Summary
의 RNA 격리에 대한 신뢰할 수있는 방법
Abstract
이러한 백혈병 환자, 심한 화상 상처, 또는 장기 이식 1로 손상된 면역 체계와 호스트에 중요한 병적 상태와 사망률에 녹농균 (PA) 감염 결과. PA의 혈류 감염을 개발하기위한 높은 위험 환자에서 위장 (GI) 넓이는 식민지 2 주 저수지이지만, 메커니즘하는 asymptomatic colonizing 미생물의 침략, 그리고 종종 치명적인 위해 PA 전환은, 병원체가 명확하지 않습니다. 이전, 우리는 숙주의 면역 상태를 변경하는 동안 세균의 유전자 표현의 변화를 파악하기 위해 쥐를 3 식민지의 cecums에 거주하는 세균 세포에서 PA의 mRNA를 복구하여 생체내 전사 프로 파일링 실험에서 수행했습니다.
모든 전사 프로 파일링 실험과 마찬가지로 속도 - 제한 단계는 고품질의 mRNA의 충분한 양을의 격리에 있습니다. 효소, 파편, 음식 잔류물 및 GI 기관을의 미립자 물질의 풍부한 감안할 때, RNA 분리의 도전은 어려운 것입니다. 여기, 우리는 murine GI 기관을에서 발견한 박테리아 RNA의 신뢰성과 재현성 절연을위한 방법을 제시한다. 이 방법은 PA GI의 식민지와 neutropenia - 유도 보급 4 잘 설립 murine 모델을 활용합니다. PA와 함께 일단 GI 식민지가 확인, 마우스는 euthanized와 cecal 내용 회복과 플래시 냉동입니다. RNA는 다음 기계적 끓고 혼란, 페놀 / 클로로포름 extractions, DNase 처리 및 친화성 크로마 토그래피의 조합을 사용하여 추출됩니다. 수량과 순도는 분광 광도법 (Nanodrop 기술)와 bioanalyzer (애질런트 테크놀로지) (그림 1)에 의해 확인됩니다. GI의 미생물 RNA 격리의이 방법은 쉽게뿐만 아니라 다른 세균 및 곰팡이에 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. P.의 Murine 모델 녹농균이라는 박테리아의 GI의 콜로니 및 전파
- C3H/HeN 마우스 (암, 6-8 wks 노인, 할란)는 공생 식물을 고갈 후 이전 4 설명된대로 PA와 함께 모노가 - 식민지에 경구 항생제로 치료하고 있습니다.
2. Murine Cecal Luminal 내용 수확
- 액체 질소 욕조에 청소 스테인리스 박격포 젖어.
- 이산화탄소 질식으로 마우스를 안락사.
- 스티로폼 보드와 95 % 에탄올로 샤워에서 보안 마우스 시체. 흉골에서 회음부로 피부를 통해 중간선에 세로 절개를합니다. 피부와 복강을 노출 복막을 반영합니다.
- 전체 맹장을 잘라 내다. 스테인리스 박격포 이상 포셉과 맹장을 잡아. 해부 가위로 맹장의 양쪽 끝이 싹둑.
- 이게 맹장의 근위 끝에 cecal flushate 버퍼 (10 MM TrisHCl, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 MM NaCl) 5 개 중 1 ML 가득한 P1000 피펫 팁을 넣습니다. 스테인레스 절구에 cecal flushate 버퍼와 cecal luminal 내용을 플러시. cecal flushate 버퍼 1 ML은 cecal 내용을 모두 꼴이지 충분한 것입니다. Cecal flushate 내용은 박격포와 접촉으로 오는 즉시 정지됩니다.
- 멸균 유봉과 함께 cecal flushate 내용을 분쇄.
- 장소 그라운드 드라이 아이스 / 에탄올 목욕탕에 빠져들 50 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 cecal luminal 내용을 냉동.
- 반복 각 추가 마우스 2.7을 통해 2.2 단계.
- -80에서 보관 ° C.
3. 박테리아 RNA 격리
- 산성 클로로포름 / 페놀의 따뜻한 1 볼륨 (약 3 ML, 두 cecal luminal 내용의 최종 부피에 따라) (5시 1분, V / V)는 65 parafilm에서 보안 뚜껑과 함께 50 ML 오크 릿지의 원심 튜브에 들어있는 ° C의 물 목욕.
- 5 분 50 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 포함된 용해 완충액 0.5 볼륨 (2 % SDS, 16 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 MM NaCl) 6 끓여.
- cecal luminal 내용에 끓는 용해 버퍼를 추가합니다. Homogenize. 정기 vortexing 5 분 동안 끓여.
- 추가 100 ° 65 ° C 산 오크 릿지의 원심 튜브에 클로로포름 / 페놀로 C cecal 내용 / 용해 샘플. parafilm로 밀봉 캡.
- 65 품어 ° C 정기 vortexing (매 2 분) 10 분.
- 15 분 동안 4 명이시 2,500g에서 샘플을 원심 분리기.
