Summary
Grabaciones extracelular de la actividad neuronal mediante sondas de silicio en la rata anestesiada se describen. Esta técnica permite obtener información a través de múltiples áreas cerebrales de más de 100 neuronas simultáneamente. Proporciona información con una resolución única célula sobre la dinámica de conjuntos neuronales en varios circuitos locales.
Abstract
Gran escala de las grabaciones electrofisiológicos de conjuntos neuronales ofrecen la oportunidad de investigar cómo el cerebro organiza la amplia variedad de comportamientos de la actividad de remate de sus neuronas. Uno de los métodos más eficaces para controlar picos de actividad de un gran número de neuronas en múltiples circuitos neuronales locales al mismo tiempo es el uso de matrices de electrodos de silicio 1-3.
Los potenciales de acción producen grandes cambios en el voltaje transmembrana en las cercanías de cuerpos celulares de células. Estas señales de salida se puede medir mediante la colocación de un conductor en las proximidades de una neurona. Si hay muchos activos (picos), las neuronas en las proximidades de la punta, el electrodo registra la señal combinada de todos ellos, donde se pondera la contribución de una única neurona por su "distancia eléctrica". Sondas de silicona son los electrodos de grabación ideales para monitorear múltiples neuronas debido a un gran número de sitios de grabación (64) y un pequeño volumen. Furthermore, varios sitios se pueden organizar en una distancia de milímetros, lo que permite la grabación simultánea de la actividad neuronal en las capas corticales distintas o en varias columnas corticales (Fig. 1). Es importante destacar que la distribución geométrica precisa de los sitios de registro también permite la determinación de la relación espacial de las cuatro neuronas individuales aislados. Aquí se describe una enfermedad aguda, a gran escala de registro neuronal de la corteza cerebral izquierda y derecha somatosensorial extremidad anterior de manera simultánea en una rata anestesiada con sondas de silicio (Fig. 2).
Protocol
1. Preparación para la Cirugía
- Anestesiar la rata con el tipo adecuado y la dosis de anestésicos. Aquí se utiliza uretano (1,5 g / kg, Sigma-Aldrich Co., San Luis, MO) - preparado como solución al 20% por dilución de 20 g de uretano en 100 ml de solución salina de fosfato (PBS), es decir que el animal recibirá 7,5 ml / kg de solución de uretano intraperitoneal (IP). Debido a su curva dosis-respuesta, la dosis total de uretano se divide en cuatro aplicaciones, cada una separada por unos 30 minutos. Antes de las dos primeras solicitudes de uretano, animales anestesiados con isoflurano es administrado a una concentración del 3-4% (oxígeno a 2 litros por minuto) y se mantiene en 2% (de oxígeno de hasta 2 litros por minuto) para evitar que un animal de estresarse por inyección. Durante la cirugía, una administración adicional de isofluorano (2% de concentración durante 2 minutos) se puede utilizar si es necesario.
- Afeitarse la piel a lo largo del sitio de la incisión (el lado dorsal de la cabeza) para asegurarse de quela piel no se contamine la herida y una superficie suficiente se puede desinfectar todo el sitio de la incisión.
- Prepare el sitio quirúrgico antiséptico con yodo orgánico o jabón de clorhexidina y antisépticos (etanol).
- Prepare las sondas de silicio (Tecnologías de la NeuroNexus, Ann Arbor, MI). Las sondas pueden ser desinfectados con etanol al 70% seguido de un enjuague con agua destilada. Si es necesario, las sondas se pueden pintar con un marcador fluorescente preparado antiséptico (por ejemplo, colorantes I, Invitrogen Co.), para revelar posteriormente la posición de la sonda en el análisis histológico. Para ello se utiliza un pincel pequeño y muy suave y delicado tocar la parte posterior de la sonda de silicio con el tinte. Este procedimiento se debe hacer siempre más de un microscopio para asegurarse de que la sonda no está siendo dañados o doblados. Siempre asegúrese de que el tinte no es el bloqueo de cualquiera de los canales. Un colorante residual que queda en la sonda puede ser eliminado después con el alcohol, seguido de un enjuague con agua.
