Summary
Silikon sondalar anestezi sıçan kullanarak nöronal aktivitenin Ekstrasellüler kayıtları açıklanacaktır. Bu teknik, aynı anda 100 den fazla nöron birden çok beyin bölgelerinin daha fazla bilgi almak sağlar. Bu tek hücre çözünürlük ile, birden fazla yerel devrelerin nöronal toplulukları dinamikleri hakkında bilgi sağlar.
Abstract
Nöron toplulukları büyük ölçekli elektrofizyolojik kayıtlar beyindeki nöronların spike aktivite davranışları çok çeşitli VA'nın nasıl araştırmak için fırsat sunuyoruz. Birden fazla yerel nöronal devrelerin çok sayıda nöron aktivitesi spike izlemek için en etkili yöntemlerden biri, aynı anda 1-3 silikon elektrod kullanarak.
Aksiyon potansiyelleri, hücre somata çevresinde büyük transmembran voltaj değişiklikleri üretir. Bu çıkış sinyalleri, bir nöronun yakın bir iletkenden koyarak ölçülebilir. Ucu çevresindeki birçok aktif (spike) nöronlar varsa, elektrot, tek bir nöronun katkısı, onun 'elektrik mesafe' ile ağırlıklı hepsini kombine sinyali kaydeder. Silikon probları, çünkü kayıt siteleri (64) ve küçük hacimli bir sayıda birden fazla nöron izlemek için ideal kayıt elektrotları. Hatta bununyeniden, birden fazla siteleri, böylece çeşitli kortikal tabakalar halinde veya birden fazla kortikal sütunları nöronal aktivitenin eş zamanlı kayıtları (Şekil 1) izin milimetrelik bir mesafe üzerinden düzenlenmiş olabilir. Önemlisi, geometrik kesin kayıt sitelerin dağıtım izole tek nöronlar 4 mekansal ilişkinin belirlenmesi için de izin verir. Burada, silikon sondalar (Şekil 2) ile bir anestezi sıçan aynı anda sağ ve sol ön ayakları somatosensoriyel korteks, büyük ölçekli bir akut nöronal kayıt açıklar.
Protocol
1. Cerrahi Hazırlık
- Anesteziklerin uygun tip ve doz ile sıçan anestezisi. Burada üretan (1.5 g / kg, Sigma-Aldrich Co, St. Luis, MO) - 100 ml fosfat üretan 20 g seyreltilmesi ile% 20 çözüm olarak hazırlanmış, yani hayvan tamponlu salin (PBS) 7.5 alacaksınız ml / kg üretan solüsyonu intraperitoneal (IP). Nedeniyle doz-yanıt eğrisi, toplam doz üretan, her biri yaklaşık 30 dakika ayrılmış dört uygulamalar için ayrılmıştır. Üretan ilk iki uygulama öncesinde, hayvan bir hayvan önlemek için izofluran konsantrasyonu% 3-4 (dakikada 2 litre oksijen) uygulandığında (dakikada 2 litre oksijen) bakımı,% 2 ile uyuşturulduktan enjeksiyon yoluyla vurguladı. Ameliyat sırasında, isofluorane (2 dakika süreyle% 2 konsantrasyon) bir ek idari gerekirse kullanılabilir.
- Olmasını sağlamak için, insizyon yerinde (baş, sırt tarafı) boyunca kürk Tıraşkürk yara kontamine ve kesi yeri etrafında yeterli bir alan dezenfekte edilebilir değil.
- Antiseptically organik iyot ya da klorheksidin sabun ve antiseptikler (etanol) kullanılarak yapılan cerrahi sitesi hazırlayın.
- Silikon sondalar (NeuroNexus Teknolojileri, Ann Arbor, MI) hazırlayın. Probları distile su ile çalkalayın ve ardından% 70 etanol kullanılarak dezenfekte edilebilir. Gerekirse, sondalar, sonra histolojik inceleme prob konumunu ortaya çıkarmak için bir floresan işaretleyici (örneğin Boya, Invitrogen Co) antiseptically hazırlanan ile boyanabilir. Bunu yapmak için, küçük ve çok yumuşak bir boya fırçası kullanın ve ince boya ile silikon prob arkasına dokunun. Bu prosedür her zaman prob hasar görmüş ya da katlanmasını değildir emin olmak için bir mikroskop üzerinde yapılmalıdır. Her zaman boya kanallarının herhangi bir engelleme olmadığından emin olmak için kontrol edin. Probu üzerinde kalan herhangi bir kalıntı boya daha sonra su ile durulama ardından, alkol ile kaldırılabilir.