- 조심스럽게 새로운 50 ML 오크 릿지의 원심 분리기에 수성 단계 (흰색 인터페이스 중 하나를 피하는) 전송. 수성 단계의 볼륨 cecal 내용, 용해 버퍼, 그리고 산성 클로로포름 / 페놀의 전체 볼륨의 약 50 %됩니다. 산성 클로로포름 / 페놀의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 인감 parafilm와 모자와 높은 속도로 vortexing하여 잘 섞는다.
- 15 분 동안 4 명이시 2,500g에서 샘플을 원심 분리기.
- 수성과 유기농 단계 사이에 보이는 흰 인터페이스가 없습니다 때까지 3.9-3.7 단계를 반복합니다.
- 조심스럽게 새로운 50 ML 오크 릿지의 원심 분리기에 수성 단계를 전송합니다. 클로로포름 / isoamyl 알콜의 동일한 음량을 (24:1, V / V) 추가합니다.
- 밀봉 캡 및 vortexing하여 잘 섞는다.
- 15 분 동안 4 명이시 2,500g에서 샘플을 원심 분리기. 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 수성 단계 (볼륨이 전체 볼륨의 반응 약 50 % 것입니다)를 제거하고 이소프로판올의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 최소한 2 시간 또는 야간을위한 -20 °의에서 품어.
- 45 분 동안 4 명이시 2,500g에서 샘플을 원심 분리기. 펠렛 같은 겔은 튜브의 아래쪽에 형성됩니다. 뜨는 제거합니다.
- 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 1 ML로 펠렛을 씻으십시오. 와동. 5 분 4 명이시 10,000그램에서에서 샘플을 원심 분리기.
- 뜨는를 제거하고 10 분 동안 상온에서 건조 펠렛을 알려주도록 튜브를 반전.
- RNase없는 물 200 μl의 RNA 펠렛을 Resuspend.
4. DNase 처리 (터보 DNA - 무료, 응용 Biosystems)
- 10X 터보 DNase 버퍼와 2 μl 터보 DNase 20 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다.
- 20 분 동안 37 °에서 알을 품다.
- resuspended DNase의 불활 성화 시약 20 μl를 추가하고 잘 섞는다.
- 때때로 혼합, 실온에서 5 분 품어.
- 1.5 분 동안 상온에서 10,000g에서 원심과 새 microfuge 튜브에 뜨는을 전송하기만하면됩니다.
- 페놀 / 클로로포름 감기 (4 °) 산 중 하나가 볼륨을 추가하고 1 분 vortexing하여 철저히 섞는다.
- 2 분 동안 상온에서 1만2천5백g에서 원심 분리기.
- 새로운 튜브로 수성 단계를 전송하고 클로로포름 / isoamyl 알콜 (49:1 V / V), 와동 1 볼륨을 추가합니다.
- 2 분 동안 상온에서 1만2천5백g에서 원심 분리기.
- 새로운 튜브로 수성 단계 (총 반응 량의 약 50 %) 전송합니다.
- 3M의 아세트산 나트륨의 0.1 볼륨, 산도 5.5 및 추가얼음처럼 차가운 100 % 에탄올 2.5 권. 와동.
- 적어도 2 시간 30 분 -80 °에서 -20 °의에서 품어.
- 4 30 분 1만2천g에서 원심 °
- 뜨는 제거합니다.
- 4 명이시 10,000g에서 5 분 centrifuging하여 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 1 ML로 펠렛을 씻으십시오.
- 10 분 뜨는 공기 건조를 제거합니다.
- RNase없는 물 100 μl의 펠렛을 Resuspend. resuspend 65 ° 물을 욕조에 장소와 펠렛을 해산해야 할 수도 있습니다.
- DNase 처리의 효능을 테스트하려면, ribosomal 단백질 (또는 기타 참조 유전자)의 증폭에 대한 표준 RT - PCR 반응을 더 RT 컨트롤을 사용하지, 처리 및 비 - 처리 샘플을 수행할 수 있습니다.
5. RNA 정리 단계 (Qiagen, RNeasy 키트)
- Qiagen RNeasy 미니 수첩 (4 번째 에디션 월 2006)의 페이지 56-57을 참조하시기 바랍니다. 로 표시하십시오.
6. 대표 결과
이 프로토콜을 사용하여 복구할 세균성 총 RNA의 양은 두 cecums에서 약 2-3 μg이다. 회수 RNA는 다음 qPCR, 전사 프로 파일링, 및 RNA Seq 실험을위한 충분한 수량과 품질입니다. RNA의 순도는 정기적으로 260nm/280nm 비율에게 샘플 7를 측정하여 평가, 아직이 방법은 RNA 무결성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 애질런트 Bioanalyzer은 사이징, 부량 및 DNA, RNA, 단백질 및 세포의 품질 관리를위한 microfluidics 기반 플랫폼 및 RNA 무결성 번호 (린) 8로 알려진 RNA 무결성 메트 릭을 사용합니다. 이 프로토콜은 1.7에서 2.0와 린 값 ≥ 7.0까지 280분의 260 비율을 생산과 RNA가 추출. 이 프로토콜에 의해 복구 세균성 RNA의 애질런트 Bioanalyzer 분석의 예제는 그림 1에 표시됩니다.
