Summary
Een betrouwbare methode voor het RNA isolatie van
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (PA) infecties leiden tot aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit bij gastheren met een verminderde immuunsysteem, zoals patiënten met leukemie, ernstige brandwonden, of orgaantransplantaties 1. Bij patiënten met een hoog risico voor het ontwikkelen van PA infecties in het bloed, de gastro-intestinale (GI) stelsel is het belangrijkste reservoir voor kolonisatie 2, maar de mechanismen waarmee PA overgangen van een asymptomatische kolonisatie microbe tot een invasieve, en vaak dodelijk, pathogeen zijn onduidelijk. Eerder hebben we in vivo transcriptie profilering experimenten door herstellende PA mRNA van bacteriële cellen die woonachtig zijn in de cecums van gekoloniseerde muizen 3 om veranderingen in de bacteriële genexpressie identificeren bij wijzigingen in het immuunsysteem van de gastheer status.
Zoals bij elke transcriptie profilering experiment, de snelheidsbeperkende stap is in de isolatie van voldoende hoeveelheden van hoge kwaliteit mRNA. Gezien de overvloed van enzymen, vuil, etensresten, en fijn stof in het spijsverteringskanaal, de uitdaging van RNA-isolatie is een hele uitdaging. Hier presenteren we een methode voor een betrouwbare en reproduceerbare isolatie van bacteriële RNA hersteld van de muizen maag-darmkanaal. Deze methode maakt gebruik van een gerenommeerde muizenmodel van PA GI kolonisatie en neutropenie-geïnduceerde verspreiding van 4. Eenmaal GI kolonisatie met PA is bevestigd, muizen zijn gedood en cecal inhoud wordt hersteld en flash bevroren. RNA is vervolgens geëxtraheerd met behulp van een combinatie van mechanische verstoring, koken, fenol / chloroform extractie, DNase behandeling en affiniteitschromatografie. De hoeveelheid en zuiverheid worden bevestigd door middel van spectrofotometrie (Nanodrop Technologies) en bioanalyzer (Agilent Technologies) (afb. 1). Deze methode van gastro-intestinale microbiële RNA isolatie kan gemakkelijk worden aangepast aan andere bacteriën en schimmels ook.
Protocol
1. Muizenmodel van P. aeruginosa GI kolonisatie en verspreiding
- C3H/HeN muizen (6-8 wkn oud, vrouw, Harlan) worden behandeld met orale antibiotica om commensale flora afbreken en daarna mono-gekoloniseerd met PA zoals eerder beschreven 4.
2. Oogsten Murine cecal Luminal Inhoud
- Dompel een schoon roestvrij stalen vijzel in een vloeibare stikstof bad.
- Euthanaseren muizen door kooldioxide stikken.
- Veilig muis karkas op een piepschuim bord en een douche met 95% ethanol. Maak een middellijn longitudinale incisie door de huid van het borstbeen tot het perineum. Weerspiegeling van de huid en het buikvlies naar de buikholte bloot te leggen.
- Reseceren de hele blindedarm. Houd de blindedarm met een tang boven de RVS mortel. Snip beide uiteinden van de blindedarm met dissectie schaar.
- Plaats een P1000 pipettip gevuld met 1 ml van cecal flushate buffer (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA en 200 mM NaCl) 5 in het proximale uiteinde van de blindedarm. Spoel de cecal flushate buffer en cecal luminale inhoud in de roestvrij stalen mortel. 1 ml van cecal flushate buffer voldoende zal zijn voor alle spoelen van de blindedarmkeutels inhoud. Cecal flushate inhoud zal onmiddellijk te bevriezen bij in contact komen met de mortel.
- Maal de blindedarmkeutels flushate inhoud met een steriel stamper.
- Plaats de grond bevroren cecal luminale inhoud in een 50 ml polypropyleen conische buis ondergedompeld in een droog ijs / ethanol bad.
- Herhaal stap 2.2 tot en met 2.7 voor elke extra muis.
- Bewaren bij -80 ° C.
3. Bacterieel RNA isolatie
- Warm een volume (gebaseerd op de uiteindelijke volume van de twee cecal luminale inhoud, ongeveer 3 ml) van zuur fenol / chloroform (5:1, v / v) die in een 50 ml Oak Ridge centrifugebuis met de kap vastgezet in parafilm in een 65 ° C waterbad.
- Kook 0,5 volume van lysis buffer (2% SDS, 16 mM EDTA en 200 mM NaCl) 6 in een 50 ml polypropyleen conische buis gedurende 5 minuten.
- Kokend lysis buffer om cecal luminale inhoud. Homogeniseren. Kook gedurende 5 minuten met periodieke vortexen.
- Voeg de 100 ° C cecal inhoud / lysis monster tot de 65 ° C zuur fenol / chloroform in het Oak Ridge centrifugebuis. Seal cap met parafilm.
- Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten met periodieke vortexen (elke 2 minuten).