- Silikon elektrodes bakım: küçük boyutları nedeniyle, silikon sondalar hassas ve önemli bir bakım ile kullanırken bile kırılma son derece duyarlı. Böylece, bizim gibi her zaman, potansiyel tehlikelerin izlenmesi önerilir: (i) uygun bir şekilde belirlenmiş kutusunda probları tutun, (ii) çökmesini engelleyin ya da işlerken probları bırakarak, (iii) stereotaksik manipülatörler de sabit olduğundan emin olun. herhangi bir kazaları önlemek için; kayıt, (iv) çevre doku ve / veya kan probları ekleyebilirsiniz. Bu nedenle, kaydettikten sonra probları çıkarırken dikkatli olmak önemlidir. PBS veya tuzlu solüsyon sabit bir akış kullanarak şiddetle tavsiye edilir; (v) Her zaman kaydettikten sonra probları temiz. Problar temizlemek için, güçlü bir sıvı, bir kaç dakika için enzimatik temizleyici (Boston, Bausch & Lomb) batığın onları tavsiye edilir. Probları her zaman saf su ile yıkayın ve kendi adanmış kutusuna geri dönmek. Bizim tecrübelerimize göre, silikon sondalar yeterli bakım sağlar10'dan fazla deneyler için iyi kaliteli kayıtlar. Bir kanal kullanım sırasında gürültülü olur 'Eğer, daha sonraki analizler ekarte edilmelidir. Biz kanallar arasında cross-talk az olduğunu buldular, bu nedenle gürültülü bir kanal genelde diğer kanallarda bir sinyal üzerinde çok az etkisi vardır.
2. Cerrahi
- Herhangi bir cerrahi manipülasyonlar önce göz yüzeyi üzerinde bir göz merhemi sürün.
- Beyin iltihabı azaltmak için 5 mg / ml subkutan Deksametazon yönetin.
- Ameliyat boyunca stereotaksik çerçeve hayvan sabitleyin.
- , Yara kanama ve lokal anestezi için potansiyel riskini azaltmak için kesi yapılmadan önce insizyon yerinde subkutan epinefrin (2-4 mg / kg% 0.5 çözümü için seyreltilmiş) Lidokain HCl% 2 Yönetici.
- Kafa derisinin orta hat üzerinden 2 cm'lik bir kesi yapmak ve kafatası yüzeyi maruz yanal cilt yerinden.
- Fasya künt diseksiyon ve kontrolü ile dorsal kafa derisi temizleyinmicrocautery veya kemik balmumu kullanarak kanama.
- Oksipital kemik, hayvan topraklama ve başvuru için kafatası küçük vida takmak için iki delik olun. Referans vida dura ile temas halinde olmalıdır. Kayıtları sırasında elektriksel gürültü azaltmak için, her zaman ıslak vidaları tutmak için tavsiye edilir. Bunu yapmak için, vidaları çevreleyen küçük bir akrilik bariyer inşa edilmesi ya da vida agar ile kaplı olabilir.
- 1-2 mm çapında kraniotomi ilgi 5 kortikal ve / veya subkortikal alan (lar) karşılık gelen koordinatlar olun. (Delik delme) kraniotomi sırasında gerekli olarak kemik tozu temizlemek için basınçlı hava kullanın. Kafatası PBS damla uygulayarak delme ısınmak önleyin. Ikinci sonda eklemek için gerekirse ikinci bir kraniotomi olun. Bu videoda, bu nedenle iki cerrahinin yapılan, iki kortikal alanlar aynı anda bir kayıt sunuyoruz.
- Diş Lang: akrilik reçine küçük bir bariyer (örneğin oluşturunİmalat, Co, Inc, Wheeting, IL), kurumasını engelleyen maruz dura üstüne PBS tutmak amacıyla iki cerrahinin çevreleyen. Tüm deney sırasında sürekli PBS uygulayın.
- Her iki cerrahinin dura madde açın. İki iğneler (30 ½ ölçer) ipuçları (kanca oluşturan) bükülmüş, bu manipülasyonu için kullanılıyor olabilir.
- Stereotaksik manipulatiors silikon sondalar konnektörü takın. Konnektörler stereotaksik manipülatör mükemmel paralel probları Shanks sahip olmak için bir direğe bağlı. Bu istikrarlı kayıtları korumak ve prob zarar görmesini önlemek için çok önemlidir.
- Referans vida, silikon prob referans pin bağlayın. Ii) şasi kayıt cihazı zemin; ve iii) stereotaksik frame i) prob fişi zemin toprak vidası bağlı olmak zorunda elektriksel gürültü azaltmak için.
- Silikon sondalar sadece pia ile temas ucu yerleştirin.
- Yavaş yavaş inci tanıtmake silikon sondalar ve silikon sondalar (Şekil 1 ve 2) Shanks direnci veya bükmeden beynin içine eklenebilir emin olun.