그림 1. 애질런트 Bioanalyzer electropherogram과 녹농균 총 RNA 샘플의 젤 같은 이미지가 격리되고 murine cecal 내용에서 회복. 린 8.0.
Discussion
RNA 추출 방법은 여기에서 설명한 것은 murine GI 기관을에서 수확 고품질 녹농균의 총 RNA의 충분한 수량의 복구를 허용합니다. 이 방법은 P.에 국한되지 않고 녹농균이라는 박테리아하며 잠재적으로 다른 세균에 적용할 수 있습니다. 소장에서 충분한 미생물 생물의 복구는 생명체에서 생명체로 크게 달라집니다. 우리 murine 모델, P.에서는 녹농균이라는 박테리아는 일반적으로 5 X 10월 7일에서 5일까지 X 10 8 cfu / g 대변 4 사이의 레벨에서 murine GI 넓이를 colonizes. 회수 cecal 내용은 약 0.5 g, P.의 예상 번호이므로 이 cecums에서 발견한 녹농균이라는 박테리아는 5 X 10월 7일에서 5일까지 X 10 8 cfu 사이입니다. 기타 미생물을 사용하는 경우 그것은 식민지 GI 수치를 확인한 후 cfu의 대상 번호를 복구하는 데 필요한 cecums의 수를 계산하기 위해 신중한 것입니다. 이 특정 murine 모델을 사용하는 경우, PA에 감염되지 않은 항생제 - 처리 생쥐들이 cecal 내용에서 격리 RNA에 대한 같지는 금액이 없다는 것을주의하는 것도 중요하다.
녹농균 위장 식민지와 P.의 pathogenesis을 흉내낸 보급 시도 우리의 murine 모델 암 줄기 세포 이식 환자에서 녹농균이라는 박테리아 bacteremia. 이 환자 인구, 공생 식물은 주로 병원성 미생물 (예 : P.의 녹농균이라는 박테리아와 모노 협회)의 전면에 자라난 그 결과 항생제 또는 chemotherapeutic 치료 (GI 공생 식물의 항생제 고갈 등)에 보조 소진 있으며 면역 억제 후에 후속 보급. 이 murine 모델의 장점과 한계는 이미 이전에 네 해결되었습니다. 현재이 연구의 목적은 GI의 넓이로 봐서에서 미생물 총 RNA를 분리를위한 방법론을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 쉽게 GI 요로 (즉, 공생 식물의 상호 작용, 염증성 장 질환, 세균 등에 효과)에 미생물의 pathogenesis의 다른 측면을 연구 다른 murine 모델 적용할 수 있습니다.
이 방법의 장점 중 하나는 동결 / 해동, 기계 장애 (박격포 / 유봉, 균질로 pulverizing), 끓고, 화학 용해 (예 : SDS)를 포함하여 여러 용해 단계의 결합입니다. 용해 단계의 무리에도 불구하고, 일부 미생물 (특히 그람 양성 세균 및 곰팡이 / 효모) 추가 기계적 중단을 요구할 수 있습니다. 용해 / 산 페놀 - 클로로포름 부화 (3.5 단계), 구슬의 추가 (박테리아와 효모에 대한 / 또는 0.5-0.7 mm 위해 0.1 ㎜)와 이후의 구슬 - 박동 단계 뜨거운 후, 이러한 생물 9 lyse하기에 충분해야합니다 10.
murine이게 맹장, 반복 차가운 acid-phenol/chloroform extractions (단계 3.7-3.9)에서 복구 재료의 복잡한 특성상 절대적으로 더 이상 하류 반응에 대한 허용 RNA의 품질과 무결성을 달성하기 위해서 필요합니다. 3-5 추위 acid-phenol/chloroform extractions 사이에 멸망 수성 및 유기 단계 사이의 흰색 인터페이스를하기 전에해야 할 수 있습니다. 마지막으로, DNase 처리 (4 단계)와 RNeasy 정리 프로토콜 (5 단계) 모두의 조합 훼손 DNA와 비 mRNA 소형 (기들과 tRNA)를 제거 필수적입니다. 이전에 언급한 바와 같이,이 프로토콜을 이용하여 회수 RNA는 이후 전사 프로 파일링 3, qPCR (게시되지 않은), 그리고 RNA Seq (게시되지 않은) 실험을위한 충분한 수량과 품질입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 보건 보조금 AI62983 국립 연구소 (AYK), AI22535 (GPB)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mortar and Pestle | Fisher Scientific | 12-947-1 | |
| Homogenizer | Omni | TM-125 | |
| Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalge Nunc international | 3119-0050 | |
| Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74104 | |
| 3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |
References
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