- Centrifugeer monster op 2,500 g bij 4 ° gedurende 15 minuten.
- Zorgvuldig overdracht waterige fase (het vermijden van een van de witte interface) om een frisse 50 ml Oak Ridge centrifuge. Het volume van de waterfase zal ongeveer 50% van het totale volume van cecal inhoud, lysis buffer, en zuur fenol / chloroform worden. Voeg een gelijk volume zuur fenol / chloroform.
- Seal cap met parafilm en meng goed door vortexen bij hoge snelheid.
- Centrifugeer monster op 2,500 g bij 4 ° gedurende 15 minuten.
- Herhaal de stappen 3,7 tot 3,9 totdat er geen zichtbare witte interface tussen de waterige en organische fasen.
- Zorgvuldig overdragen waterige fase naar een verse 50 ml Oak Ridge centrifuge. Voeg een gelijk volume van chloroform / isoamylalcohol (24:1, v / v).
- Seal cap en meng goed door vortexen.
- Centrifugeer monster op 2,500 g bij 4 ° gedurende 15 minuten. Verwijder de waterige fase (volume zal ongeveer 50% van de totale reactie volume) tot 15 ml polypropyleen conische buis en voeg een gelijk volume isopropanol.
- Incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste 2 uur of 's nachts.
- Centrifugeer monster op 2,500 g bij 4 ° C gedurende 45 minuten. Een gel-achtige pellet vormen op de bodem van de buis. Verwijder supernatant.
- Was de pellet met 1 ml ijskoude 70% ethanol. Vortex. Centrifugeer monster op bij 10.000 g bij 4 ° gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en omkeren van de buis om de pellet laten drogen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Resuspendeer de RNA pellet in 200 ui van RNase-vrij water.
4. DNase behandeling (Turbo DNA-Free, Applied Biosystems)
- Voeg 20 ul van 10X Turbo DNase buffer en 2 pl Turbo DNase en meng voorzichtig.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
- Voeg 20 ul van de geresuspendeerde DNase inactivatie reagens en meng goed.
- Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur, mixen af en toe.
- Centrifugeer bij 10.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1,5 minuten en breng het supernatant naar een nieuwe microfugebuis.
- Voeg een volume van koud (4 °) zuur fenol / chloroform en meng door vortexen gedurende 1 minuut.
- Centrifugeer bij 12.500 g bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
- Breng de waterige fase naar een nieuwe buis en voeg een volume van chloroform / isoamylalcohol (49:1 v / v), vortex.
- Centrifugeer bij 12.500 g bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
- Breng de waterige fase (ongeveer 50% van de totale reactie volume) naar een nieuwe buis.
- Voeg 0,1 volume 3M natriumacetaat, pH 5,5 en2,5 volumes van ijskoude 100% ethanol. Vortex.
- Incubeer bij -20 ° C gedurende minstens 2 uur of bij -80 ° gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 12.000 g gedurende 30 minuten bij 4 °
- Verwijder supernatant.
- Was de pellet met 1 ml ijskoude 70% ethanol door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 10.000 g bij 4 °.
- Verwijder het supernatant en drogen aan de lucht gedurende 10 minuten.
- Resuspendeer de pellet in 100 ui van RNase-vrij water. Kan nodig zijn om in 65 ° waterbad om opnieuw in suspensie en de pellet te ontbinden.
- Voor het testen van de effectiviteit van de DNase behandeling, kan een standaard RT-PCR-reactie voor de amplificatie van een ribosomale eiwit (of een andere referentie-gen) worden uitgevoerd voor behandeld en niet-behandelde monsters, met behulp van geen RT controles.
5. RNA Cleanup Step (Qiagen, RNeasy Kit)
- Raadpleeg de pagina's 56-57 van Qiagen RNeasy Mini Handbook (4 e editie, april 2006). Volgen zoals aangegeven.
6. Representatieve resultaten
De hoeveelheid van bacteriële totaal RNA teruggevorderd door het gebruik van dit protocol is ongeveer 2-3 microgram van twee cecums. Teruggevorderde RNA is van voldoende kwantiteit en kwaliteit voor de daaropvolgende qPCR, transcriptie profilering, en RNA-Seq experimenten. RNA zuiverheid wordt regelmatig getoetst door het meten van de verhouding tussen 260nm/280nm 7 van het monster, maar deze methode geeft geen informatie over RNA integriteit. De Agilent Bioanalyzer is een microfluidics-gebaseerd platform voor de dimensionering, de kwantificering en kwaliteitscontrole van DNA, RNA, eiwitten en cellen, en maakt gebruik van een RNA integriteit metrische bekend als RNA Integrity Number (RIN) 8. RNA geëxtraheerd met dit protocol levert 260/280 ratio's variërend 1,7 tot 2,0 en RIN-waarden ≥ 7,0. Een voorbeeld van een Agilent Bioanalyzer analyse van de bacteriële RNA teruggevorderd door dit protocol is weergegeven in figuur 1.
