Isolement des ARN Pseudomonas aeruginosa La colonisation du tractus gastro-intestinal murin

Summary

Une méthode fiable pour l'isolement des ARN

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (PA) des infections entraîner une morbidité et une mortalité importantes chez les hôtes dont le système immunitaire, comme les patients atteints de leucémie, de graves brûlures ou ^une transplantation d'organe. Chez les patients à haut risque de développer des infections sanguines PA, la gastro-intestinal (GI) est le principal réservoir de la colonisation ^2, mais les mécanismes par lesquels les transitions d'un microbe PA asymptomatiques coloniser d'une espèce envahissante, et souvent mortelles, des agents pathogènes ne sont pas claires. Auparavant, nous avons effectué des expériences in vivo de profilage de transcription en récupérant l'ARNm PA partir de cellules bactériennes résidant dans la cecums du colonisé souris ³ afin d'identifier les changements dans l'expression des gènes bactériens lors de modifications au statut immunitaire de l'hôte.

Comme avec n'importe quelle expérience de profilage de transcription, l'étape limitante est l'isolement des quantités suffisantes de l'ARNm de haute qualité. Étant donné l'abondance des enzymes, des débris, des résidus alimentaires et les matières particulaires dans le tractus gastro-intestinal, le défi de l'isolement de l'ARN est intimidante. Ici, nous présentons une méthode pour l'isolement fiable et reproductible de l'ARN bactérien isolé du tractus gastro-intestinal murin. Cette méthode utilise un modèle bien établi murin de PA GI colonisation et la neutropénie induite par la diffusion ^4. Une fois que la colonisation IG avec PA est confirmé, les souris sont euthanasiées et le contenu caecal sont récupérés et surgelés. L'ARN est ensuite extrait en utilisant une combinaison d'une rupture mécanique, l'ébullition, le phénol / chloroforme, extractions, traitement à la DNase, et la chromatographie d'affinité. Quantité et la pureté sont confirmées par spectrophotométrie (Nanodrop Technologies) et bioanalyseur (Agilent Technologies) (figure 1). Cette méthode de GI microbienne isolement d'ARN peut être facilement adaptée à d'autres bactéries et champignons ainsi.

Protocol

1. Modèle murin de P. Colonisation IG aeruginosa et de diffusion

1. Souris C3H/HeN (6-8 semaines vieux, femmes, Harlan) sont traités avec des antibiotiques oraux pour épuiser la flore commensale et mono-colonisés par PA tel que décrit précédemment ^4.

2. Récolte murin caecum contenu luminal

1. Plongez un mortier d'acier inoxydable, nettoyé dans un bain d'azote liquide.
2. Euthanasier les souris par asphyxie de dioxyde de carbone.
3. La carcasse de souris sécurisé sur une planche en mousse de polystyrène et d'une douche avec de l'éthanol à 95%. Faire une incision médiane longitudinale à travers la peau du sternum au périnée. Refléter la peau et le péritoine pour exposer la cavité abdominale.
4. Réséquer le caecum entier. Tenez le cæcum avec une pince sur le mortier en acier inoxydable. Snip les deux extrémités du cæcum avec des ciseaux de dissection.
5. Insérez une extrémité de la pipette P1000 rempli avec 1 ml de tampon flushate caecal (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA et 200 mM de NaCl) ⁵ dans l'extrémité proximale du caecum. Vide le tampon flushate caecale et caecal contenu luminal dans le mortier en acier inoxydable. 1 ml de tampon flushate caecale sera suffisant pour rincer la totalité du contenu caecal. Caecale contenus flushate gèlera immédiatement après l'entrée en contact avec le mortier.
6. Broyer le contenu caecal flushate avec un pilon stériles.
7. Placez au sol congelé caecale contenu luminal dans un tube de 50 ml en polypropylène coniques immergés dans une glace sèche / éthanol bain.
8. Répétez les étapes 2.2 à 2.7 pour chaque souris supplémentaire.
9. Conserver à -80 ° C.

