Summary
फंक्शन स्पेसर - लिपिड constructs (FSL) जीवित कोशिकाओं और virions की सतह विशेषताओं के जीवन शक्ति के नुकसान के बिना संशोधित करने की अनुमति है. विधि केवल एक सेल / virion और सहज और स्थिर सतह समावेश होता है के साथ एक FSL का निर्माण समाधान के सरल संपर्क की आवश्यकता है.
Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल FSL constructs जैविक झिल्ली में (चित्रा 1) प्रविष्टि के लिए सामान्य प्रक्रिया का वर्णन है. सादगी के लिए प्रोटोकॉल केवल (kodecytes) कोशिकाओं, जो एक 100% एकाग्रता में कर रहे हैं करने के लिए संदर्भित करेंगे. हालांकि, शब्द कोशिकाओं virions (kodevirions) या जीवों या सेलुलर संरचनाओं और मंदक में उनकी एकाग्रता के साथ परस्पर विनिमय है महत्वपूर्ण नहीं है, बशर्ते वह हमेशा परीक्षण, नियंत्रण, और प्रयोगों के बीच संगत है. लाल रक्त कोशिकाओं के साथ पैक सेल मात्रा आमतौर पर 80% है, लेकिन virions, भ्रूण और अन्य कोशिकाओं के साथ यह आम तौर पर 1% से कम है. विधि बहुत मजबूत है और संशोधित झिल्ली का उत्पादन जब अपने किसी भी विविधताओं के द्वारा इस्तेमाल किया जाएगा, लेकिन शोधन के लिए अनुकूलन और विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक संशोधन की डिग्री मानकीकरण की आवश्यकता होगी.
1. FSL की तैयारी constructs
- FSL निर्माण स्टॉक समाधान पहले reconstitute मंदक के 1.0mL (या उत्पाद डालने में निर्दिष्ट के रूप में) के अलावा द्वारा उत्पाद शीशी सूखी FSL उत्पाद (1 टेबल) तैयार करने के लिए. संक्षेप में sonicate (30 सेकंड). यह एक 1mg/mL समाधान, जो 100 μL बाँझ कंटेनर में aliquoted जा सकता है और 2-8 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस एक सप्ताह के लिए, या 3 महीने के लिए जमे हुए तैयार करेंगे.
- प्रविष्टि के लिए काम कर तैयार FSL समाधान का निर्माण, बस पहले संक्षेप sonicate स्टॉक (30 सेकंड) का उपयोग समाधान के लिए किसी भी micelles homogenize. या एक सीमा से अधिक आवश्यक एकाग्रता अगर वांछित FSL निर्माण (अधिमानतः लिपिड युक्त या अत्यधिक hydrophobic सामग्री नहीं) के बफर में पतला.
नोट:
- FSL constructs आमतौर पर मीडिया में लिपिड युक्त कोशिकाओं में सम्मिलित होगा, लेकिन आमतौर पर के रूप में एक 50X उच्च FSL काम कर रहे सांद्रता के रूप में ज्यादा अगर पीबीएस या अन्य लिपिड स्वतंत्र मीडिया में की आवश्यकता होगी.
- काम कर रहे सीमा dilutions आवेदन, पहचान पद्धति संवेदनशीलता, FSL निर्माण के प्रकार, और आवश्यक संशोधन की डिग्री पर निर्भर करेगा. आमतौर पर कमजोर पड़ने की सीमा कार्बोहाइड्रेट FSL constructs के लिए 10-500 मंदक के एमएल प्रति FSL के μg और 1-100 μg / fluorophores और बायोटिन जैसे अन्य FSL constructs के लिए एमएल के बीच किया जाएगा.
- यदि सम्मिलन diluents युक्त कई FSL निर्माण की तैयारी, बस constructs एक साथ जोड़ने के अपने सामान्य काम एकाग्रता में ही मंदक में. है अगर एक निर्माण दूसरे से बहुत उच्च एकाग्रता में है, एकाग्रता में कुछ समायोजन (वृद्धि) कम का निर्माण के लिए आवश्यक हो सकता है. वैकल्पिक रूप से constructs क्रमिक रूप से जोड़ा जा सकता है, अधिमानतः के साथ पहले सर्वोच्च एकाग्रता का निर्माण, कम द्वारा पीछा किया.
