Summary
Função Espaçador Lipid (FSL) constrói permitir as características da superfície de células vivas e virions ser modificado sem perda de vitalidade. O método requer apenas simples contato de uma solução de construção de uma célula com FSL / virion e incorporação de superfície espontânea e estável ocorre.
Abstract
A capacidade de modificar / visualizar superfícies biológicas, e depois estudar a célula modificada / virion em uma gama de in vitro e in vivo ambientes é essencial para ganhar mais conhecimentos sobre a função de moléculas específicas ou a entidade inteira. Estudos de modificação da superfície biológicos são geralmente limitados a engenharia genética do organismo ou a ligação covalente de metades químicos para a superfície da célula 1,2. No entanto, estas técnicas tradicionais expor a célula de reagentes químicos, ou que exigem manipulação significativa para alcançar o resultado desejado, tornando-pesado, e eles também podem inadvertidamente afetar a viabilidade / funcionalidade da célula modificada. Um método simples para harmlessly modificar a superfície de células é necessário.
Recentemente uma nova tecnologia, Tecnologia Kode lançou uma série de construções de novas constituído por três componentes: um grupo cabeça funcional (F), um espaçador (S) e uma cauda de lipídios (L) e são conhecidos como Função-Espaçador Lipid ou FSL constructs3. O espaçador (S) é selecionada para fornecer uma construção que é dispersível em água, ainda assim de forma espontânea e estável incorporar em uma membrana.
FSL construir metades funcional (F) até agora incluem uma gama de sacarídeos incluindo grupo sanguíneo relacionados determinantes, ácidos siálicos, polissacarídeos de ácido hialurônico, fluoróforos, biotina, radiolabels, e uma variedade de peptídeos 3-12. FSL construções têm sido usados em embriões modificando, espermatozóides, peixe-zebra, células epiteliais / endometrial, as células vermelhas do sangue, e virions para criar sistemas de controles de qualidade e painéis de diagnóstico, para modificar a adesão celular / interação / separação / imobilização, e para in vitro e in vivo de imagens de células / virions 3-12.
O processo de modificar células / virions é genérica e extremamente simples. O procedimento mais comum é a incubação de células (em lipídios mídia livre) com uma solução para FSL constrói por 1-2 horas a 37 ° C 4-10. Durante a incubação, a FSL constrói espontaneamente incorporar na membrana, eo processo está completo. Lavagem é opcional. Células modificadas por construções de FSL são conhecidos como kodecytes 6-9, enquanto virions são kodevirions 10.
FSL constrói como infusões diretos e kodecytes / kodevirions têm sido utilizados em modelos animais experimentais 7,8,10. Todos os kodecytes / kodevirions parecem manter a sua vitalidade normal e funcionalidade ao ganhar a nova função da fracção F 7,8,10,11.
A combinação de dispersão em meios biocompatíveis, incorporação espontânea em membranas celulares, e baixa toxicidade aparente, faz FSL construções valiosas ferramentas de pesquisa para o estudo de células e virions.
Protocol
O protocolo a seguir descreve o procedimento genérico para a inserção de construções FSL (Figura 1) em membranas biológicas. Para simplificar o protocolo só se referem às células (kodecytes), que estão em uma concentração de 100%. No entanto, as células termo é intercambiável com virions (kodevirions) ou organismos ou estruturas celulares e sua concentração em solvente não é importante, desde que seja sempre consistente entre os testes, controles e experimentos. Com os glóbulos vermelhos do volume globular é tipicamente 80%, mas com virions, embriões e outras células é normalmente menos de 1%. O método é muito robusto e irá produzir membranas modificado quando usado por qualquer de suas variações, mas refinamento será necessário para otimizar e padronizar o grau de modificação necessária para aplicações específicas.
1. Preparação de FSL Constrói
- Para preparar o FSL construir reconstituir solução estoque primeiro o produto FSL seca (Tabela 1) pela adição de 1,0 mL de diluente (ou conforme especificado na bula do produto) para o frasco do produto. Brevemente sonicate (30 segundos). Isso irá preparar uma solução de 1mg/mL, que pode ser aliquotado em 100 mL recipientes esterilizados e armazenados a 2-8 ° C por até uma semana, ou congelado por até 3 meses.
- Para preparar a trabalhar FSL construir soluções para a inserção, pouco antes de usar brevemente sonicate (30 segundos) a solução estoque de homogeneizar qualquer micelas. Diluir a construir FSL em tampão (de preferência que não contenham lipídios ou material altamente hidrofóbicas) para a concentração necessária ou em uma faixa, se desejar.