- İstediğiniz kayıt alanı ulaşana kadar dikkatlice probları düşüktür. Gerekirse, doku kurumasını önlemek için cerrahinin en üst PBS damla damlatılır.
- Üretan anestezi sadece terminal prosedürleri için kullanılması gerektiğini, çünkü hayvan, en azından sodyum 200mg/kg bir ip enjeksiyonu ile ötenazi pentobarbital en fazla 60 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ile seyreltilir. Bu hayvan dekapitasyon tarafından takip edilmektedir.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 3A yerel alan potansiyelleri ve spike aktivitesi Temsilcisi kayıtları gösterilmiştir. Başak sıralama (Şekil 3B, C; farklı nöronların kaynaklanan ayrımcı ani 6, 7, 8) gerçekleştirdikten sonra silikon prob kayıtları, yer nöronal nüfus faaliyetlerini araştırmak olanağı sağlardiğer ong, aşağıdaki işlemleri: 9 verme bellek ve karar, plastisite 10, uyaran kodlama 11, spontan aktivite 12 ve 13 çeşitli ilaçların etkileri.
Şekil 1. Tek bir sap ile silikon prob A. Örnek yeniden inşa nöronların (S. Sakata 14 nezaket) bir montaj üst üste 8 Shanks her tetrode yapılandırma ile bir prob B. Örnek bir C şematik Sıçan kafatası. Yeşil kutuları sağ ve sol somatosensoriyel korteks üzerinde kraniotomi ölçüde temsil eder.
Şekil 2, prefrontal korteks ve hipokampus takılı silikon sondalar deney örneği . PBS Damlalar maruz br korumak için kraniotomi kapağıkurumasını değil. Beyincik üzerinde bulunan iki vidayı sırasıyla, zemin ve referans bağlı olacaktır.
Şekil 3. A. Resmi bir tetrode (negatif gerilim koordine çizilen notu) Yerel Alan Potansiyeli (LFP) bir temsilcisi elektrofizyolojik kayıt 500ms gösterir. Ekle gösterir. Başak B. bir dalga İki boyutlu 1 tetrode özelliği uzayda birim kümeleri kez. Her küme, tek bir birim (nöron) ani zaman içinde tek bir tetrode dört kayıt sitelerin her birinde C. temsilcisi birimlerinden ortalama başak dalga şekilleri (renk kodlu). D. Dalgaformu enerji (genlik ile ilgili) kaydedilen ani temsil eder . . Her birim için nispeten sabit enerji değerleri unutmayın; görüntülenen dönemi süresi boyunca istikrarlı bir kayıt gösterir.
Discussion
Bu kağıt, silikon elektrot dizileri aynı anda birden fazla kortikal bölgelerde nöronların (> 100) büyük bir nüfus kayıt için nasıl kullanılacağını gösterir. Başarılı cerrahi ve kayıt olmak için, aşağıdaki hususlar dikkate alınmalıdır:
- Istenen alana probları Giriş: beyin dokusunda probları takarken, önemli hasara neden olabilir. Bu düşük kalitede kaydedilen birimlerinin neden olabilir. Bu sorunu önlemek için aşağıdakileri öneririz: (i) belirli bir derecelik bir açıyla (10 derecelik açı kullanmanız önerilir) probları tanıtın. Bunu yaparak, kaydedilen nöronlar dendritik zarar azaltılabilir; probları beyin dokusu eklenir sonra aldıkları kadar, (ii) başlangıçta daha hızlı bir oranda (10-30 saniyede yaklaşık 50 ila 100 mikron) indirdi. Kayıt istenen alana yakın. Problar hedef alan yaklaşık 200 mikron olan, pozisyonlar (yaklaşık daha yavaş ayarlanır.yaklaflık 10 mikron her 2 ya da 3 dakika).
- Kayıt Stabilizasyonu: probları alan ve önemli bir aktivite (kanallarının çoğunda belirgin sivri) tespit edildiğinde, bir kayıt başlamadan önce yaklaşık 30 dakika beklemek tavsiye edilir. Bu beyin dokusu mekanik probların yerleştirilmesinden sonra stabilize ve daha istikrarlı bir kayıt sağlamak için izin verecektir.
- Beyin nabız: Bazen bir kayıt kalitesini önemli ölçüde azaltabilir beyin nabız görmek mümkündür. Küçük bir kraniotomi (prob sığdırmak için yeterli alan) bir kayıt alan beyin nabız azaltabilir. Gerekirse, sisterna magna yırtılmış olabilir. Bu, beyin omurilik sıvısı basıncı azaltır ve şişme ve nabız azalır.
