートルのスパン全体で8箇所の各四極管とサンプリングで複数のシングルユニットの録音が可能になります。誰かが皮質の層全体の活動の伝播を研究したい場合は別のインスタンスでは、最良の選択は、複数の皮質層の記録が同時に14できるという点シャンクに沿って定期的に配布記録部位ワンシャンクとプローブを使用することです。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NSERC＆AHFMRによってサポートされていました。著者らは、手術の準備についてのヘルプは原稿と廣江山崎のコメントのためにマリアAlaverdashviliとアマンダMauthe - Kaddouraに感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urethane | Sigma-Aldrich | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Isoflurane | Benson Medical Instruments | 02241315 | |
| Silicon probes | NeuroNexus Technologies | A 4 X 2 - Tet - 5mm - 150 - 200 – 312 | |
| Dye I (DiIC18(3)) | Invitrogen | 617830 | |
| Dexamethasone 5 | Vétoquinol | 0A0640B | |
| Eye ointment | Vétoquinol | 005165414 | |
| Lidocaine HCl 2% with Epinephrine | Bimeda-MTC | 00141984 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | 1430-B | |
| Electrode manipulator and holder | Kopf Instruments | 960 | |
| Rat ear-bars | Kopf Instruments | 1955 | |
| Rat adaptor | Kopf Instruments | 920 | |
| Anaesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Scalpel | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Scalpel blades | Paragon | 0086 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910 | |
| Screws | Gould Pasteners Limited | 14084701 | |
| Hemostatic forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7130 RS-7211 | |
| 30½ gauge needles | BD Biosciences | 305115 | |
| Micromotor control | Foredom | HP4-917 | |
| Dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5237 | |
| Bone wax | Lukens | M263500 | |
| Compressed air bottle | Falcon BD | 50-10521C | |
| Enzymatic cleaner | Bausch and Lomb | BAUSCH497628 | |
| Distilled water | |||
| Dental acrylic powder | Lang Dental | 1220 | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental | 1404 | |
| Digital Lynx SX System | Neuralynx Inc. | 4SX-Z400 | |
| Cheeta Softwere | Neuralynx Inc. | ||
| Alligator cables |
References
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat. Neurosci. 7, 446-451 (2004).
- Kipke, D. R. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J. Neurosci. 28, 11830-11838 (2008).
- Csicsvari, J. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J. Neurophysiol. 90, 1314-1323 (2003).
- Bartho, P. Characterization of neocortical principal cells and interneurons by network interactions and extracellular features. J. Neurophysiol. 92, 600-608 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain: in stereotaxic coordinates. , 4th Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, R53-R78 (1998).
- Harris, K. D., Henze, D. A., Csicsvari, J., Hirase, H., Buzsaki, G. Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements. J. Neurophysiol. 84, 401-414 (2000).
- Luczak, A., Narayanan, N. S. Spectral representation--analyzing single-unit activity in extracellularly recorded neuronal data without spike sorting. J. Neurosci. Methods. 144, 53-61 (2005).
- Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus. Science. 321, 1322-1327 (2008).
- Fujisawa, S., Amarasingham, A., Harrison, M. T., Buzsaki, G. Behavior-dependent short-term assembly dynamics in the medial prefrontal cortex. Nat Neurosci. 11, 823-833 (2008).
- Harris, K. D. How do neurons work together? Lessons from auditory cortex. Hear. Res. 271, 37-53 (2011).
- Luczak, A., Bartho, P., Marguet, S. L., Buzsaki, G., Harris, K. D. Sequential structure of neocortical spontaneous activity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 347-352 (2007).
- Robbe, D. Cannabinoids reveal importance of spike timing coordination in hippocampal function. Nat. Neurosci. 9, 1526-1533 (2006).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64, 404-418 (2009).