Notas:
- FSL constrói normalmente inserem em células em meios contendo lipídios, mas geralmente exigem tanto quanto um 50X concentrações mais altas de trabalho do que se FSL em PBS ou meio de lipídios outros livres.
- As diluições faixa de trabalho vai depender da aplicação, a sensibilidade do método de detecção, o tipo de FSL construir, eo grau de modificação necessária. Tipicamente, a faixa de diluição será entre 10-500 mg de FSL por mL de diluente para construções de carboidratos FSL e 100-100 mg / mL para outras construções FSL, como fluoróforos e biotina.
- Se preparando diluentes inserção contendo várias FSL construir, basta adicionar as construções juntos no mesmo diluente em sua concentração normal de trabalho. Se uma construção é a concentração muito mais elevada do que outro, algum ajuste (aumento) de concentração pode ser necessário para o menor construir. Alternativamente construções podem ser adicionados seqüencialmente, de preferência com a maior concentração construir primeiro lugar, seguido pelo menor.
- Concentrações FSL construir acima de 1000 mcg / mL podem apresentar quantidades significativas de lipídios na membrana celular, e pode mudar a forma da célula ou torná-lo mais suscetível à lise.
- FSL construir soluções de trabalho deve ser armazenado a 2-8 ° C e utilizada dentro de poucos dias.
- Constrói FSL pode ser diluído em água, mas terá reduzido estabilidade e deve ser utilizado dentro de horas. Se a bula especifica água como diluente reconstituição, o produto no frasco também irá conter sais (conforme especificado na bula).
2. Inserção da FSL Construct (s) em Membranas
- Primeiro lave as células para FSL livre modificação de lipídios não ligado por centrifugação e usar PBS ou lipídios mídia celular livre como solução de lavagem.
- Pacote de células ou suspender em 100 mL de diluente.
- Simultaneamente preparar controles que, idealmente, deve ser ambas as células não modificadas (incubadas com PBS, em vez de solução FSL) e / ou células modificadas com um benigna, mas relacionadas FSL construir.
- Adicionar 100 mL de uma diluição adequada de FSL solução (contendo um ou mais construções FSL) para as células e incubar por 1-2 horas a 37 ° C. Um resultado semelhante pode ser obtido por seis horas de incubação a 25 ° C ou durante a noite (18 horas) a 4 ° C - mistura é recomendada a cada poucas horas se suspensões de células pesados são usados.
- Wash (opcional) duas vezes com PBS ou mídia para remover quaisquer construções livres FSL e preparar uma suspensão apropriado.
Notas:
- O diluente usado para suspender as células podem ser meios de cultura celular, PBS, soluções de armazenamento de células, etc, mas de preferência sem lipídios (por exemplo, soro fetal bovino) ou detergentes (por exemplo, TWEEN).
- Volumes diferentes (de 100 mL) ratios (que 1:1 células / solução FSL) ou condições de incubação de tempo e temperatura podem ser utilizados desde a mesma proporção, concentração e volume são usados para obter resultados reprodutíveis.
3. Manipulação e visualização
- Uma vez que o processo de modificação FSL foi concluída a kodecytes pode ser armazenado a 4-8 ° C em lipídios mídia livre ou usado.
- Kodecytes e kodevirions geralmente se comportam da mesma como células sem modificações / virions e pode ser handled e visto sob sistemas de testes normal (microscopia, sorologia, citometria de fluxo, etc). Eles geralmente não têm requisitos especiais, exceto para evitar a solventes / detergentes / lipídios que podem eluir as construções de lipídios das membranas.
Notas:
- Constrói permanecerá na membrana das células inativas, como glóbulos vermelhos, se armazenado em lipídios mídia livre para a vida da célula. Em células com membranas ativa as construções serão internalizadas e metabolizada, a uma taxa dependente da atividade da membrana celular.
- Células mortas geralmente contêm altos níveis de construções FSL, o que pode ser usado para separar as células não viáveis de células viáveis.
- Se kodecytes são armazenadas (ou usado in vivo) em lipídios contendo media / ambientes, tais como soro / plasma construir o lentamente saem da membrana por um período de horas ou dias, dependendo da temperatura e concentrações de lipídios / composições.
4. Resultados representativos:
- Os resultados representante seguintes dependem da construção usados (Tabela 1), a sua concentração e inserido a sensibilidade e especificidade relativa do sistema de detecção (s). Em geral todas as construções FSL irá inserir nas células após 1 hora, mas as condições ideais precisam ser estabelecidas para cada situação.
