Summary
Extracellulära inspelningar av nervaktivitet använda kisel sonder i sövda råttor kommer att beskrivas. Denna teknik gör det möjligt att få information över flera områden i hjärnan från mer än 100 nervceller samtidigt. Den ger information med en enda cell resolution om neuronala ensembler dynamik i flera lokala kretsar.
Abstract
Storskalig elektrofysiologiska inspelningar från neuronala ensembler ger möjlighet att undersöka hur hjärnan dirigerar de många olika beteenden från den tillsatta aktiviteten av sina nervceller. En av de mest effektiva metoderna för att övervaka tillsatta aktivitet från ett stort antal nervceller i flera lokala neuronala kretsar samtidigt med hjälp av matriser kisel elektrod 1-3.
Aktionspotentialer producera stora förändringar transmembrana spänning i närheten av cellen somata. Dessa utsignaler kan mätas genom att placera en ledare i närheten av en neuron. Om det finns många aktiva (tillsatta) nervceller i närheten av spetsen, registrerar elektroden kombinerade signalen från alla dem, där bidraget från en enskild neuron är viktas med sin "elektriska avståndet". Silicon sonder är idealiska in elektroder för att övervaka flera nervceller grund av ett stort antal inspelning webbplatser (64) och en liten volym. Furthermore, kan flera webbplatser ordnas över en sträcka på millimeter, vilket möjliggör samtidig inspelningar av nervaktivitet i de olika kortikala lager eller i flera kortikal kolumner (bild 1). Viktigt tillåter geometriskt exakta fördelningen av inspelningen platser även för bestämning av den rumsliga förhållandet mellan isolerade enstaka nervceller 4. Här beskriver vi ett akut, storskaliga neuronala inspelning från vänster och höger forelimb somatosensoriska cortex samtidigt i en sövda råttor med kisel sonder (Fig. 2).
Protocol
1. Kirurgi Förberedelser
- Bedöva råtta med lämplig typ och dos av narkosmedel. Här använder vi uretan (1,5 g / kg, Sigma-Aldrich Co, St Luis, MO) - förberedda som 20% lösning genom att späda 20 g av uretan i 100 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), dvs djuret får 7,5 ml / kg av uretan lösning intraperitonealy (IP). På grund av sin dos-respons-kurvan är den totala dosen av uretan uppdelat i fyra program, varje separerade med cirka 30 minuter. Innan de två första tillämpningarna av uretan, är djuret bedövas med isofluran administreras med en koncentration av 3-4% (syrgas vid 2 liter per minut) och underhålls på 2% (syre upp till 2 liter per minut) för att förhindra ett djur från blir stressade av injektion. Under operationen, kan en ytterligare administrering av isofluorane (2% koncentration i 2 minuter) användas vid behov.
- Raka pälsen längs snittet webbplats (dorsala sidan av huvudet) för att säkerställa attpälsen kommer inte att förorena såret och att ett tillräckligt område kan desinficeras runt snittet webbplatsen.
- Förbered operationsområdet desinficera med hjälp av organiska jod eller klorhexidin tvål och antiseptiska medel (etanol).
- Förbered kisel sonder (NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI). Givare kan desinficeras med 70% etanol följt av sköljning med destillerat vatten. Vid behov kan sonder målas med en fluorescerande markör beredd desinficera (t.ex. Dye jag, Invitrogen Co), för att senare avslöja ställning sonden i histologiska analys. För att göra detta använder vi ett litet och mycket mjuk pensel och fint tryck på baksidan av kisel sonden med färgen. Detta förfarande skall alltid ske över ett mikroskop för att se till att sonden inte är skadad eller böjd. Kontrollera alltid att se till att färgen inte blockerar någon av kanalerna. Eventuella kvarvarande färg kvar på sonden kan senare bort med alkohol, följt av sköljning med vatten.
