Summary
En pålitlig metod för RNA isolering av
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (PA) infektioner leder till hög sjuklighet och dödlighet i hosts med nedsatt immunförsvar, såsom patienter med leukemi, svåra brännskador eller organtransplantationer 1. Hos patienter med hög risk att utveckla PA blodomloppet infektioner, är gastrointestinala (GI) tarmkanalen den huvudsakliga reservoaren för kolonisation 2, men de mekanismer genom vilka PA övergångar från en asymtomatisk kolonisera mikrob till en invasiv, och ofta dödliga, patogener är oklara. Tidigare utförde vi in vivo-experiment transkription profilering genom att återvinna PA mRNA från bakterieceller som bor i cecums av koloniserade möss 3 för att identifiera förändringar i bakteriellt genuttryck under förändringar värdens immunstatus.
Som med alla transkription profilering experiment, är det hastighetsbegränsande steget i isolering av tillräckliga mängder av hög kvalitet mRNA. Med tanke på det överflöd av enzymer, skräp, rester mat och partiklar i mag-tarmkanalen, är utmaningen av RNA isolering skrämmande. Här presenterar vi en metod för tillförlitliga och reproducerbara isolering av bakteriell RNA återhämtat sig från murina mag-tarmkanalen. Denna metod använder en väletablerad murin modell av PA GI kolonisation och neutropeni-inducerad spridning 4. När GI kolonisation med PA bekräftas, möss är euthanized och cecal innehållet återvinns och blixt fryst. RNA extraheras sedan med hjälp av en kombination av mekaniska störningar, kokning, fenol / kloroform extraktioner DNas behandling och affinitetskromatografi. Kvantitet och renhet bekräftas av spektrofotometri (Nanodrop Technologies) och bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig. 1). Denna metod för GI mikrobiell RNA isolering kan lätt anpassas till andra bakterier och svampar också.
Protocol
1. Murina Modell av P. aeruginosa GI Colonization och spridning
- C3H/HeN möss (6-8 v. gammal, kvinna, Harlan) behandlas med perorala antibiotika för att tömma kommensala flora och därefter mono-koloniserad med PA som tidigare beskrivits 4.
2. Skörd Murine cecal luminala Innehåll
- Doppa en rengjord rostfritt stål murbruk i ett flytande kväve bad.
- Euthanize möss med koldioxid kvävning.
- Säkert musen kadaver på en frigolit ombord och dusch med 95% etanol. Gör en mittlinjen längsgående snitt genom huden från bröstbenet till mellangården. Reflektera hud och bukhinna avslöja bukhålan.
- Resect hela blindtarmen. Håll blindtarmen med pincett under den rostfria murbruk. Klippa båda ändarna av blindtarmen med dissektion sax.
- Sätt in en P1000 pipettspets fylld med 1 ml cecal flushate buffert (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA och 200 mM NaCl) 5 i proximala änden av blindtarmen. Spola cecal flushate buffert och cecal luminala innehållet i den rostfria murbruk. 1 ml cecal flushate buffert kommer att vara tillräcklig för att spola alla cecal innehåll. Cecal flushate innehållet fryser omedelbart efter att komma i kontakt med murbruk.
- Slipa cecal flushate innehåll med en steril mortelstöt.
- Placera marken frusen cecal luminala innehållet i ett 50 ml polypropylen koniska röret nedsänkt i en torr is / etanol bad.
- Upprepa steg 2.2 till 2.7 för varje ytterligare mus.
- Förvaras vid -80 ° C.
3. Bakteriell RNA Isolering
- Värm 1 volym (baserat på slutlig volym på två cecal luminala innehåll, ca 3 ml) av syra fenol / kloroform (5:1, v / v) i en 50 ml Oak Ridge centrifugrör med locket säkras i parafilm i en 65 ° C vattenbad.
- Koka 0,5 volym lyseringsbuffert (2% SDS, 16 mM EDTA och 200 mM NaCl) 6 finns i en 50 ml polypropylen koniska röret i 5 minuter.
- Tillsätt kokande lyseringsbuffert att cecal luminala innehåll. Homogenisera. Koka i 5 minuter med periodisk vortexa.
- Lägg till 100 ° C cecal Innehållet / lysering provet till 65 ° C syra fenol / kloroform i Oak Ridge centrifugrör. Seal keps med parafilm.
- Inkubera vid 65 ° C i 10 minuter med periodisk vortexa (varje 2 minuter).
- Centrifugera provet vid 2500 g vid 4 ° i 15 minuter.