- Constrói FSL pode ser usado para rotular o exterior de uma variedade de células vivas 3-9,11,14. Nos exemplos mostrados na Figura 2 embriões em estágios diferentes foram usados (como são frágeis uma célula), mas outras células (Figura 3) ou virions envolvida (Figura 4) também podem ser rotulados. FSL-Fluoresceína permite a rotulagem direta de superfícies (Figuras 2-4), enquanto FSL-biotina e outras construções FSL pode exigir a utilização de um sistema de detecção secundário (normalmente avidina / anticorpos / lectinas) para mostrar a sua presença (Figuras 5) .
- Marcadores de grupos sangüíneos, da especificidade humana ou animal pode ser anexado às células, incluindo células vermelhas 4-9 (Figura 6). Como a quantidade de FSL construir em um kodecyte é controlável e reprodutível 4-6, kodecytes para quantificação de anticorpos pode ser feita (Tabela 2 e Figura 6). A verdadeira fonte de células não é importante, eles podem ser qualquer espécie, ou mesmo da mesma origem como fonte de anticorpos, garantindo assim a antígeno apenas incompatível é o instituído pela FSL 7,8 (Figura 6).
Tabela 2. Representante reações sorológicas de três diferentes FSL-A (tri) kodecytes células vermelhas testado contra diluições de anticorpo monoclonal anti-A. A solução 50 mM de FSL-A (tri), quando incubados com igual volume de células vermelhas produzidas grupo O forte Um células antígeno positivo, o que pode ser detectado por uma diluição 1:512 de anticorpos monoclonais anti-A. A 5 - e 10 vezes menor FSL-A (tri) soluções produzidas kodecytes com o grupo menos sangue A expressão do antígeno.
Figura 1. FSL visão geral construir. Como uma flor constrói FSL consiste em três componentes principais. O chefe funcional (F) no caso da construção FSL pode ser uma variedade de diferentes grupos biologicamente funcionais, um espaçador (S) para a indução de espaçamento de F longe da membrana, melhorar a dispersão de água e ser não-reativo com soro, enquanto os lipídios diacyl permite a construção de espontaneamente incorporar em superfícies. (I) FSL-GB3 com um grupo de sangue Gb 3 (ou P k) trissacarídeo Galα4Galβ4Glcβ epítopo. (II)-A FSL (tri), com um grupo sanguíneo A epítopo trissacarídeo GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-fluoresceína. (IV) FSL-biotina com uma porção única F biotina. O grupo funcional de estruturas em I-III são conjugados a um derivado ativado adipato de dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), enquanto o espaçador da estrutura IV é carboxymethylglycine-adipato base.
Figura 2. FSL-Fluoresceína rotulados embriões de camundongos. Todas as imagens são de embriões vivos que foram rotulados quando sua zona pelúcida (ZP) estava intacta (ie a construção FSL passaram pela ZP para rotular o embrião no interior). Imagens I-IV são de ZP-livre embriões liberados de suas ZP com ácido rotulagem pós tyrodes com FSL-fluoresceína. Coloração idêntica ocorre independentemente de embriões foram FSL modificado com ZP intacta ou livre ZP. Embriões são diretamente rotulados com FSL-fluoresceína, pela 2 horas 37 ° C no soro método de meios de cultura livre de células, lavadas e, em seguida, visto sob microscopia de fluorescência. (I) ZP livre embrião de duas células de camundongos, mostrando também a coloração do corpo clássico intensa polar. (II-III) ZP livre quatro células e oito embriões de células de camundongo, ambos mostrando coloração sombria das células que são outside avião o microscópio de foco. (IV) ZP livre embrião de 16 células de camundongos. (V) ZP intacta embriões murinos blastocisto (d4-d5) onde ambos embrião e zona são rotulados.
Figura 3. FSL-Fluoresceína e zebrafish 14. (I) Microangiography em 52 larvas de peixe-zebra hpf (horas fecundação post) injetado diretamente na circulação com FSL-fluoresceína. A vasculatura zebrafish é manchada. (II) FSL-Fluoresceína heterogêneo Zebrafish células de rim de tecido (ZK kodecytes) foram criados ex vivo, em seguida, micro-injetado na circulação de um 52 Zebrafish destinatário hpf. Observações in vivo do kodecytes ZK foram feitas duas horas após a injeção por imagem do vasculatura sob fluorescência com o tempo de lapso de microscopia. É mostrado um quadro de vídeo com grandes células lento ou imóvel (indicado por setas laranja) e rápido células em movimento (imagens desfocadas devido ao movimento - indicado por setas verdes). Rotulagem permite em tempo real na observação in vivo do comportamento e da biodistribuição kodecytes ZK. (III) a absorção oral de FSL-Fluoresceína alcançado por imersão em embriões do zebrafish FSL-Fluoresceína contendo mídia para até 5 dias. Lavar roupa foi alcançado através da transferência de embriões em meios que não contenham construções FSL (pelo menos 6 horas é necessário, mas pode ser por vários dias). (IIIa) microscopia de campo brilhante do zebrafish FSL-Fluoresceína tratados correspondente à imagem ao lado de fluorescência (IIIb). O fluoresence foi localizado preferencialmente no trato intestinal. Coloração não foi observada em embriões controle sem tratamento (IVa e IVb).