- FSL 1000 μg / एमएल ऊपर निर्माण सांद्रता एक कोशिका झिल्ली में लिपिड का महत्वपूर्ण मात्रा में परिचय, कर सकते हैं और सेल की आकृति बदल कर सकते हैं या इसे और अधिक lysis के लिए अतिसंवेदनशील बनाते हैं.
- FSL निर्माण काम कर समाधान 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और कुछ दिनों के भीतर इस्तेमाल किया.
- FSL constructs पानी में पतला किया जा सकता है लेकिन स्थिरता कम होगा और घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यदि पैकेज डालने के पुनर्गठन मंदक के रूप में पानी निर्दिष्ट उत्पाद शीशी में भी लवण (के रूप में डालने के पैकेज में निर्दिष्ट) में शामिल होंगे.
2. FSL निर्माण (ओं) की झिल्ली में निवेशन
- पहले centrifugation द्वारा अनबाउंड lipids की FSL संशोधन मुफ्त के लिए कोशिकाओं और धोने धोने के समाधान के रूप में पीबीएस या लिपिड मुक्त सेल मीडिया का उपयोग.
- कोशिकाओं को पैक या मंदक के 100 μL में निलंबित.
- इसके साथ ही नियंत्रण है जो आदर्श दोनों असंशोधित कोशिकाओं (बजाय FSL समाधान पीबीएस साथ incubated) और / या कोशिकाओं है एक सौम्य, लेकिन संबंधित FSL के निर्माण के साथ संशोधित किया जाना चाहिए तैयार करते हैं.
- कोशिकाओं को FSL समाधान (1 या अधिक FSL constructs युक्त) के एक उपयुक्त कमजोर पड़ने के 100 μL जोड़ें और 37 में 1-2 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस इसी प्रकार का एक परिणाम 25 6 घंटे ऊष्मायन द्वारा प्राप्त किया जा सकता डिग्री सेल्सियस या 4 बजे रात (18 घंटे) डिग्री सेल्सियस - हर कुछ घंटों के मिश्रण की सिफारिश की है अगर भारी सेल निलंबन का इस्तेमाल कर रहे हैं.
- पीबीएस (वैकल्पिक) या मीडिया के साथ दो बार धो करने के लिए किसी भी मुफ्त FSL constructs को हटाने और एक उचित निलंबन तैयार.
नोट:
- कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए इस्तेमाल किया मंदक सेल संस्कृति मीडिया, Pbs, सेल भंडारण समाधान, आदि हो सकता है, लेकिन अधिमानतः (जैसे भ्रूण बछड़ा सीरम लिपिड) या डिटर्जेंट (जैसे tween) के बिना कर सकते हैं.
- विभिन्न संस्करणों (100 μL से) (1:01 कोशिकाओं / FSL समाधान की तुलना में) अनुपात या समय और तापमान की ऊष्मायन शर्तों उसी अनुपात, एकाग्रता, और मात्रा प्रदान की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया इस्तेमाल किया जा सकता है.
3. हैंडलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन
- Kodecytes एक बार FSL संशोधन की प्रक्रिया पूर्ण हो गया है लिपिड मुक्त मीडिया में 4-8 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है या इस्तेमाल किया.
- Kodecytes और kodevirions असंशोधित कोशिकाओं / virions के रूप में आम तौर पर वही व्यवहार और handl जा सकता हैएड और सामान्य परीक्षण प्रणाली (माइक्रोस्कोपी, सीरम विज्ञान, प्रवाह cytometry, आदि) के अंतर्गत देखा. वे आम तौर पर सॉल्वैंट्स / डिटर्जेंट / lipids कि झिल्ली से लिपिड constructs elute सकता है के बचाव के लिए छोड़कर कोई विशेष आवश्यकताओं है.
नोट:
- Constructs लाल कोशिकाओं के रूप में निष्क्रिय कोशिकाओं की झिल्ली में रहते हैं, अगर सेल के जीवन के लिए लिपिड स्वतंत्र मीडिया में संग्रहीत होगा. सक्रिय झिल्ली के साथ कोशिकाओं में constructs और भली भाँति हो जाएगा metabolized एक कोशिका झिल्ली गतिविधि पर निर्भर दर पर.