3. Isolement ARN bactérien

1. Chaud 1 volume (basée sur le volume final de deux caecale contenu luminal, environ 3 ml) d'acide phénol / chloroforme (5:1, v / v) contenus dans un tube de 50 ml Oak Ridge centrifugeuse avec le bouchon fixé dans parafilm dans un 65 · Bain C eau.
2. Faites bouillir 0,5 volume de tampon de lyse (2% SDS, 16 mM EDTA et 200 mM de NaCl) ⁶ contenue dans un tube en polypropylène de 50 ml conique pour 5 minutes.
3. Ajouter un tampon de lyse bouillant pour caecale contenu luminal. Homogénéiser. Faire bouillir pendant 5 minutes avec vortex périodiques.
4. Ajoutez les 100 ° C contenu caecal / échantillon lyse de la 65 ° C l'acide phénol / chloroforme dans le tube Oak Ridge centrifugeuse. Bouchon d'étanchéité avec du parafilm.
5. Incuber à 65 ° C pendant 10 minutes avec vortex périodiques (toutes les 2 minutes).
6. Centrifuger l'échantillon à 2500 g à 4 ° pendant 15 minutes.
7. Soigneusement transfert de phase aqueuse (en évitant tout de l'interface blanc) pour une nouvelle centrifugeuse 50 ml d'Oak Ridge. Le volume de la phase aqueuse sera d'environ 50% du volume total des matières fécales, un tampon de lyse, et l'acide phénol / chloroforme. Ajouter un volume égal d'acide phénol / chloroforme.
8. Bouchon d'étanchéité avec du parafilm et bien mélanger au vortex à grande vitesse.
9. Centrifuger l'échantillon à 2500 g à 4 ° pendant 15 minutes.
10. Répétez les étapes 3.7 à 3.9 jusqu'à ce qu'il n'y a pas d'interface entre les blancs visibles phases aqueuses et organiques.
11. Soigneusement transfert de phase aqueuse à une nouvelle centrifugeuse 50 ml d'Oak Ridge. Ajouter un volume égal de chloroforme / alcool isoamylique (24:1, v / v).
12. Bouchon d'étanchéité et bien mélanger au vortex.
13. Centrifuger l'échantillon à 2500 g à 4 ° pendant 15 minutes. Retirer phase aqueuse (volume sera d'environ 50% du volume total de réaction) à 15 ml tube en polypropylène coniques et ajouter un volume égal d'isopropanol.
14. Incuber à -20 ° C pendant au moins 2 heures ou jusqu'au lendemain.
15. Centrifuger l'échantillon à 2500 g à 4 ° pendant 45 minutes. Un gel-like granules formera au fond du tube. Retirer le surnageant.
16. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol glacé à 70%. Vortex. Centrifuger l'échantillon à moins 10.000 g à 4 ° C pendant 5 minutes.
17. Enlever le surnageant et inverser le tube de laisser le culot sec à température ambiante pendant 10 minutes.
18. Reprendre le culot d'ARN dans 200 pl de l'eau sans RNase.

4. DNase Traitement (Turbo DNA-Free, Applied Biosystems)

1. Ajouter 20 ul de tampon 10X DNase Turbo et Turbo 2 ul de DNase et mélanger doucement.
2. Incuber à 37 ° pendant 20 minutes.
3. Ajouter 20 ul de réactif d'inactivation resuspendues DNase et bien mélanger.
4. Incuber 5 minutes à température ambiante, en mélangeant de temps en temps.
5. Centrifuger à 10000 g à température ambiante pendant 1,5 minutes et transférer le surnageant dans un tube de centrifugeuse de nouvelles.
6. Ajouter un volume de froid (4 °) l'acide phénol / chloroforme et bien mélanger au vortex pendant 1 minute.
7. Centrifuger à 12500 g à température ambiante pendant 2 minutes.
8. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube et ajouter 1 volume de chloroforme / alcool isoamylique (49:1 v / v), vortex.
9. Centrifuger à 12500 g à température ambiante pendant 2 minutes.
10. Transférer la phase aqueuse (environ 50% du volume total de réaction) à un nouveau tube.
11. Ajouter 0,1 volume d'acétate de sodium 3M, pH 5,5 et2,5 volumes d'éthanol glacé de 100%. Vortex.
12. Incuber à -20 ° C pendant au moins 2 heures ou à -80 ° pendant 30 minutes.
13. Centrifuger à 12000 g pendant 30 minutes à 4 °
14. Retirer le surnageant.
15. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol glacé à 70% par centrifugation pendant 5 minutes à 10000 g à 4 °.
16. Retirer le surnageant et sécher l'air pendant 10 minutes.
17. Reprendre le culot dans 100 ul d'eau sans RNase. Il peut être nécessaire de placer dans le bain d'eau 65 ° à resuspendre et dissoudre le culot.
18. Pour tester l'efficacité du traitement à la DNase, une norme RT-PCR pour l'amplification d'une protéine ribosomique (ou gène de référence) pourrait être effectuée pour les échantillons traités et non traités, sans utiliser de commandes RT.

5. Étape de nettoyage ARN (Qiagen, RNeasy Kit)

1. Se reporter aux pages 56-57 de Qiagen RNeasy Mini Handbook (4 ^e édition, avril 2006). Suivre les indications.

6. Les résultats représentatifs

Le montant de l'ARN total de bactéries récupérées en utilisant ce protocole est d'environ 2-3 mg à partir de deux cecums. L'ARN récupéré est en quantité suffisante et de qualité pour qPCR subséquentes, le profilage de transcription, l'ARN et des expériences Seq. La pureté ARN est systématiquement évaluée en mesurant le rapport 260nm/280nm ⁷ de l'échantillon, mais cette méthode ne donne aucune information sur l'intégrité ARN. Le bioanalyseur Agilent est une plateforme microfluidique à base de dimensionnement, de quantification et de contrôle de la qualité de l'ADN, ARN, protéines et des cellules, et utilise une métrique intégrité de l'ARN connue sous le nom Nombre intégrité de l'ARN (RIN) ^8. L'ARN extrait avec ce protocole produit des ratios 260/280 allant de 1,7 à 2,0 et des valeurs du RIN ≥ 7,0. Un exemple d'analyse Agilent Bioanalyzer de l'ARN bactérien récupéré par ce protocole est montré dans la figure 1.