- Silicio electrodla atención es: Debido a su pequeño tamaño, las sondas de silicona son delicadas y muy sensibles a la ruptura, incluso cuando se utiliza con mucho cuidado. Por lo tanto, se recomienda supervisar los posibles riesgos en todo momento, tales como: (i) Mantener las sondas en una caja debidamente designados, (ii) Evitar chocar o caer sondas durante el manejo, (iii) Asegúrese de que los manipuladores estereotáxica están bien fijos para evitar cualquier accidente; (iv) Al grabar, el tejido circundante y / o sangre se puede unir a las sondas. Por lo tanto, es importante también ser cuidadoso al retirar la sonda después de la grabación. El uso de un flujo constante de solución de PBS o solución salina es muy recomendable, (v) Siempre limpie las sondas después de la grabación. Para la limpieza de las sondas, se recomienda encarecidamente a sumergirse en un líquido limpiador enzimático (Boston, Bausch & Lomb) durante unos minutos. Siempre enjuague la sonda con agua destilada y devolverlos a su caja dedicada. En nuestra experiencia, la atención adecuada de las sondas de silicona aseguragrabaciones de buena calidad por más de 10 experimentos. Si un canal se ruidosa "durante su uso, deben ser excluidos de los análisis posteriores. Hemos encontrado que la interferencia entre canales es mínima, por lo tanto un canal ruidoso por lo general tiene muy poco efecto sobre la señal de otros canales.
2. Cirugía
- Aplique una pomada ocular en la superficie de los ojos antes de cualquier manipulación cirugía.
- Administrar dexametasona 5 mg / ml por vía subcutánea para reducir la inflamación cerebral.
- Fijar el animal en el marco estereotáctico a lo largo de la cirugía.
- Administrar lidocaína HCl al 2% con epinefrina (2-4 mg / kg diluida en solución al 0,5%) por vía subcutánea en el sitio de la incisión antes de la incisión se realiza para reducir el riesgo potencial de que el sangrado de la herida y la anestesia local.
- Haga una incisión de 2 cm a través de la línea media del cuero cabelludo y la piel desplazar lateralmente para exponer la superficie del cráneo.
- Borrar el cuero cabelludo de la fascia dorsal mediante disección roma y controlel sangrado por microcautery o mediante el uso de cera de hueso.
- Haga dos agujeros de perforación para colocar pequeños tornillos en el hueso occipital del cráneo de los animales y de puesta a tierra de referencia. El tornillo de referencia debe estar en contacto con la duramadre. Con el fin de reducir el ruido eléctrico durante las grabaciones, se recomienda mantener los tornillos húmedo en todo momento. Para ello, una pequeña barrera de acrílico alrededor de los tornillos se pueden construir o los tornillos pueden ser cubiertas con agar.
- Hacer una craneotomía 1-2 mm de diámetro en las coordenadas correspondientes a la zona cortical y / o subcorticales (s) de interés 5. Utilizar aire comprimido para eliminar el polvo de hueso, según sea necesario durante la craneotomía (de perforación). Evitar que el cráneo de calentamiento de la perforación mediante la aplicación de gotas de PBS. Hacer una craneotomía segundo si es necesario para insertar la segunda sonda. En este video, estamos presentando una grabación de dos áreas corticales de forma simultánea, por lo tanto dos craneotomías se hacen.
- Construir una pequeña barrera de resina acrílica (por ejemplo: Lang DentalFabricación, Co., Inc., Wheeting, IL) en torno a los dos craneotomías con el fin de mantener PBS en la parte superior de la duramadre expuesta, evitando que se seque. Aplicar PBS constantemente durante todo el experimento.
- Abrir el asunto dura de dos craneotomías. Dos agujas (30 ½ calibre) doblada en las puntas (en forma de gancho), se puede utilizar para esta manipulación.
- Conecte el conector de las sondas de silicona para el manipulatiors estereotáxica. Los conectores están conectados a un poste para tener los vástagos de las sondas perfectamente paralelo al manipulador estereotáxica. Esto es crucial para mantener grabaciones estables y evitar el daño de la sonda.
