Summary
وهناك طريقة يمكن الاعتماد عليها لعزل الحمض النووي الريبي ل
Abstract
الزائفة الزنجارية نتيجة العدوى (السلطة الفلسطينية) في قسط كبير من المراضة والوفيات في المضيفين مع الجهاز المناعي للخطر ، مثل المرضى الذين يعانون من سرطان الدم وحروق شديدة ، أو زرع الأعضاء 1. في المرضى المعرضين للخطر عالية لتطوير التهابات مجرى الدم السلطة الفلسطينية ، والجهاز الهضمي (غي) المسالك هو الخزان الرئيسي للاستعمار 2 ، ولكن الآليات التي التحولات السلطة الفلسطينية من جرثومة استعمار an أعراض لالغازية ، وعادة ما يكون مميتا ، الممرض غير واضحة. سابقا ، وأجرينا في التجارب المجراة التنميط النسخ التي تتعافى من السلطة الفلسطينية مرنا الخلايا البكتيرية المقيمين في cecums المستعمرة 3 الفئران من أجل تحديد التغييرات في تعبير الجينات البكتيرية خلال التعديلات في حالة المضيف المناعية.
كما هو الحال مع أي نسخ التجربة التنميط ، في خطوة تحد من معدل في عزلة كميات كافية من مرنا ذات جودة عالية. بالنظر إلى وفرة من الإنزيمات ، والحطام ، وبقايا الطعام ، والجسيمات في الجهاز الهضمي ، والتحدي هو الحمض النووي الريبي من العزلة الرهيبة. هنا ، فإننا نقدم وسيلة لعزل موثوق بها وقابلة للتكرار من الحمض النووي الريبي البكتيرية تعافى من الجهاز الهضمي الفئران. هذا الأسلوب يستخدم نموذجا راسخة الفئران الاستعمار GI السلطة الفلسطينية والعدلات المحرض نشر 4. وأكد غي الاستعمار مرة واحدة مع السلطة الفلسطينية ، والفئران ويتم استرداد محتويات الموت الرحيم والأعور والمجمدة فلاش. ثم يتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مزيج من التعطيل والغليان الميكانيكية ، والفينول / كلوروفورم الاستخراج والمعالجة الدناز ، واللوني للتقارب. وأكد الكمية والنقاء بواسطة القياس الطيفي (Nanodrop تكنولوجيز) وbioanalyzer (اجيلنت تكنولوجيز) (الشكل 1). يمكن بسهولة هذا الأسلوب من الجراثيم GI RNA العزلة أن تتكيف مع غيرها من البكتيريا والفطريات كذلك.
Protocol
1. فأري موديل P. الزنجارية الاستعمار ونشر GI
- يتم التعامل مع الفئران C3H/HeN (6-8 WKS القديمة ، أنثى ، هارلان) مع المضادات الحيوية عن طريق الفم لاستنزاف النباتات المتعايشة ثم أحادية المستعمر مع السلطة الفلسطينية كما هو موضح سابقا 4.
2. حصاد الفئران المحتويات اللمعية الأعوري
- تزج a تنظيف هاون الفولاذ المقاوم للصدأ في حمام النيتروجين السائل.
- الموت ببطء الفئران خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون.
- تأمين الذبيحة الماوس على متن الستايروفوم والدش مع الايثانول 95 ٪. جعل شق طولي خط الوسط عن طريق الجلد من القص في العجان. يعكس الجلد والغشاء البريتوني لفضح تجويف البطن.
- يقطع الأعور بأكمله. عقد الأعور بالملقط هاون على الفولاذ المقاوم للصدأ. قص طرفي الأعور مع مقص تشريح.
- اضافة الى وجود طرف ماصة P1000 مليئة 1 مل من العازلة flushate الأعور (10 ملي TrisHCl ، 1 ملم و 200 كلوريد الصوديوم EDTA ملم) 5 في النهاية القريبة من الأعور. تدفق العازلة flushate الأعور ومحتويات اللمعية الأعوري هاون في الفولاذ المقاوم للصدأ. وسوف 1 مل من العازلة flushate الأعور يكون كافيا لصرف كل محتويات الأعور. والأعور محتويات flushate تجميد فور اتصالهم مع هاون.
- طحن محتويات flushate الأعور مع مدقة العقيمة.