- मृत कोशिकाओं को आमतौर पर FSL constructs के उच्च स्तर शामिल होंगे, यह व्यवहार्य कोशिकाओं से nonviable कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- यदि kodecytes (या vivo में प्रयुक्त) लिपिड में संग्रहीत हैं युक्त मीडिया / सीरम / प्लाज्मा का निर्माण जैसे वातावरण, घंटे या दिन की अवधि में धीरे धीरे झिल्ली से elute जाएगा तापमान और लिपिड सांद्रता / रचनाओं पर निर्भर करता है ,.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
- निम्न प्रतिनिधि के परिणाम पर निर्भर निर्माण किया (1 टेबल), अपनी एकाग्रता डाला और रिश्तेदार और पहचान प्रणाली (ओं) की संवेदनशीलता और विशिष्टता. सामान्य में 1 घंटे के बाद सभी FSL constructs कोशिकाओं में सम्मिलित लेकिन इष्टतम स्थितियों के लिए प्रत्येक स्थिति के लिए स्थापित की आवश्यकता होगी.
- FSL constructs जीवित कोशिकाओं की एक किस्म 3-9,11,14 के बाहर लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 2 चित्र में दिखाया गया उदाहरण में विभिन्न चरणों में भ्रूण (के रूप में वे एक नाजुक सेल) इस्तेमाल किया गया, लेकिन अन्य कोशिकाओं (चित्रा 3) या छा virions (चित्रा 4) भी लेबल किया जा सकता है. FSL - fluorescein सतहों के प्रत्यक्ष लेबलिंग (04/02 आंकड़े) के लिए अनुमति देता है, जबकि FSL - बायोटिन और अन्य FSL constructs एक माध्यमिक पहचान प्रणाली (आमतौर पर avidin / एंटीबॉडी / lectins) के उपयोग की आवश्यकता करने के लिए उनकी उपस्थिति (5 आंकड़े) दिखा सकते हैं .
- मानव या पशु विशिष्टता के रक्त समूह मार्करों लाल 4-9 कोशिकाओं (चित्रा 6) सहित कोशिकाओं, के लिए संलग्न किया जा सकता है. FSL की राशि के रूप में एक kodecyte पर निर्माण नियंत्रणीय और 4-6 प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, एंटीबॉडी quantitation के लिए kodecytes (2 टेबल और चित्रा 6) बनाया जा सकता है. कक्षों की वास्तविक स्रोत महत्वपूर्ण नहीं है, वे किसी भी प्रजाति की हो, या कर सकते हैं एंटीबॉडी के स्रोत के रूप में में एक ही मूल के भी है, जिससे केवल असंगत प्रतिजन पर सुनिश्चित करना है कि FSL 7,8 (चित्रा 6) द्वारा शुरू की.
टेबल 2. तीन अलग अलग FSL - ए (त्रिकोणीय) लाल सेल kodecytes के प्रतिनिधि सीरम वैज्ञानिक प्रतिक्रियाओं मोनोक्लोनल - विरोधी एक dilutions के खिलाफ जांच की. FSL एक (त्रिकोणीय) के 50 सुक्ष्ममापी समाधान जब समूह ओ लाल कोशिकाओं के एक बराबर मात्रा के साथ incubated मजबूत एक सकारात्मक प्रतिजन कोशिकाओं है, जो मोनोक्लोनल - विरोधी एक 1:512 कमजोर पड़ने से पता लगाया जा सकता है का उत्पादन किया. 5 - और 10 गुना कम FSL - ए (त्रिकोणीय) समाधान कम रक्त समूह प्रतिजन अभिव्यक्ति के साथ kodecytes का उत्पादन किया.