Figura 4. Rotulagem FSL-Fluoresceína de virions 10 VSV e H1N1. (I) vírus da estomatite vesicular (VSV) foi diretamente rotulados com 10 mg / ml FSL-Fluoresceína por 2 horas a 37 ° C, seguido de fixação com paraformaldeído 4% e, em seguida, citometria de fluxo. Nenhuma purificação do kodevirion VSV pós FSL rotulagem era necessário. (II) A citometria de fluxo de porcos infectados com células testiculares humana A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) kodevirions rotulados com FSL-fluoresceína. Células não infectadas são vistos como a linha preta, enquanto a fusão do kodevirion H1N1 com os resultados ST células em uma célula fluorescente (linha vermelha).
Figura 5. FSL-biotina células marcadas e visualização posterior via avidina rotulados 7,8. Todas as células foram marcadas com FSL primeiro-biotina por 1 hora a 37 ° C, lavado em seguida, reagiu com fluoróforo rotulados avidina, lavados e úmidos montadas para microscopia de fluorescência. (I) Compilado imagem confocal de um blastocisto de embriões de camundongos. (II) fatia Central confocal do embrião a partir da imagem anterior. (III) Live espermatozóides móveis humano - indefinição ocorre como conseqüência de seu movimento. (IV) Fixo (inserção pós paraformaldeído 4%) espermatozóides humanos. (V) de eritrócitos humanos. (VI) Fixo (4% paraformaldeído pré-inserção) RL95 carcinoma endometrial humano. (VII) não fixadas RL95 linha celular humana endometrial carcinoma. (VIII) Biotina RBC kodecytes observada em uma amostra de sangue colhida 2 horas após a infusão intravenosa de kodecytes com (VIIIa), representando um campo visto sob microscopia de luz while (VIIIb) é o mesmo campo visto sob fluorescência, identificando os dois kodecytes presentes no campo de vista. Cálculo do rácio de kodecytes às células sem rótulo pode ser usado como um indicador de sobrevivência. (IX) Live humana kodecytes biotina endometrial visualizada por ligação a contas avidinylated.
Figura 6. FSL-Carboidratos para adicionar marcadores grupo sanguíneo para o perfil sorológico. (I) Human kodecytes células vermelhas Galili foram criados com um conjunto de concentração FSL-Galili (500 mcg / mL) e testadas contra diluições de soro humano. Eritrócitos humanos não ocorrem naturalmente com o antígeno Galili xenoantigen. Kodecytes tal pode ser usado para níveis quantitativos de anticorpo no soro. Neste exemplo, o doador foi determinada a ter um título de anti-Galili de 1:32. (II) Ao criar kodecytes com diminuição dos níveis de FSL ("títulos de antígeno"), um nível ideal de antígeno para detectar anticorpos pode ser determinado (neste exemplo Le a). As células podem ser criados apenas para dar um resultado positivo quando o nível de anticorpos excede um título específico. O nível de FSL antígeno necessária para dar um resultado positivo depende da qualidade e do nível de anticorpo a ser detectado. Para antígenos de carboidratos, uma solução FSL de 100 mcg / ml costumam resultar em uma forte reação positiva. (III) Human grupo de células vermelhas O foram modificados para ter um nível específico de Uma formigaigen (padronizado A kodecytes), e usado para quantificar de forma precisa e reproduzível anti-A no soro humano. Neste exemplo o anti-A título no soro testado O grupo é 1:32 e as kodecytes foram preparadas a partir do doador próprios glóbulos vermelhos. (IV) do grupo sanguíneo A e B antígenos simultaneamente inserido em um grupo O único amostra de células vermelhas são usadas para criar um kodecytes B fraco fraco. Estes kodecytes pode ser usado para fins de controle de qualidade ABO. Este resultado mostra a análise de um formulado especificamente kodecyte B Um fraco fraco testado contra os reagentes anti-A e anti-B e dá esperava reações fracas.