Figuur 1. Agilent Bioanalyzer electropherogram en gel-achtig beeld van Pseudomonas aeruginosa totaal RNA monster geïsoleerd en hersteld van muizen cecal inhoud. RIN 8,0.
Discussion
De RNA-extractie hier beschreven methode maakt het mogelijk herstel van voldoende hoeveelheden van hoge kwaliteit Pseudomonas aeruginosa totaal RNA geoogst uit de muizen maag-darmkanaal. Deze methode is niet beperkt tot P. aeruginosa en kan eventueel worden toegepast op andere bacteriën. Het herstel van voldoende micro-organismen uit de darm zal aanzienlijk verschillen van organisme tot organisme. In ons muismodel, P. aeruginosa koloniseert meestal de muizen maagdarmkanaal op een niveau tussen 5 x 10 7 tot 5 x 10 8 kve / g feces 4. Sinds de herstelde cecal inhoud zijn ongeveer 0,5 gram, het geschatte aantal van P. aeruginosa hersteld van twee cecums is tussen de 5 x 10 7 tot 5 x 10 8 kve. Als er andere micro-organismen worden gebruikt, zou het verstandig zijn om GI kolonisatie niveaus te controleren en vervolgens het aantal cecums nodig is om het beoogde aantal kve terug te berekenen. Het is ook belangrijk op te merken dat bij het gebruik van dit muismodel, antibiotica-behandelde muizen niet besmet met PA geen meetbare hoeveelheden RNA geïsoleerd van hun cecal inhoud hebben.
Onze muizenmodel van Pseudomonas aeruginosa gastro-intestinale kolonisatie en verspreiding pogingen om de pathogenese van P. emuleren aeruginosa bacteriëmie bij kanker en stamcel transplantatie patiënten. In deze patiëntengroep, is commensale flora vaak uitgeput secundair aan antibiotica of chemotherapeutische behandeling (bijvoorbeeld het antibioticum uitputting van de GI commensale flora), resulterend in overgroei van pathogene micro-organismen (bijvoorbeeld mono-associatie met P. aeruginosa) en de daaropvolgende verspreiding na het immuunsysteem onderdrukken. De voordelen en beperkingen van dit muismodel zijn al eerder vier aangepakt. Het doel van deze huidige studie is een methode te bieden voor het isoleren van microbiële totaal RNA uit het spijsverteringskanaal. Dit protocol kan eenvoudig aangepast worden aan andere muismodellen dat andere aspecten van microbiële pathogenese in het maagdarmkanaal (dat wil zeggen commensale flora interacties, bacteriële effecten op inflammatoire darmziekte, etc.) te bestuderen.
Een voordeel van deze methode is het opnemen van meerdere lysis stappen waaronder vries / dooi, mechanische verstoring (verpulveren met mortel / stamper, homogeniseren), koken, en chemische lysis (bijv. SDS). Ondanks de veelheid aan lysis stappen, kunnen sommige micro-organismen (met name Gram-positieve bacteriën en schimmels / gisten) extra mechanische storing. Na de hete lysis / zuur fenol-chloroform incubatie (Stap 3.5), de toevoeging van parels (0,1 mm voor bacteriën en / of 0.5-0.7 mm voor gist) en een volgende kraal-beating stap moet voldoende zijn om deze organismen 9 lyseren, 10.
Gezien de complexe aard van de materialen hersteld van de muizen blindedarm, de herhaalde koude acid-phenol/chloroform extracties (Stap 3,7 tot 3,9), zijn absoluut nodig om acceptabele RNA kwaliteit en integriteit voor verder stroomafwaarts reacties te bereiken. Tussen 3-5 koude acid-phenol/chloroform extracties kan nodig zijn voordat de witte interface tussen de waterige en organische fasen wordt geëlimineerd. Ten slotte is de combinatie van zowel de DNase behandeling (stap 4) en RNeasy Cleanup Protocol (stap 5) zijn essentieel voor het verwijderen van vervuilende DNA en kleine, niet-mRNA (5s en tRNA). Zoals eerder vermeld, de RNA-teruggewonnen door gebruik te maken van dit protocol is van voldoende kwantiteit en kwaliteit voor latere transcriptie profilering 3, qPCR (niet gepubliceerd), en RNA Seq (niet gepubliceerd) experimenten.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health beurzen AI62983 (AYK), AI22535 (GPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mortar and Pestle | Fisher Scientific | 12-947-1 | |
| Homogenizer | Omni | TM-125 | |
| Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalge Nunc international | 3119-0050 | |
| Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74104 | |
| 3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |
References
- Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. Infections caused by Pseudomonas aeruginosa. Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).
- Bertrand, X. Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units. Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).
- Koh, A. Y. Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination. PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).
- Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia. Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).
- Alexander, R. J., Raicht, R. F. Purification of total RNA from human stool samples. Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).
- Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR. J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).
- Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 20, 968-970 (1996).
- Schroeder, A. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).
- Turnbaugh, P. J. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature. 457, 480-484 (2009).