चित्रा 1. FSL निर्माण सिंहावलोकन. एक फूल FSL constructs की तरह तीन प्रमुख घटक होते हैं. FSL निर्माण के मामले में कार्यात्मक सिर (एफ) अलग biologically कार्य समूहों की एक किस्म, (एस) स्पेसर एफ के रिक्ति झिल्ली से दूर प्रेरित, पानी dispersibility में सुधार और सीरम के साथ गैर प्रतिक्रियाशील डिजाइन किया जा सकता है, जबकि diacyl लिपिड की अनुमति देता है का निर्माण अनायास सतहों में शामिल करने के लिए. (मैं) एक रक्त समूह 3 जीबी (या पी कश्मीर) के साथ FSL GB3 मिलान Galα4Galβ4Glcβ trisaccharide . (द्वितीय) FSL - ए (त्रिकोणीय) एक रक्त समूह एक trisaccharide GalNAcα3 मिलान (Fucα2) Galβ के साथ. (III) FSL - fluorescein. (चतुर्थ) FSL - बायोटिन साथ एक एकल बायोटिन एफ आधा भाग. मैं-III में संरचनाओं के कार्यात्मक समूह dioleoylphosphatidylethanolamine के एक सक्रिय Adipate व्युत्पन्न (डोप) संयुग्मित हैं जबकि चतुर्थ संरचना के स्पेसर carboxymethylglycine - Adipate आधारित है.
चित्रा 2. FSL fluorescein murine भ्रूण लेबल. सभी छवियों रहते भ्रूण कि जब उनके zona pellucida (जिला परिषद) बरकरार था (यानी FSL निर्माण जिला परिषद के माध्यम से पारित कर दिया अंदर भ्रूण लेबल) लेबल रहे थे हैं. छवियाँ मैं चतुर्थ जिला परिषद मुक्त FSL - fluorescein साथ एसिड tyrodes पोस्ट लेबलिंग के साथ अपने जिला परिषद से जारी भ्रूण की हैं. समान धुंधला की परवाह किए बिना कि क्या भ्रूण थे FSL जिला परिषद बरकरार या जिला परिषद मुफ्त के साथ संशोधित होता है. भ्रूण सीधे FSL - fluorescein के साथ लेबल रहे हैं, 2 घंटे 37 ° सीरम मुक्त सेल संस्कृति मीडिया में सी विधि द्वारा, धोया और फिर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के अंतर्गत देखा. (मैं) जिला परिषद मुक्त दो सेल murine भ्रूण, भी क्लासिक तीव्र ध्रुवीय शरीर धुंधला दिखा. जिला परिषद (द्वितीय III) चार सेल और आठ सेल भ्रूण murine मुक्त, दोनों दिखा बहिष्कार कर रहे हैं जो कोशिकाओं के धुंधला अस्पष्टआईडीई ध्यान देने की खुर्दबीन विमान. जिला परिषद (चतुर्थ) मुफ्त 16 सेल murine भ्रूण. जिला परिषद (वि) बरकरार murine ब्लास्टोसिस्ट (d4-d5) भ्रूण जहां दोनों भ्रूण और zona लेबल रहे हैं.
चित्रा 3 FSL - fluorescein और zebrafish 14. (मैं) Microangiography 52 HPF (घंटे पोस्ट निषेचन) zebrafish लार्वा पर FSL - fluorescein साथ संचलन में सीधे इंजेक्शन. zebrafish vasculature दाग है. (द्वितीय) FSL fluorescein heterogenous Zebrafish गुर्दे ऊतक कोशिकाओं (ZK kodecytes) पूर्व vivo बनाया गया तो एक 52 HPF प्राप्तकर्ता Zebrafish के संचलन में सूक्ष्म इंजेक्शन ZK kodecytes के vivo टिप्पणियों में पोस्ट इंजेक्शन 2 घंटे के इमेजिंग द्वारा किए गए समय चूक माइक्रोस्कोपी के साथ प्रतिदीप्ति तहत vasculature. दिखाया बड़ी धीमी गति से चलती या स्थिर (नारंगी तीर के साथ संकेत) कोशिकाओं और तेजी से बढ़ कोशिकाओं (हरी तीर के साथ संकेत धुंधला आंदोलन करने के लिए कारण छवियाँ) के साथ एक एकल वीडियो फ्रेम है. लेबल व्यवहार और ZK kodecytes biodistribution के vivo अवलोकन में वास्तविक समय के लिए अनुमति देता है . (III) FSL fluorescein के मौखिक तेज FSL fluorescein में zebrafish भ्रूण डुबो 5 दिनों के लिए मीडिया से युक्त द्वारा हासिल है. वॉशिंग कोई FSL constructs (कम से कम 6 घंटे की आवश्यकता है, लेकिन कई दिनों के लिए किया जा सकता है) से युक्त मीडिया में भ्रूण स्थानांतरित करके हासिल की थी. (IIIa) FSL fluorescein इलाज आसन्न प्रतिदीप्ति छवि (IIIb) करने के लिए इसी zebrafish के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी. fluoresence preferentially आंत्र पथ में स्थित था. नहीं धुंधला इलाज नियंत्रण भ्रूण (IVA और IVB) में मनाया गया.