Discussion
Células modificando e virions com construções FSL é uma técnica muito simples e robusto 3-11. Para descrever e distinguir FSL construir células modificadas e virions a partir de células não modificado, eles são chamados kodecytes e kodevirions respectivamente 60-10, mas somente quando o grupo apresentou funcional pode ser mostrado para estar presente em sua membrana. Quando kodecytes são feitos com diferentes concentrações de construções FSL, eles podem ser referidos pela concentração da solução de construir FSL usado para criá-los, por exemplo, 15 mcg / mL A kodecytes, ou se mais de um FSL é usado, então, um termo combinados, por exemplo, A + biotina kodecytes 7,8. Quando as células diferentes podem ser comparados, incluindo o tipo de célula na descrição é recomendado, por exemplo, de células vermelhas kodecytes biotina ou kodecytes biotina endometrial 7,8.
Embora o processo de inserção é muito robusto e de inserção (embora com taxas diferentes) ocorrerá em um amplo intervalo de temperatura 4-37 ° C e dentro de minutos a horas, para obter o controle de inserção reprodutíveis estrita de tempo de contato, temperatura, concentração FSL ( incluindo a formulação de diluente), e, em menor grau de concentração de células são obrigatórios. Até à data, todas as construções FSL pode ser usado para modificar as células através da mesma técnica 4-11, no entanto espera-se que certas condições serão mais favoráveis para o fluxo de trabalho e / ou os requisitos ótimo manuseio das células / virions a ser modificado . A concentração FSL exata para alcançar o efeito desejado precisa ser determinado pelo usuário 4. A FSL resultante construir células modificadas / virions geralmente pode ser usado da mesma maneira como uma célula sem modificações / virion em sistemas biológicos ou analítica 4-11. Como as construções FSL eluir lentamente a partir de superfícies modificada quando em contato com soluções de lipídios 7,8, ou ser consumido por células ativas 11, estas questões devem ser consideradas com relação ao nível de sinal ou atividade obtidos ao longo de períodos de tempo. Kodecytes pode ser fixo (por exemplo, glutaraldeído / formol) após a inserção, desde que o fixador não contém lipídios eluidor de solventes eo grupo funcional é compatível com o fixador. Alternativamente células fixas podem ser modificadas com construções FSL.
Além da modificação da superfície das células e virion constrói FSL também pode ser infundido diretamente na circulação de animais de laboratório causando na modificação in vivo de células circulantes 7 e para inibir vírus 12, toxinas, 12 e anticorpos 7. FLS construções também foram usadas para decorar lipossomas e podem ser impressos em superfícies de papel 13, onde se imobilizar, e pode então ser usada em ensaios de diagnóstico.
A capacidade de facilmente modificar células vivas com uma gama crescente de construções FSL deve provar ser uma pesquisa útil e ferramenta de desenvolvimento para o estudo da biologia superfície da célula.
Disclosures
Deborah A. em branco e Stephen M. Henry são funcionários e acionistas da Kode Biotech limitada ao detentor da patente da tecnologia Kode. Dan Bess é um funcionário da Sigma-Aldrich, que patrocinou a produção deste vídeo-artigo.
Acknowledgments
Os autores agradecem Dan Bess da Sigma-Aldrich para apresentar o vídeo. Agradecemos também a Don Branch, Evgenii Cherny, Scott Chesla, Elizabeth Hadac, Amanda Harrison, Damien Heathcote, Annika Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, Sarvani Komarraju, Elena Korchagina, Caroline Oliver, Martin Olsson, Stephen Parker, Igor Rodinov, Alexander Tuzikov, e Eleanor Williams para os seus resultados e contribuições para o projeto de síntese, de construções de FSL e determinar a atividade biológica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma name | Company | Sigma product number | Construct (KODE Biotech name) |
| FSL-A(tri) | Sigma-Aldrich | F9307 | FSL-A(GALNa3[Fa2]GALb)-SA1-L1 |
| FSL-B(tri) | Sigma-Aldrich | F9557 | FSL-B(GALa3[Fa2]GALb)-SA1-L1 |
| FSL-GB3 | Sigma-Aldrich | F9807 | FSL-GB3(GALa4GALb4GLCb)-SA1-L1 |
| FSL-Lea(tri) | Sigma-Aldrich | F9682 | FSL-LEA(GALb3[Fa4]GLCNb)-SA1-L1 |
| FSL-biotin | Sigma-Aldrich | F9182 | FSL-CONJ(1Biotin)-SC2-L1 |
| FSL-Galili | Sigma-Aldrich | F9432 | FSL-GALILI(GALa3GALb4GLCNb)-SA1-L1 |
| FSL-Fluorescein | Sigma-Aldrich | F1058 | FSL-FLRO4(fluorescein)-SA2-L1 |
| Table 1. | |||
References
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