- Silicon electrodes vård: På grund av deras ringa storlek, kisel sonder är känsliga och mycket känsliga för att bryta även när du använder den med stor omsorg. Därför rekommenderar vi att övervaka potentiella risker på alla tider, såsom: (i) Håll sonder i en vederbörligen utsedd låda, (ii) förhindra att krascha eller tappa sonder när du hanterar dem, (iii) Se till att stereotaxic manipulatorer väl är fasta för att förhindra olyckor, (iv) Vid inspelning, omgivande vävnad och / eller blod kan bifoga sonder. Därför är det viktigt att också vara försiktig när du avlägsnar sonder efter inspelning. Använda ett konstant flöde av PBS eller koksaltlösning rekommenderas, (v) Rengör alltid sonder efter inspelning. För att rengöra prober, rekommenderas det starkt att dränka dem i en vätska enzymatisk renare (Boston, Bausch & Lomb) i några minuter. Skölj alltid sonderna med destillerat vatten och återlämna dem till deras hängivna rutan. Enligt vår erfarenhet garanterar adekvat vård av kisel sondergod kvalitet inspelningar i mer än 10 experiment. Om en kanal "blir bullriga" under användning, bör det uteslutas från kommande analyser. Vi har funnit att överhörning mellan kanalerna är minimal, och därför en högljudd kanal vanligtvis har mycket liten effekt på en signal i andra kanaler.
2. Kirurgi
- Applicera en eye-salva på ögats yta innan någon operation manipulationer.
- Administrera Dexametason 5 mg / ml subkutant för att minska hjärninflammation.
- Fixera djuret i stereotaxic ram i hela operationen.
- Administrera Lidokain HCl 2% med adrenalin (2-4 mg / kg utspätt till 0,5% lösning) subkutant i snittet platsen innan snitt görs för att minska den potentiella risken för såret blödningar och för lokalbedövning.
- Gör en 2 cm snitt genom hårbotten mittlinjen och förskjuter huden i sidled för att exponera skallen ytan.
- Rensa rygg hårbotten från instrumentpanelen genom dissektion och kontrollblödningen genom microcautery eller med hjälp av ben vax.
- Gör två hål för att fästa små skruvar i occipital benet i skallen för djur jordning och referens. Hänvisningen skruv måste vara i kontakt med dura. För att minska elektriska störningar under inspelningarna, rekommenderas att hålla skruvarna blöt hela tiden. För att göra detta, kan en liten akryl barriär runt skruvarna skall byggas eller skruvarna kan täckas med agar.
- Gör en 1-2 kraniotomi mm i diameter vid koordinaterna motsvarar kortikala och / eller subkortikala område (n) av intresse 5. Använd tryckluft för att avlägsna ben damm som behövs under kraniotomi (borrning hål). Förhindra skallen värma upp från borrning genom att droppar av PBS. Göra en andra kraniotomi om det behövs för att infoga den andra sonden. I den här filmen presenterar vi en inspelning från två kortikala områden samtidigt, alltså två craniotomies görs.
- Bygg en liten barriär av akrylharts (t.ex. Lang DentalTillverkning, Co, Inc., Wheeting, IL) runt två craniotomies för att hålla PBS på toppen av exponerade duran, hindrar den från att torka. Tillsätt PBS konstant under hela experimentet.
- Öppna dura handlar både craniotomies. Två nålar (30 ½ spårvidd) böjda på tips (bildar en krok), kan användas för denna manipulation.
- Anslut kontakten på kisel sonder till stereotaxic manipulatiors. Kontakter är knutna till en stolpe för att ha skänklar av sonder helt parallellt med stereotaxic manipulator. Detta är avgörande för att upprätthålla stabila inspelningar och undvika sond skador.
- Anslut referens skruven till kisel sonden referens stift. För att minska elektriska störningar marken skruvar måste vara ansluten till: i) marken av sonden kontakten, ii) chassit marken från den färdskrivare, och iii) stereotaxic ram.
- Placera toppen av kisel sonder precis i kontakt med Pia.
- Långsamt införa ee kisel sonder och se till att skaften av kisel sonder (bild 1 & 2) kan sättas in i hjärnan utan motstånd eller böjs.
- Sänk försiktigt ned sonder tills den når önskad inspelning område. Om det behövs lägger droppar av PBS på toppen av craniotomies för att undvika uttorkning av vävnaderna.