- Töm vattenfasen (undviker någon av de vita gränssnittet) till ett nytt 50 ml Oak Ridge centrifugen. Volymen i vattenfasen kommer att vara cirka 50% av den totala volymen cecal innehåll, lyseringsbuffert och syra fenol / kloroform. Tillsätt en motsvarande volym av syra fenol / kloroform.
- Seal keps med parafilm och blanda väl genom att vortexa med hög hastighet.
- Centrifugera provet vid 2500 g vid 4 ° i 15 minuter.
- Upprepa steg från 3,7 till 3,9 tills det inte finns något synligt vitt gränssnitt mellan vattenfasen och den organiska fasen.
- Töm vattenfasen till en ny 50 ml Oak Ridge centrifugen. Tillsätt en motsvarande volym av kloroform / Isoamyl alkohol (24:1, v / v).
- Täta locket och blanda väl genom att vortexa.
- Centrifugera provet vid 2500 g vid 4 ° i 15 minuter. Ta bort vattenfasen (volymen kommer att vara cirka 50% av den totala reaktionen volym) till 15 ml polypropylen koniska rör och tillsätt en lika stor volym av isopropanol.
- Inkubera vid -20 ° i minst 2 timmar eller över natten.
- Centrifugera provet vid 2500 g vid 4 ° i 45 minuter. En gel-liknande pellets kommer att ligga på botten av röret. Avlägsna supernatanten.
- Tvätta pelleten med 1 ml iskall 70% etanol. Vortex. Centrifugera provet vid vid 10000 g vid 4 ° i 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och vänd röret att låta pellets torka i rumstemperatur i 10 minuter.
- Resuspendera RNA pelleten i 200 ìl RNase-fritt vatten.
4. DNas Behandling (Turbo DNA-Free, Applied Biosystems)
- Tillsätt 20 l 10X Turbo DNas buffert och 2 l Turbo DNas och blanda försiktigt.
- Inkubera vid 37 ° i 20 minuter.
- Tillsätt 20 l återsuspenderad DNas inaktivering reagens och blanda väl.
- Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur, blandning ibland.
- Centrifugera vid 10000 g vid rumstemperatur i 1,5 minuter och överför supernatanten till ett nytt mikrofugrör.
- Lägg till en volym av kyla (4 °) syra fenol / kloroform och blanda väl genom att vortexa i 1 minut.
- Centrifugera vid 12.500 g vid rumstemperatur i 2 minuter.
- Överför vattenfasen till ett nytt rör och tillsätt 1 volym kloroform / Isoamyl alkohol (49:1 v / v), virvel.
- Centrifugera vid 12.500 g vid rumstemperatur i 2 minuter.
- Överför vattenfasen (ca 50% av den totala reaktionen volym) till ett nytt rör.
- Tillsätt 0,1 volym 3M natriumacetat, pH 5,5 och2,5 volymer av iskall 100% etanol. Vortex.
- Inkubera vid -20 ° i minst 2 timmar eller vid -80 ° i 30 minuter.
- Centrifugera vid 12 tusen g under 30 minuter vid 4 °
- Avlägsna supernatanten.
- Tvätta pelleten med 1 ml iskall 70% etanol genom att centrifugera i 5 minuter vid 10000 g vid 4 °.
- Avlägsna supernatanten och lufttorka i 10 minuter.
- Återsuspendera pelleten i 100 ìl RNase-fritt vatten. Kan behöva ske i 65 ° vattenbad till resuspendera och lös pelleten.
- För att testa effekten av DNas behandling, kan en vanlig RT-PCR-reaktion för amplifiering av en ribosomala protein (eller annan referens gen) göras för behandlade och obehandlade prover, använder inga RT kontroller.
5. RNA Cleanup Steg (Qiagen, RNeasy Kit)
- Se sidorna 56-57 för Qiagen RNeasy Mini Handbook (4: e upplagan, april 2006). Följ som visas.
6. Representativa resultat
Mängden bakterier totala RNA återvinns genom att använda det här protokollet är 2-3 mikrogram från två cecums. Den återvunna RNA är av tillräcklig kvantitet och kvalitet för senare qPCR, transkription profilering, och RNA Seq experiment. RNA renhet rutinmässigt utvärderas genom att mäta 260nm/280nm förhållandet 7 av provet, men den här metoden ger ingen information om RNA integritet. Den Agilent Bioanalyzer är en mikrofluidik-baserad plattform för dimensionering, kvantifiering och kvalitetskontroll av DNA, RNA, proteiner och celler, och använder en RNA integriteten metriska kallas RNA Integrity Number (RIN) 8. RNA extraheras med detta protokoll ger 260/280 nyckeltal som sträcker sig från 1,7 till 2,0 och RIN värden ≥ 7,0. Ett exempel på en Agilent Bioanalyzer analys av bakteriell RNA återvinnas genom detta protokoll visas i figur 1.