- Silikon prob konfigürasyonu: Silikon probları şekil ve kayıt sitesi yapılandırmaları çeşitli olabilir. Örneğin, Shanks, Shanks uzunluğu ve kalınlığı sayısı değişir, ve.kayıt siteleri (www.neuronexustech.com örneğin tetrode vs doğrusal yapılandırma) aranjman. Belirli bir yapılandırma ile kullanılan prob seçimi, cevaplanması gereken gerek bilimsel bir soru bağlıdır. Örneğin, belirli bir katman (bu kayıtlar sunulmuştur) birden fazla yerde nöronların nüfus kayıt ise, en iyi seçimdir, sekiz Shanks ve tetrode yapılandırma ile bir prob kullanmaktır. Bu 1.4mm süresi boyunca sekiz yerlerde her tetrode ve örnekleme birden tek birimlerinin kayıtları için sağlar. Bir başka örnekte, biri kortikal katmanlar arasında faaliyet propagations çalışma isterseniz birden fazla kortikal tabakalar halinde kayıt anda 14 izin veren şaft boyunca düzenli olarak dağıtıldı kayıt siteleri ile bir sap ile bir prob kullanmak için en iyi seçim olacaktır .
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NSERC & AHFMR tarafından desteklenmiştir. Yazarlar cerrahi hazırlığı ile ilgili yardım için, el yazması ve Hiroe Yamazaki yorumlar için teşekkür ederim. Mariam Alaverdashvili ve Amanda Mauthe-Kaddoura
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urethane | Sigma-Aldrich | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Isoflurane | Benson Medical Instruments | 02241315 | |
| Silicon probes | NeuroNexus Technologies | A 4 X 2 - Tet - 5mm - 150 - 200 – 312 | |
| Dye I (DiIC18(3)) | Invitrogen | 617830 | |
| Dexamethasone 5 | Vétoquinol | 0A0640B | |
| Eye ointment | Vétoquinol | 005165414 | |
| Lidocaine HCl 2% with Epinephrine | Bimeda-MTC | 00141984 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | 1430-B | |
| Electrode manipulator and holder | Kopf Instruments | 960 | |
| Rat ear-bars | Kopf Instruments | 1955 | |
| Rat adaptor | Kopf Instruments | 920 | |
| Anaesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Scalpel | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Scalpel blades | Paragon | 0086 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910 | |
| Screws | Gould Pasteners Limited | 14084701 | |
| Hemostatic forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7130 RS-7211 | |
| 30½ gauge needles | BD Biosciences | 305115 | |
| Micromotor control | Foredom | HP4-917 | |
| Dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5237 | |
| Bone wax | Lukens | M263500 | |
| Compressed air bottle | Falcon BD | 50-10521C | |
| Enzymatic cleaner | Bausch and Lomb | BAUSCH497628 | |
| Distilled water | |||
| Dental acrylic powder | Lang Dental | 1220 | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental | 1404 | |
| Digital Lynx SX System | Neuralynx Inc. | 4SX-Z400 | |
| Cheeta Softwere | Neuralynx Inc. | ||
| Alligator cables |
References
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat. Neurosci. 7, 446-451 (2004).
- Kipke, D. R. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J. Neurosci. 28, 11830-11838 (2008).
- Csicsvari, J. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J. Neurophysiol. 90, 1314-1323 (2003).
- Bartho, P. Characterization of neocortical principal cells and interneurons by network interactions and extracellular features. J. Neurophysiol. 92, 600-608 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain: in stereotaxic coordinates. , 4th Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, R53-R78 (1998).
- Harris, K. D., Henze, D. A., Csicsvari, J., Hirase, H., Buzsaki, G. Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements. J. Neurophysiol. 84, 401-414 (2000).
- Luczak, A., Narayanan, N. S. Spectral representation--analyzing single-unit activity in extracellularly recorded neuronal data without spike sorting. J. Neurosci. Methods. 144, 53-61 (2005).
- Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus. Science. 321, 1322-1327 (2008).
- Fujisawa, S., Amarasingham, A., Harrison, M. T., Buzsaki, G. Behavior-dependent short-term assembly dynamics in the medial prefrontal cortex. Nat Neurosci. 11, 823-833 (2008).
- Harris, K. D. How do neurons work together? Lessons from auditory cortex. Hear. Res. 271, 37-53 (2011).
- Luczak, A., Bartho, P., Marguet, S. L., Buzsaki, G., Harris, K. D. Sequential structure of neocortical spontaneous activity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 347-352 (2007).
- Robbe, D. Cannabinoids reveal importance of spike timing coordination in hippocampal function. Nat. Neurosci. 9, 1526-1533 (2006).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64, 404-418 (2009).