- الأرض مكان المجمدة محتويات اللمعية الأعور في أنبوب 50 مل البولي بروبلين المخروطية المغمورة في حمام الثلج / الايثانول الجاف.
- كرر الخطوات من خلال 2،2 2،7 لكل الماوس إضافية.
- المحل في -80 درجة مئوية.
3. عزل الحمض النووي الريبي البكتيرية
- 1 الدافئة حجم (استنادا إلى الحجم النهائي من محتويات two اللمعية الأعور ، ما يقرب من 3 مل) من حمض الفينول / الكلوروفورم (5:1 ، V / V) الواردة في أنبوب 50 مل أوك ريدج الطرد المركزي مع غطاء المضمون في parafilm في 65 ° C حمام الماء.
- تغلي 0.5 حجم المخزن تحلل (2 ٪ SDS ، EDTA 16 ملم و 200 ملم كلوريد الصوديوم) 6 الواردة في أنبوب البولي بروبلين 50 مل المخروطية لمدة 5 دقائق.
- إضافة إلى الغليان العازلة تحلل محتويات اللمعية الأعور. التجانس. يغلي لمدة 5 دقائق مع vortexing الدورية.
- إضافة 100 درجة مئوية محتويات الأعور / تحلل عينات للحمض 65 درجة مئوية الفينول / كلوروفورم الطرد المركزي في أوك ريدج أنبوب. ختم غطاء مع parafilm.
- احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع vortexing الدورية (كل دقيقة 2).
- عينة الطرد المركزي في 2500 غرام عند 4 درجات لمدة 15 دقيقة.
- نقل بدقة المرحلة المائية (تجنب أي من واجهة بيضاء) إلى 50 مل الطازجة الطرد المركزي أوك ريدج. وحجم المرحلة المائية بحوالي 50 ٪ من إجمالي حجم محتويات الأعور ، تحلل العازلة ، وحامض الفينول / الكلوروفورم. إضافة حجم مساو من حامض الفينول / الكلوروفورم.
- ختم غطاء مع parafilm ومزيج جيد من قبل vortexing بسرعة عالية.
- عينة الطرد المركزي في 2500 غرام عند 4 درجات لمدة 15 دقيقة.
- كرر الخطوات 3،7-3،9 حتى يكون هناك أي واجهة مرئية البيضاء بين المرحلتين المائي والعضوي.
- نقل بدقة المرحلة المائية العذبة لأجهزة الطرد المركزي 50 مل أوك ريدج. إضافة حجم مساو من كلوروفورم / كحول أيزو أميلي (24:1 ، V / V).
- ختم غطاء ومزيج جيد من قبل vortexing.
- عينة الطرد المركزي في 2500 غرام عند 4 درجات لمدة 15 دقيقة. إزالة المرحلة المائية (من حيث الحجم سيكون حوالي 50 ٪ من حجم رد الفعل الكل) إلى 15 مل أنبوب البولي بروبلين المخروطية وإضافة حجم مساو من الأيزوبروبانول.
- في احتضان ° -20 لما لا يقل عن 2 ساعة أو بين عشية وضحاها.
- عينة الطرد المركزي في 2500 غرام عند 4 درجات لمدة 45 دقيقة. وسوف هلام مثل بيليه النموذج في الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة طاف.
- غسل بيليه مع 1 مل من الجليد الباردة الايثانول 70 ٪. الدوامة. أجهزة الطرد المركزي في 10000 عينة في غرام عند 4 درجات لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف وعكس أنبوب للسماح للجفاف بيليه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- Resuspend بيليه في الحمض النووي الريبي في 200 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه.
4. الدناز المعاملة (توربو الدنا الحر ، والنظم البيولوجية التطبيقية)
- إضافة ميكرولتر من 20 10X العازلة الدناز توربو و 2 ميكرولتر الدناز توربو ومزيج بلطف.
- احتضان عند 37 درجة لمدة 20 دقيقة.
- إضافة 20 كاشف ميكرولتر من معلق تعطيل الدناز وتخلط جيدا.
- احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، والخلط أحيانا.
- الطرد المركزي في 10000 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 دقيقة ، وطاف لنقل أنبوب microfuge جديدة.
- إضافة مجلد واحد من حمض (4 °) الباردة الفينول / الكلوروفورم ومزيج دقيق من قبل لvortexing 1 دقيقة.