- Conecte el tornillo de referencia a la clavija de referencia de silicio de la sonda. Para reducir el ruido eléctrico de los tornillos de tierra tiene que estar conectado a: i) la tierra del enchufe de la sonda, ii) la tierra del chasis del dispositivo de grabación, y iii) el marco estereotáxico.
- Coloque la punta de las sondas de silicona sólo en contacto con el PIA.
- Poco a poco introducir ªe sondas de silicio y asegúrese de que los vástagos de las sondas de silicona (Fig. 1 y 2) se puede insertar en el cerebro sin resistencia o flexión.
- Baje con cuidado la sonda hasta llegar a la zona deseada de grabación. Si es necesario, agregue gotas de PBS en la parte superior de la craneotomía para evitar la desecación de los tejidos.
- Debido a la anestesia de uretano sólo debe utilizarse para los procedimientos de la terminal, el animal es sacrificado con una inyección ip de por lo menos 200mg/kg de pentobarbital sódico diluido a una concentración de no más de 60 mg / ml. Esto es seguido por decapitación del animal.
3. Los resultados representativos:
Grabaciones representativas de los potenciales de campo local y la actividad de adición se ilustran en la Figura 3. Después de realizar la clasificación pico (picos de discriminación procedentes de diferentes neuronas; Fig. 3B, C, 6, 7, 8) de silicio grabaciones sonda proporcionan la capacidad para investigar la actividad de la población neuronal involucrado en, amotras ong, los siguientes procesos: la memoria y la toma de decisiones 9, 10 plasticidad, el estímulo de codificación de 11, la actividad espontánea de los 12 y los efectos de varias drogas 13.
Figura 1. Ejemplo A. de una sonda de silicio con una sola pierna se superpone a un montaje de las neuronas reconstruido (cortesía de S. Sakata 14). B. Ejemplo de una sonda con una configuración de tetrodo en cada uno de los ocho vástagos. C. Esquema de una rata cráneo. Las cajas verdes representan la extensión de la craneotomía en la corteza somatosensorial derecha e izquierda.
Figura 2. Ejemplo de experimentar con las sondas de silicona insertadas en la corteza prefrontal y el hipocampo. Gotas de PBS cubrir la craneotomía para proteger a los expuestos brAIN se seque. Dos tornillos que se encuentran en el cerebelo se conecta a tierra y de referencia.
Figura 3. A. Imagen muestra de 500 ms de un registro representativo electrofisiológicos de potenciales de campo local (LFP) de un tetrodo (nota: la tensión negativa se representa hasta en la ordenada). Muestra Insertar - una forma de onda de un pico de B. vistas bidimensionales de los clusters en la unidad característica del espacio de un tetrodo.. Cada grupo representa a los picos de una sola unidad (neurona). C. Promedio formas de onda pico de unidades representativas (colores) en cada uno de los cuatro sitios de registro de una sola tetrodo. D. de forma de onda de energía (en relación con la amplitud) de los picos registrados a través del tiempo . Tenga en cuenta los valores de energía relativamente constante para cada unidad, lo que indica una grabación estable a lo largo de la duración del período de muestra.
Discussion
En este trabajo se muestra cómo utilizar las matrices de electrodos de silicio para registro de población de neuronas (> 100) en múltiples áreas corticales de forma simultánea. Con el fin de tener éxito en la cirugía y la grabación, los siguientes aspectos deben ser considerados:
- Introducción de las sondas en una zona deseada: Al insertar las sondas en el tejido cerebral, es posible causar un daño considerable. Esto puede resultar en una baja calidad de las unidades registradas. Para evitar este problema, recomendamos lo siguiente: (i) Introducir las sondas en un ángulo determinado (se recomienda utilizar un ángulo de 10 grados). De esta manera, el daño dendríticas de las neuronas registradas se puede reducir, (ii) Después de las sondas se insertan en el tejido cerebral, inicialmente se redujo a un ritmo más rápido (aproximadamente 50 a 100 micras por 10-30 segundos) hasta que se más cercano a la zona deseada de la grabación. Cuando las sondas son unos 200 micrones de la zona objetivo, la posición se ajusta más lentamente (aprox.madamente 10 micras cada 2 o 3 minutos).