- Eftersom uretan anestesi bör endast användas för terminalhantering förfaranden, är djuret avlivas genom att ett ip injektion av minst 200mg/kg av natrium pentobarbital spädas till en koncentration på högst 60 mg / ml. Detta följs genom halshuggning av djuret.
3. Representativa resultat:
Representant inspelningar av lokala fält potentialer och standardtillsatser aktivitet visas i Figur 3A. Efter att ha utfört spik sortering (diskriminerande spikes från olika nervceller, Fig. 3B, C, 6, 7, 8) kisel sond inspelningar ger möjlighet att undersöka neuronala befolkningen aktivitet inblandad i, ärOng andra, följande processer: minne och beslutsfattande 9, plasticitet 10, stimulans kodning 11, spontan aktivitet 12 och effekterna av olika droger 13.
Figur 1. A. Exempel på kisel sond med en enda skaft ovanpå ett montage av rekonstruerade nervceller (med tillstånd från S. Sakata 14).. B. Exempel på en sond med en tetrode konfiguration vid varje av de 8 skaft C. Schematisk bild av en råtta skallen. Den gröna rutorna representerar omfattningen av kraniotomi över höger och vänster somatosensoriska cortex.
Figur 2. Exempel på experimentera med kisel sonder in i prefrontala cortex och hippocampus. Droppar av PBS täcka kraniotomi till att skydda brAin från att torka. Två skruvar ligger över lillhjärnan kommer att anslutas till jord och referens, respektive.
Figur 3. A. Bilden visar 500ms av en representant elektrofysiologiska inspelning av lokala fältet Potential (LFP) från en tetrode (notera: negativ spänning ritas upp på ordinata). Sätt visar - en vågform i en spik B. Två-dimensionella vyer av enhet kluster i egenskap utrymme från 1 tetrode.. Varje grupp representerar spikar från en enda enhet (neuron). C. Genomsnittlig spik vågformer från representativa enheter (färgkodade) vid varje av de fyra inspelning platser från en enda tetrode. D. Waveform energi (relaterade till amplituden) av inspelade spikar över tiden . Notera den relativt konstant energi värden för varje enhet, vilket tyder på en stabil inspelning under hela den visade tidsperioden.
Discussion
Denna uppsats visar hur du använder matriser kisel elektroden för att spela in från stora population av nervceller (> 100) i flera kortikala områden samtidigt. För att vara framgångsrik i kirurgi och inspelning, bör följande frågor beaktas:
- Införande av sonder till ett önskat område: När du sätter i sonder i hjärnvävnaden, är det möjligt att orsaka stor skada. Detta kan resultera i en låg kvalitet på inspelade enheter. För att undvika detta problem rekommenderar vi följande: (i) Häll sonder i en viss vinkel (rekommenderas att använda en 10 graders vinkel). Genom att göra detta kan dendritiska skador av det inspelade nervceller reduceras, (ii) Efter sonder sätts in i hjärnvävnaden, de är initialt sänks i en snabbare takt (cirka 50 till 100 mikrometer per 10-30 sek) tills de kommer närmare det önskade området inspelning. När proberna är cirka 200 mikrometer från målområdet, är positionen justeras långsammare (caimately 10 mikrometer var 2 eller 3 minuter).
- Stabilisering av inspelningar: När sonder i det angivna området och stor aktivitet upptäcks (distinkt spikar i de flesta kanaler), rekommenderas att vänta ca 30 minuter innan du startar en inspelning. Detta gör att hjärnvävnaden att mekaniskt stabiliseras efter införandet av sonder och säkerställa en mer stabil inspelning.
- Brain pulsering: Ibland är det möjligt att se hjärnan pulsering som avsevärt kan försämra kvaliteten på en inspelning. En liten kraniotomi (precis tillräckligt utrymme för att passa sonden) kan minska hjärnans pulsering i en inspelning område. Vid behov kan Cisterna magna punkteras. Detta minskar cerebrospinalvätskan trycket och minskar svullnad och pulsering.