चित्रा 4. Virions 10 VSV और H1N1 के FSL - fluorescein लेबलिंग. (मैं) vesicular stomatitis (VSV) वायरस सीधे 37 पर 10 μg / एमएल 2 घंटे के लिए FSL - fluorescein लेबल के साथ किया गया था डिग्री सेल्सियस, 4% paraformaldehyde और फिर प्रवाह cytometry के साथ फिक्सिंग के द्वारा पीछा किया. VSV kodevirion पोस्ट FSL लेबलिंग नहीं शुद्धि आवश्यक था. (द्वितीय) स्वाइन वृषण मानव ए / पर्टो Rico/8/1934 (H1N1) से संक्रमित कोशिकाओं के प्रवाह cytometry kodevirions FSL - fluorescein का उपयोग लेबल. असंक्रमित कोशिकाओं काला लाइन के रूप में देखा जाता है जबकि एक फ्लोरोसेंट सेल (लाल रेखा) में अनुसूचित जनजाति कोशिकाओं के परिणामों के साथ H1N1 kodevirion के संलयन.
चित्रा 5 FSL बायोटिन लेबल लेबल 7,8 avidin के माध्यम से और बाद में दृश्य कोशिकाओं. सभी कोशिकाओं को पहली बार 37 से कम 1 घंटे ° C के लिए FSL - बायोटिन के साथ लेबल, धोया तो avidin लेबल fluorophore, धोया और गीला प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए मुहिम शुरू की के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की. (मैं) एक murine भ्रूण ब्लास्टोसिस्ट की confocal छवि संकलित. (द्वितीय) पिछले छवि से भ्रूण के केन्द्रीय confocal टुकड़ा. (III) चलता - फिरता मानव शुक्राणु लाइव - धुंधला उनके प्रस्ताव का एक परिणाम के के रूप में होता है. फिक्स्ड (चतुर्थ) (4% paraformaldehyde पोस्ट सम्मिलन) मानव शुक्राणु. (वी) मानव एरिथ्रोसाइट. (VI) फिक्स्ड (4% paraformaldehyde पूर्व प्रविष्टि) RL95 एंडोमेट्रियल मानव कार्सिनोमा. (सातवीं) unfixed RL95 एंडोमेट्रियल मानव कार्सिनोमा सेल लाइन. (आठवीं) बायोटिन आरबीसी रक्त नमूना लिया 2 घंटे (VIIIa) एक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत मुख्य देखी गयी मुख्य क्षेत्र का प्रतिनिधित्व के साथ kodecytes के अंतःशिरा निषेचन के बाद, जबकि (VIIIb) प्रतिदीप्ति तहत देखी गयी वही क्षेत्र है दो क्षेत्र में मौजूद kodecytes की पहचान में मनाया kodecytes देखने का. Unlabeled कोशिकाओं को kodecytes के अनुपात की गणना उपयोग अस्तित्व का एक संकेतक के रूप में किया जा सकता है. (ग्यारहवीं) लाइव मानव एंडोमेट्रियल बायोटिन kodecytes avidinylated मोती के लिए बाध्य द्वारा visualized.