- La estabilización de las grabaciones: Cuando las sondas se encuentran en el área designada y se detecta una actividad considerable (picos distintivos en la mayoría de los canales), se recomienda esperar unos 30 minutos antes de comenzar una grabación. Esto permitirá que el tejido cerebral para estabilizar mecánicamente después de la inserción de sondas y garantizar una grabación más estable.
- Pulsaciones del cerebro: en ocasiones es posible ver la pulsación del cerebro que pueden reducir significativamente la calidad de una grabación. Una craneotomía pequeño (espacio suficiente para adaptarse a la sonda) puede reducir pulsaciones del cerebro en un área de grabación. Si es necesario, la cisterna magna puede ser perforado. Esto reduce la presión del líquido cefalorraquídeo y disminuye la hinchazón y pulsaciones.
- Configuración de la sonda de silicio: las sondas de silicio puede tener una variedad de formas y configuraciones de grabación sitio. Por ejemplo, pueden variar en el número de vástagos, la longitud y el grosor de rejones, y enla disposición de los sitios de registro (por ejemplo, tetrodo configuración vs lineal, ver: www.neuronexustech.com). La elección de la sonda utilizada con una configuración específica depende de la pregunta científica que necesitan ser contestadas. Por ejemplo, si el objetivo es registrar las poblaciones de neuronas en varias ubicaciones en una capa específica (tal como se presenta en estas grabaciones), la mejor opción es utilizar una sonda con ocho patas y una configuración de tetrodo. Esto permite la grabación de múltiples unidades individuales en cada tetrodo y toma de muestras de ocho localidades a través de un período de 1,4 mm. En otro ejemplo, si alguien quiere estudiar propagaciones de actividad a través de las capas corticales, la mejor opción sería utilizar una sonda con un vástago con sitios de registro distribuidos regularmente a lo largo de ese vástago que permite la grabación en múltiples capas corticales al mismo tiempo 14.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por NSERC y AHFMR. Los autores agradecen a Mariam Alaverdashvili y Amanda Mauthe-Kaddoura de comentarios sobre el manuscrito y Yamazaki Hiroe para ayudar en la preparación de la cirugía.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urethane | Sigma-Aldrich | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Isoflurane | Benson Medical Instruments | 02241315 | |
| Silicon probes | NeuroNexus Technologies | A 4 X 2 - Tet - 5mm - 150 - 200 – 312 | |
| Dye I (DiIC18(3)) | Invitrogen | 617830 | |
| Dexamethasone 5 | Vétoquinol | 0A0640B | |
| Eye ointment | Vétoquinol | 005165414 | |
| Lidocaine HCl 2% with Epinephrine | Bimeda-MTC | 00141984 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | 1430-B | |
| Electrode manipulator and holder | Kopf Instruments | 960 | |
| Rat ear-bars | Kopf Instruments | 1955 | |
| Rat adaptor | Kopf Instruments | 920 | |
| Anaesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Scalpel | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Scalpel blades | Paragon | 0086 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910 | |
| Screws | Gould Pasteners Limited | 14084701 | |
| Hemostatic forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7130 RS-7211 | |
| 30½ gauge needles | BD Biosciences | 305115 | |
| Micromotor control | Foredom | HP4-917 | |
| Dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5237 | |
| Bone wax | Lukens | M263500 | |
| Compressed air bottle | Falcon BD | 50-10521C | |
| Enzymatic cleaner | Bausch and Lomb | BAUSCH497628 | |
| Distilled water | |||
| Dental acrylic powder | Lang Dental | 1220 | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental | 1404 | |
| Digital Lynx SX System | Neuralynx Inc. | 4SX-Z400 | |
| Cheeta Softwere | Neuralynx Inc. | ||
| Alligator cables |
References
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