- Silicon sond konfiguration: Silicon sonder kan ha en mängd olika former och inspelning konfigurationer webbplats. Till exempel kan de varierar i antal skaft, längd och tjocklek på skaft, och iarrangemanget av inspelningen platser (t.ex. tetrode kontra linjär, se: www.neuronexustech.com). Valet av sond som används med en specifik konfiguration beror på den vetenskapliga frågan som behöver besvaras. Till exempel, om målet är att spela populationer av nervceller i flera platser i ett visst lager (som presenteras i dessa inspelningar), är det bästa valet att använda en sond med åtta skaft och en tetrode konfiguration. Detta möjliggör för inspelningar av flera enskilda enheter vid varje tetrode och provtagning av åtta platser över en 1,4 mm spännvidd. I ett annat exempel, om någon skulle vilja studera aktiviteten propagations över kortikala skikt, skulle det bästa valet vara att använda en prob med ett skaft med regelbundet fördelade inspelning platser längs det skaft som tillåter inspelning i flera kortikala skikt samtidigt 14.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSERC & AHFMR. Författarna tackar Mariam Alaverdashvili och Amanda Mauthe-Kaddoura för kommentarer på manuskriptet och Hiroe Yamazaki för hjälp om operationen förberedelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urethane | Sigma-Aldrich | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Isoflurane | Benson Medical Instruments | 02241315 | |
| Silicon probes | NeuroNexus Technologies | A 4 X 2 - Tet - 5mm - 150 - 200 – 312 | |
| Dye I (DiIC18(3)) | Invitrogen | 617830 | |
| Dexamethasone 5 | Vétoquinol | 0A0640B | |
| Eye ointment | Vétoquinol | 005165414 | |
| Lidocaine HCl 2% with Epinephrine | Bimeda-MTC | 00141984 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | 1430-B | |
| Electrode manipulator and holder | Kopf Instruments | 960 | |
| Rat ear-bars | Kopf Instruments | 1955 | |
| Rat adaptor | Kopf Instruments | 920 | |
| Anaesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Scalpel | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Scalpel blades | Paragon | 0086 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910 | |
| Screws | Gould Pasteners Limited | 14084701 | |
| Hemostatic forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7130 RS-7211 | |
| 30½ gauge needles | BD Biosciences | 305115 | |
| Micromotor control | Foredom | HP4-917 | |
| Dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5237 | |
| Bone wax | Lukens | M263500 | |
| Compressed air bottle | Falcon BD | 50-10521C | |
| Enzymatic cleaner | Bausch and Lomb | BAUSCH497628 | |
| Distilled water | |||
| Dental acrylic powder | Lang Dental | 1220 | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental | 1404 | |
| Digital Lynx SX System | Neuralynx Inc. | 4SX-Z400 | |
| Cheeta Softwere | Neuralynx Inc. | ||
| Alligator cables |
References
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat. Neurosci. 7, 446-451 (2004).
- Kipke, D. R. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J. Neurosci. 28, 11830-11838 (2008).
- Csicsvari, J. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J. Neurophysiol. 90, 1314-1323 (2003).
- Bartho, P. Characterization of neocortical principal cells and interneurons by network interactions and extracellular features. J. Neurophysiol. 92, 600-608 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain: in stereotaxic coordinates. , 4th Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, R53-R78 (1998).
- Harris, K. D., Henze, D. A., Csicsvari, J., Hirase, H., Buzsaki, G. Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements. J. Neurophysiol. 84, 401-414 (2000).
- Luczak, A., Narayanan, N. S. Spectral representation--analyzing single-unit activity in extracellularly recorded neuronal data without spike sorting. J. Neurosci. Methods. 144, 53-61 (2005).
- Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus. Science. 321, 1322-1327 (2008).
- Fujisawa, S., Amarasingham, A., Harrison, M. T., Buzsaki, G. Behavior-dependent short-term assembly dynamics in the medial prefrontal cortex. Nat Neurosci. 11, 823-833 (2008).
- Harris, K. D. How do neurons work together? Lessons from auditory cortex. Hear. Res. 271, 37-53 (2011).
- Luczak, A., Bartho, P., Marguet, S. L., Buzsaki, G., Harris, K. D. Sequential structure of neocortical spontaneous activity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 347-352 (2007).
- Robbe, D. Cannabinoids reveal importance of spike timing coordination in hippocampal function. Nat. Neurosci. 9, 1526-1533 (2006).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64, 404-418 (2009).