Figur 1. Agilent Bioanalyzer electropherogram och gel-liknande bild av Pseudomonas aeruginosa totala RNA-prov isolerade och återhämtat sig från murina cecal innehåll. RIN 8,0.
Discussion
RNA-extraktion som beskrivs här tillåter återvinning av tillräckliga mängder av högkvalitativa Pseudomonas aeruginosa RNA totala skördats från murina mag-tarmkanalen. Denna metod är inte begränsad till P. aeruginosa och kan potentiellt användas till andra bakterier. Återhämtningen av tillräcklig mikroorganismer från tarmen varierar betydligt från organism till organism. I vår murina modell, s. aeruginosa koloniserar vanligtvis murina magtarmkanalen på nivåer mellan 5 x 10 7 till 5 x 10 8 cfu / g avföring 4. Sedan återhämtade cecal innehållet är ungefär 0,5 gram, det uppskattade antalet P. aeruginosa återhämtat sig från två cecums är mellan 5 x 10 7 till 5 x 10 8 CFU. Om andra mikroorganismer används, skulle det vara klokt att kontrollera GI kolonisation nivåer och sedan beräkna antalet cecums som behövs för att återfå de riktade antal CFU. Det är också viktigt att notera att när du använder denna murina modell Antibiotikabehandlade möss inte är infekterade med PA har inga mätbara mängder av RNA isoleras från sina cecal innehåll.
Vår mus modell av Pseudomonas aeruginosa mag kolonisation och försöker sprida att efterlikna patogenesen av P. aeruginosa bakteriemi i cancer och stamceller patienter. I denna patientgrupp är kommensala floran ofta utarmat sekundärt till behandling med antibiotika eller kemoterapeutiska behandling (t.ex. antibiotika utarmning av GI kommensala floran) resulterar i överväxt av patogena mikrober (t.ex. mono-förening med P. aeruginosa) och sedan påföljande spridning efter immunsystemet. Fördelar och begränsningar av denna mus modell har redan behandlats tidigare 4. Syftet med denna aktuella studien är att ge en metod för att isolera mikrobiell totala RNA från mag-tarmkanalen. Detta protokoll kan enkelt anpassas till andra murina modeller som studerar andra aspekter av mikrobiell patogenes i mag-tarmkanalen (dvs. commensal flora interaktioner, bakteriella effekter på inflammatorisk tarmsjukdom, etc.).
En fördel med denna metod är införandet av flera lys steg inklusive frys / tö, mekaniska störningar (pulverisering med murbruk / stöt, homogenisering), kokning, och kemisk lys (t ex SDS). Trots de många lys steg, kan vissa mikroorganismer (framför allt grampositiva bakterier och svamp / jäst) kräva ytterligare mekaniska störningar. Efter den heta lys / syra fenol-kloroform inkubationen (steg 3,5), tillägg av kulor (0,1 mm för bakterier och / eller 0,5-0,7 mm för jäst) och en efterföljande pärla-slå steg bör vara tillräcklig för att lysera dessa organismer 9, 10.
Med tanke på de komplicerade material som återvunnits från murina blindtarmen, de upprepade kalla acid-phenol/chloroform extraktioner (steg från 3,7 till 3,9) är absolut nödvändiga för att uppnå acceptabel RNA kvalitet och integritet för vidare reaktioner. Mellan 3-5 kallt acid-phenol/chloroform extraktioner kan krävas innan de vita gränssnittet mellan vattenfasen och den organiska fasen elimineras. Slutligen, en kombination av både DNase behandling (Steg 4) och RNeasy Cleanup Protocol (steg 5) är väsentliga för att avlägsna kontaminerande DNA och små icke-mRNA (5s och tRNA). Som nämnts tidigare är RNA återvinns genom att utnyttja detta protokoll av tillräcklig kvantitet och kvalitet för senare transkription profilering 3, qPCR (opublicerade) och RNA Seq (opublicerade) experiment.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health bidrag AI62983 (AYK), AI22535 (GPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mortar and Pestle | Fisher Scientific | 12-947-1 | |
| Homogenizer | Omni | TM-125 | |
| Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalge Nunc international | 3119-0050 | |
| Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74104 | |
| 3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |
References
- Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. Infections caused by Pseudomonas aeruginosa. Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).
- Bertrand, X. Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units. Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).
- Koh, A. Y. Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination. PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).
- Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia. Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).
- Alexander, R. J., Raicht, R. F. Purification of total RNA from human stool samples. Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).
- Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR. J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).
- Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 20, 968-970 (1996).
- Schroeder, A. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).
- Turnbaugh, P. J. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature. 457, 480-484 (2009).