चित्रा 6 serologic रूपरेखा के लिए रक्त समूह मार्करों जोड़ FSL - कार्बोहाइड्रेट. (मैं) मानव लाल कोशिका Galili kodecytes FSL - Galili के एक सेट एकाग्रता (500 μg / एमएल) के साथ बनाया गया था और मानव सीरम के dilutions के खिलाफ जांच की. मानव लाल कोशिकाओं xenoantigen Galili प्रतिजन के साथ स्वाभाविक रूप से नहीं होती है. ऐसे kodecytes सीरम में एंटीबॉडी की मात्रात्मक स्तर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस उदाहरण में दाता के लिए 1:32 के एक विरोधी Galili titre निर्धारित किया गया था. (द्वितीय) FSL के घटते स्तर ("प्रतिजन titres"), एक इष्टतम प्रतिजन के स्तर के साथ kodecytes बनाने के एंटीबॉडी का पता लगाने करके निर्धारित किया जा सकता है (इस ले एक उदाहरण में). कक्ष के लिए केवल एक सकारात्मक परिणाम दे जब एंटीबॉडी के स्तर पर एक विशिष्ट titre से अधिक करने के लिए बनाया जा सकता है. FSL के लिए एक सकारात्मक परिणाम देने के लिए आवश्यक प्रतिजन के स्तर में गुणवत्ता और एंटीबॉडी के स्तर का पता लगाया जा रहा है पर निर्भर करता है. कार्बोहाइड्रेट प्रतिजनों के लिए, 100 μg / एमएल के एक FSL समाधान आम तौर पर एक मजबूत सकारात्मक प्रतिक्रिया में परिणाम देगा. (III) मानव समूह ओ लाल कोशिकाओं को एक चींटी का एक विशिष्ट स्तर के लिए संशोधित किया गया हैigen (एक kodecytes मानकीकृत), और सही और reproducibly मानव सीरम में विरोधी एक quantitate किया. इस उदाहरण में विरोधी एक titre समूह हे सीरम परीक्षण किया में 1:32 है और kodecytes दाता के अपने लाल कोशिकाओं से तैयार किया गया है. (चतुर्थ) रक्त समूह ए और बी एक साथ एक एकल समूह ओ लाल सेल नमूना में डाला प्रतिजनों के लिए एक कमजोर बी kodecytes कमजोर बनाने के लिए उपयोग किया जाता है. ये kodecytes ABO गुणवत्ता नियंत्रण के प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस परिणाम विशेष रूप से तैयार एक कमजोर बी कमजोर विरोधी एक और विरोधी बी अभिकर्मकों के खिलाफ जांच kodecyte देता है और कमजोर प्रतिक्रियाओं की उम्मीद के विश्लेषण से पता चलता है.
Discussion
FSL constructs के साथ कोशिकाओं और virions संशोधित एक बहुत ही सरल और मजबूत 3-11 तकनीक है . का वर्णन है और भेद FSL असंशोधित कोशिकाओं से संशोधित कोशिकाओं और virions का निर्माण करने के लिए, वे kodecytes और kodevirions क्रमशः 6-10 कहा जाता है, लेकिन केवल जब शुरू कार्यात्मक समूह अपने झिल्ली पर मौजूद होना दिखाया जा सकता है. जब kodecytes FSL constructs के विभिन्न सांद्रता के साथ बना रहे हैं, वे FSL निर्माण के लिए उन्हें बनाने के लिए, जैसे 15 μg एमएल / kodecytes, या यदि FSL तो एक से अधिक प्रयोग किया जाता है एक संयुक्त शब्द इस्तेमाल समाधान की एकाग्रता से करने के लिए भेजा जा सकता है, जैसे ए + बायोटिन kodecytes 7,8. की सिफारिश की जब विभिन्न कक्षों, वर्णन में कोशिका प्रकार सहित तुलना में किया जा रहा है, जैसे लाल कोशिका बायोटिन kodecytes या एंडोमेट्रियल बायोटिन kodecytes 7,8 .