Figure 1. Agilent Bioanalyzer électrophérogramme et gel-like image de Pseudomonas aeruginosa échantillon total ARN isolés et récupérés à partir murin contenu caecal. RIN 8.0.

Discussion

La méthode d'extraction d'ARN décrite ici permet la récupération de quantités suffisantes d'ARN Pseudomonas haute qualité totale aeruginosa récoltés par le tractus gastro-intestinal murin. Cette méthode n'est pas limitée à P. aeruginosa et peut potentiellement être appliqué à d'autres bactéries. La récupération des organismes microbiens suffisante de l'intestin varient considérablement d'un organisme à. Dans notre modèle murin, P. aeruginosa colonise généralement les voies gastro-intestinal murin à des niveaux compris entre 5 x 10 ⁷ à 5 x 10 ⁸ ufc / g fèces ^4. Comme le contenu récupéré caecale sont à peu près 0,5 gramme, le nombre estimé de P. aeruginosa récupéré à partir de deux cecums se situe entre 5 x 10 ⁷ à 5 x 10 ⁸ ufc. Si d'autres microorganismes sont utilisés, il serait prudent de vérifier les niveaux de colonisation IG et ensuite calculer le nombre de cecums nécessaires pour récupérer le nombre ciblé de ufc. Il est également important de noter que lorsque vous utilisez ce modèle particulier murins, les souris traitées aux antibiotiques n'est pas infecté par le PA n'ont pas des quantités mesurables de l'ARN isolé à partir de leur contenu caecal.

Notre modèle murin de la colonisation à Pseudomonas aeruginosa gastro-intestinaux et les tentatives d'imiter la diffusion de la pathogenèse de P. aeruginosa bactériémie chez les patients du cancer et greffe de cellules souches. Dans cette population de patients, la flore commensale est souvent appauvri secondaire à un traitement antibiotique ou chimiothérapeutique (par exemple l'épuisement des antibiotiques IG flore commensale) résultant de la prolifération des microbes pathogènes (par exemple les mono-association avec P. aeruginosa), puis diffusion ultérieure, après la suppression immunitaire. Les avantages et les limites de ce modèle murin ont déjà été abordées précédemment ^4. Le but de cette étude est de fournir une méthodologie pour isoler microbienne ARN total à partir du tractus gastro-intestinal. Ce protocole peut être facilement adaptée à d'autres modèles murins de cette étude d'autres aspects de la pathogenèse microbienne dans le tractus gastro-intestinal (c'est à dire des interactions commensales de la flore, les effets des bactéries sur les maladies inflammatoires de l'intestin, etc.)

Un avantage de cette méthode est l'incorporation de plusieurs étapes de lyse, y compris de gel / dégel, une rupture mécanique (broyage au mortier / pilon, homogénéisation), l'ébullition, et la lyse chimique (p. ex FDS). Malgré la multitude d'étapes de lyse, certains micro-organismes (notamment les bactéries Gram positif et les champignons / levures) peuvent exiger d'autres perturbations mécaniques. Après la lyse chaude / acide phénol-chloroforme incubation (étape 3.5), l'addition de billes (0,1 mm pour les bactéries et / ou 0,5 à 0,7 mm pour la levure) et une suite de billes battre étape devrait être suffisante pour lyser ces ^{9 organismes, 10.}

Étant donné la nature complexe des matériaux récupérés de l'murin cæcum, le froid, les extractions répétées acid-phenol/chloroform (étape 3.7 à 3.9) sont absolument nécessaires pour obtenir une qualité acceptable de l'ARN et l'intégrité des autres réactions en aval. Entre 3-5 extractions froide acid-phenol/chloroform peuvent être nécessaires avant que l'interface blanche entre les phases aqueuse et organique est éliminée. Enfin, la combinaison des deux dans le traitement DNase (étape 4) et le protocole RNeasy Cleanup (étape 5) sont indispensables pour éliminer l'ADN contaminant et petits non ARNm (5s et ARNt). Comme indiqué précédemment, l'ARN récupéré en utilisant ce protocole est de quantité et qualité suffisantes pour le profilage de transcription ultérieure ^3, qPCR (inédit), et de l'ARN Seq (inédit) des expériences.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mortar and Pestle	Fisher Scientific	12-947-1
Homogenizer	Omni	TM-125
Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml)	Nalge Nunc international	3119-0050
Acid Phenol/Chloroform	Ambion	AM9720
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Isoamyl Alcohol	Sigma-Aldrich	W205702
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	40718
DNase	Ambion	AM2238
RNeasy Kit	Qiagen	74104
3M Sodium Acetate	Ambion	AM9740
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023