- الطرد المركزي في 12500 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
- نقل المرحلة المائية لأنبوب جديد وإضافة 1 حجم كلوروفورم / كحول أيزو أميلي (49:1 V / V) ، الدوامة.
- الطرد المركزي في 12500 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
- نقل المرحلة المائية (حوالي 50 ٪ من إجمالي حجم رد الفعل) إلى أنبوب جديد.
- إضافة 0.1 حجم خلات الصوديوم 3M ، ودرجة الحموضة 5.5 و2.5 كميات من الجليد الباردة الإيثانول بنسبة 100 ٪. الدوامة.
- في احتضان ° -20 لما لا يقل عن 2 ساعة أو على -80 درجة لمدة 30 دقيقة.
- ز الطرد المركزي في 12000 لمدة 30 دقيقة على 4 درجات
- إزالة طاف.
- غسل بيليه مع 1 مل من الجليد الباردة الايثانول 70 ٪ بحلول الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 10000 غرام عند 4 درجات.
- إزالة طاف الجافة والهواء لمدة 10 دقيقة.
- Resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه. قد تحتاج إلى 65 درجة في مكان حمام الماء لresuspend وحل بيليه.
- لاختبار فعالية العلاج الدناز ، يمكن إجراء RT - PCR القياسية لتضخيم رد فعل من البروتين الريباسي (أو غيرها من الجينات المرجعي) للعينات المعالجة وغير المعالجة ، وذلك باستخدام أي ضوابط RT.
5. RNA الخطوة تنظيف (Qiagen ، RNeasy كيت)
- الرجوع إلى صفحات 56-57 من كتيب صغير Qiagen RNeasy (4 الطبعة الخامسة ، نيسان 2006). اتبع كما هو مبين.
6. ممثل النتائج
كمية من الحمض النووي الريبي مجموع البكتيرية استرداد باستخدام هذا البروتوكول هو حوالي 2-3 ميكروغرام من اثنين cecums. استعاد الجيش الملكي النيبالي هو كمية ونوعية كافية لqPCR اللاحقة ، التنميط النسخ ، والتجارب تسلسل الحمض النووي الريبي. ويتم تقييم روتيني RNA النقاء من خلال قياس نسبة 260nm/280nm 7 من العينة ، ولكن هذا الأسلوب لا يقدم أي معلومات حول سلامة الحمض النووي الريبي. وBioanalyzer اجيلنت هو منصة على microfluidics قائم على القياس الكمي ، التحجيم والسيطرة النوعية من الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، والبروتينات والخلايا ، ويستخدم لقياس سلامة المعروف باسم الحمض النووي الريبي RNA النزاهة رقم (رين) 8. استخراج الحمض النووي الريبي لهذا البروتوكول ، وتنتج نسبة تتراوح 260/280 1،7-2،0 والقيم RIN 7.0 ≥. ويرد مثال لتحليل Bioanalyzer اجيلنت من الحمض النووي الريبي البكتيرية تعافى من هذا البروتوكول في الشكل 1.
الشكل 1. اجيلنت Bioanalyzer مخطط رحلاني وهلام تشبه صورة عينة الحمض النووي الريبي مجموع الزائفة الزنجارية معزولة وتعافى من محتويات الأعور الفئران. RIN 8.0.
Discussion
طريقة استخراج الحمض النووي الريبي وصفها هنا يسمح لاسترداد كميات كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة الزائفة الزنجارية تحصد من مجموع الجهاز الهضمي الفئران. لا يقتصر هذا الأسلوب لP. يمكن أن يحتمل الزنجارية ويمكن تطبيقها على غيرها من البكتيريا. فإن الانتعاش من الكائنات الجرثومية كافية من الأمعاء تختلف بشكل كبير من كائن إلى كائن. نموذجنا في الفئران ، P. الزنجارية تستوطن عادة في الجهاز الهضمي عند الفئران المستويات بين 5 × 07 حتي 05 أكتوبر × 10 8 CFU / ز 4 البراز. منذ محتويات انتشال ما يقرب من 0.5 الأعوري غرام ، ويقدر عدد P. الزنجارية انتشال اثنين من cecums بين 5 × 10 س CFU 07-05 أغسطس 10. إذا تم استخدام الكائنات الحية الدقيقة الأخرى ، سيكون من الحكمة أن تحقق مستويات GI الاستعمار ومن ثم حساب عدد cecums اللازمة لاسترداد العدد المستهدف من هراري. من المهم أيضا أن نلاحظ أنه عند استخدام هذا النموذج خاص الفئران ، الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية غير المصابين مع السلطة الفلسطينية ليس لديهم كميات قابلة للقياس الكمي من الحمض النووي الريبي معزولة عن محتوياتها الأعور.