हालांकि सम्मिलन की प्रक्रिया बहुत ही मजबूत और प्रविष्टि (हालांकि अलग दरों के साथ) है एक बड़े तापमान रेंज पर 4 से घटित होगा - 37 डिग्री सेल्सियस और घंटे के मिनट के भीतर, संपर्क का समय, तापमान, FSL एकाग्रता की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सम्मिलन सख्त नियंत्रण प्राप्त करने के लिए ( मंदक तैयार सहित), और एक हद तक कम सेल एकाग्रता के लिए आवश्यक हैं. तिथि करने के लिए, सभी FSL constructs ही 4-11 तकनीक द्वारा कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह उम्मीद है कि कुछ शर्तों के अधिक काम प्रवाह और / या कोशिकाओं / संशोधित किया जा virions के इष्टतम आवश्यकताओं को बहुत संभाल के लिए अनुकूल हो जाएगा . सटीक FSL एकाग्रता के लिए वांछित प्रभाव को प्राप्त करने के लिए उपयोगकर्ता के 4 द्वारा निर्धारित की जरूरत है. परिणामी FSL संशोधित कोशिकाओं का निर्माण / virions आमतौर पर एक असंशोधित / जैविक या विश्लेषणात्मक 4-11 प्रणालियों में सेल virion के रूप में एक ही तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है. FSL constructs धीरे संशोधित सतहों से elute जब लिपिड 7,8 समाधान के साथ संपर्क में होगा, या सक्रिय 11 कोशिकाओं द्वारा भस्म हो, संकेत या गतिविधि समय की अवधि में प्राप्त के स्तर पर सम्मान के साथ इन मुद्दों पर विचार किया जाना चाहिए. Kodecytes तय किया जा सकता है (उदाहरण के glutaraldehyde / formalin) के बाद सम्मिलन प्रदान लगानेवाला लिपिड-eluting सॉल्वैंट्स शामिल नहीं है और कार्यात्मक समूह लगानेवाला के साथ संगत है. वैकल्पिक रूप से तय कोशिकाओं FSL constructs के साथ संशोधित किया जा सकता है.
सेल और virion सतहों के संशोधन के अलावा FSL constructs भी सीधे प्रयोगशाला कोशिकाओं परिसंचारी के vivo संशोधन 7 में कारण पशुओं के संचलन में कर सकते हैं संचार हो और 12 वायरस, जहर, 12 और 7 एंटीबॉडी को बाधित . FLS constructs liposomes को सजाने के लिए भी इस्तेमाल किया गया है और कागज 13 सतहों, जहां वे स्थिर पर मुद्रित किया जा सकता है है, और तब निदान assays में इस्तेमाल किया जा सकता है.
FSL constructs के एक बढ़ती हुई श्रृंखला के साथ जीवित कोशिकाओं को आसानी से संशोधित करने की क्षमता के लिए एक उपयोगी कोशिका की सतह जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए अनुसंधान और विकास उपकरण साबित हो चाहिए.
Disclosures
दबोरा ए खाली और स्टीफन एम. हेनरी कोडे बायोटेक के कर्मचारियों और stockholders लिमिटेड कोडे प्रौद्योगिकी के पेटेंट के मालिक हैं. दान Bess सिग्मा Aldrich, जो इस वीडियो लेख के उत्पादन प्रायोजित किया है के एक कर्मचारी है.
Acknowledgments
लेखकों सिग्मा Aldrich से वीडियो पेश करने के लिए दान Bess धन्यवाद. हम भी डॉन शाखा, Evgenii Cherny, स्कॉट Chesla, एलिजाबेथ Hadac, अमांडा हैरिसन, डेमियन हीथकोट, Annika हल्ट, Chuan-चिंग लैन, Susannah McIntosh, Sarvani Komarraju, ऐलेना Korchagina, कैरोलीन ओलिवर मार्टिन Olsson, स्टीफन पार्कर, इगोर Rodinov धन्यवाद, अलेक्जेंडर Tuzikov, और उनके परिणाम और FSL constructs के डिजाइन संश्लेषण, और जैविक गतिविधि का निर्धारण करने के लिए योगदान के लिए Eleanor विलियम्स.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma name | Company | Sigma product number | Construct (KODE Biotech name) |
| FSL-A(tri) | Sigma-Aldrich | F9307 | FSL-A(GALNa3[Fa2]GALb)-SA1-L1 |
| FSL-B(tri) | Sigma-Aldrich | F9557 | FSL-B(GALa3[Fa2]GALb)-SA1-L1 |
| FSL-GB3 | Sigma-Aldrich | F9807 | FSL-GB3(GALa4GALb4GLCb)-SA1-L1 |
| FSL-Lea(tri) | Sigma-Aldrich | F9682 | FSL-LEA(GALb3[Fa4]GLCNb)-SA1-L1 |
| FSL-biotin | Sigma-Aldrich | F9182 | FSL-CONJ(1Biotin)-SC2-L1 |
| FSL-Galili | Sigma-Aldrich | F9432 | FSL-GALILI(GALa3GALb4GLCNb)-SA1-L1 |
| FSL-Fluorescein | Sigma-Aldrich | F1058 | FSL-FLRO4(fluorescein)-SA2-L1 |
| Table 1. | |||
References
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