لدينا نموذج الفئران من الاستعمار الزائفة الزنجارية الجهاز الهضمي ومحاولات نشر لمحاكاة المرضية P. تجرثم الدم في مرضى السرطان وزرع الخلايا الجذعية الزنجارية. في هذه الفئة من السكان المريض ، وغالبا ما يتم المنضب المتعايشة النباتات الثانوية للعلاج بالمضادات الحيوية أو العلاج الكيميائي (مثل استنزاف للمضادات الحيوية في النباتات المتعايشة GI) مما أدى إلى فرط نمو الميكروبات المسببة للأمراض (مثل أحادية بالاشتراك مع الزنجارية P.) ونشر بعد ذلك لاحقا بعد قمع المناعي. مزايا وقيود من هذا النموذج الفأري بالفعل تم تناولها سابقا 4. الغرض من هذه الدراسة الحالية هو تقديم منهجية لعزل الحمض النووي الريبي مجموع الميكروبية من الجهاز الهضمي. ويمكن بسهولة أن تتكيف هذا البروتوكول على نماذج الفئران الأخرى التي دراسة جوانب أخرى من الجراثيم المرضية في الجهاز الهضمي (أي النباتات المتعايشة التفاعلات والتأثيرات الجرثومية على مرض التهاب الامعاء ، الخ).
ميزة واحدة من هذا الأسلوب هو دمج خطوات متعددة بما في ذلك تجميد تحلل / ذوبان الجليد ، واختلال الميكانيكية (مع تحطيم التجانس ومدافع الهاون / مدقة) ، الغليان ، وتحلل المواد الكيميائية (مثل الحزب الديمقراطي الصربي). على الرغم من العديد من الخطوات تحلل ، قد تكون بعض الكائنات الحية الدقيقة (لاسيما إيجابية الجرام البكتيريا والفطريات / الخميرة) تتطلب تعطيل ميكانيكية إضافية. وينبغي بعد الساخنة تحلل / حامض الفينول كلوروفورم الحضانة (الخطوة 3.5) ، وبالإضافة إلى ذلك من الخرز (0.1 ملم للبكتيريا و / أو 0،5-0،7 مم للخميرة) والخطوة اللاحقة حبة الضرب يكون كافيا لهذه الكائنات ليز 9 ، 10.
نظرا للطبيعة المعقدة للمواد المستخرجة من الفئران الأعور ، وكرر الباردة acid-phenol/chloroform الاستخراج (الخطوة 3،7-3،9) مطلوبة للغاية من أجل تحقيق الجودة ومقبولة رنا سلامة المصب لتفاعلات أخرى. وقد بين 3-5 قلع acid-phenol/chloroform الباردة يلزم قبل واجهة بيضاء بين المرحلتين المائي والعضوي هو القضاء. أخيرا ، فإن الجمع بين كل من العلاج والدناز (الخطوة 4) وبروتوكول RNeasy تنظيف (الخطوة 5) ضرورية لإزالة تلويث الحمض النووي والصغيرة غير مرنا (5S والحمض الريبي النووي النقال). كما ذكر سابقا ، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي تعافى هذا البروتوكول هو كمية ونوعية كافية لتحديد ملامح النسخ اللاحقة 3 ، qPCR (غير منشورة) ، والجيش الملكي النيبالي التجارب تسلسل (غير منشور).
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AI62983 (AYK) ، AI22535 (الباوند).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mortar and Pestle | Fisher Scientific | 12-947-1 | |
| Homogenizer | Omni | TM-125 | |
| Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalge Nunc international | 3119-0050 | |
| Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74104 | |
| 3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |
References
- Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. Infections caused by Pseudomonas aeruginosa. Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).
- Bertrand, X. Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units. Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).
- Koh, A. Y. Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination. PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).
- Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia. Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).
- Alexander, R. J., Raicht, R. F. Purification of total RNA from human stool samples. Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).
- Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR. J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).
- Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 20, 968-970 (1996).
- Schroeder, A. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).
- Turnbaugh, P. J. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature. 457, 480-484 (2009).
