Summary
शाही सेना के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय विधि
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (PA) महत्वपूर्ण समझौता लेकिमिया के साथ रोगियों, गंभीर जला घाव, या अंग प्रत्यारोपण के एक जैसे प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ मेजबान में रुग्णता और मृत्यु दर में संक्रमण परिणाम. फिलीस्तीनी अथॉरिटी खून में संक्रमण के विकास के लिए उच्च जोखिम में रोगियों में जठरांत्र संबंधी मार्ग (GI) 2 उपनिवेशण के लिए मुख्य जलाशय है, लेकिन तंत्र है जिसके द्वारा एक स्पर्शोन्मुख बस्तियां सूक्ष्म जीव से एक आक्रामक है, और अक्सर घातक पीए संक्रमण, रोगज़नक़ स्पष्ट नहीं कर रहे हैं. इससे पहले, हम पीए mRNA बैक्टीरियल कोशिकाओं के cecums में रहने से ठीक 3 चूहों उपनिवेश क्रम में मेजबान प्रतिरक्षा स्थिति के लिए परिवर्तन के दौरान जीवाणु जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की पहचान के द्वारा vivo में प्रतिलेखन रूपरेखा प्रयोगों में प्रदर्शन किया.
किसी भी प्रतिलेखन रूपरेखा के साथ प्रयोग के रूप में, उच्च गुणवत्ता mRNA की पर्याप्त मात्रा के अलगाव में कदम दर सीमित है. एंजाइमों, मलबे, खाद्य अवशेषों, और GI पथ में बात कण की बहुतायत को देखते हुए, शाही सेना के अलगाव की चुनौती कठिन है. यहाँ, हम murine GI पथ से बरामद बैक्टीरियल शाही सेना के विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. यह विधि एक अच्छी तरह से स्थापित पीए सैनिक उपनिवेशण और neutropenia प्रेरित 4 प्रसार के murine मॉडल का इस्तेमाल करता. फिलीस्तीनी अथॉरिटी के साथ एक बार सैनिक उपनिवेशण की पुष्टि की है, चूहों euthanized और cecal सामग्री बरामद फ़्लैश जमे हुए हैं. आरएनए तो व्यवधान यांत्रिक, उबलते, फिनोल / क्लोरोफॉर्म extractions, DNase उपचार, और आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का एक संयोजन का उपयोग कर निकाला है. मात्रा और शुद्धता spectrophotometry (Nanodrop टेक्नोलॉजीज) और bioanalyzer (Agilent टेक्नोलॉजीज) (चित्र 1) के द्वारा पुष्टि कर रहे हैं. सैनिक माइक्रोबियल आरएनए अलगाव का यह तरीका आसानी से अन्य जीवाणु और कवक के रूप में अच्छी तरह से अनुकूलित किया जा सकता है.
Protocol
1. पी. की murine मॉडल aeruginosa सैनिक औपनिवेशीकरण और प्रसार
- C3H/HeN चूहों (6-8 wks बूढ़े, महिला, Harlan) मौखिक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज कर रहे हैं खानेवाला वनस्पति को व्यय करना और फिर फिलीस्तीनी अथॉरिटी के साथ मोनो उपनिवेश के रूप में पहले 4 में वर्णित है.
2. Murine Cecal luminal सामग्री फसल काटने वाले
- एक तरल नाइट्रोजन स्नान में एक साफ स्टेनलेस स्टील मोर्टार विसर्जित कर दिया.
- कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation द्वारा चूहों euthanize.
- एक स्टायरोफोम बोर्ड और 95% इथेनॉल के साथ बौछार पर सुरक्षित माउस लोथ. उरोस्थि से perineum के लिए त्वचा के माध्यम से एक midline अनुदैर्ध्य चीरा बनाओ. त्वचा और उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए पेरिटोनियम दर्शाते हैं.
- पूरे अंधान्त्र बांटना. स्टेनलेस स्टील मोर्टार पर संदंश के साथ अंधान्त्र पकड़ो. विच्छेदन कैंची के साथ अंधान्त्र के दोनों सिरों कटा हुआ.
- एक P1000 विंदुक cecal flushate (10 मिमी TrisHCl, 1 मिमी EDTA और 200 मिमी NaCl) अंधान्त्र के प्रॉक्सिमल अंत में बफर 5 का 1 मिलीलीटर के साथ भरा टिप डालें . स्टेनलेस स्टील मोर्टार में cecal flushate बफर और cecal luminal सामग्री फ्लश. Cecal flushate बफर के 1 मिलीलीटर cecal सामग्री के सभी निस्तब्धता के लिए पर्याप्त होगा. Cecal flushate सामग्री तुरंत मोर्टार के साथ संपर्क में आने पर फ्रीज होगा.
- एक बाँझ मूसल के साथ cecal flushate सामग्री पीस.
- प्लेस जमीन एक 50 मिलीलीटर polypropylene शंक्वाकार एक सूखी स्नान / बर्फ इथेनॉल में डूबे हुए ट्यूब में cecal luminal सामग्री जमे हुए.
- दोहराएँ 2.7 के माध्यम से प्रत्येक अतिरिक्त माउस के लिए 2.2 कदम.
- -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस
3. बैक्टीरियल शाही सेना अलगाव
- Phenol / क्लोरोफॉर्म एसिड के गर्म 1 मात्रा (दो cecal luminal सामग्री के अंतिम मात्रा के आधार पर, 3 लगभग मिलीलीटर) (05:01, v / v) एक 65 में parafilm में सुरक्षित टोपी के साथ एक 50 मिलीलीटर ओक रिज अपकेंद्रित्र ट्यूब में निहित डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान.
- Lysis बफर का 0.5 मात्रा (2% एसडीएस, 16 मिमी EDTA और 200 मिमी NaCl) 6 5 मिनट के लिए एक 50 मिलीलीटर polypropylene शंक्वाकार ट्यूब में निहित उबाल लें.
- Cecal luminal सामग्री के लिए उबलते lysis बफर जोड़ें. Homogenize. आवधिक vortexing के साथ 5 मिनट के लिए उबाल लें.
- जोड़ें 100 डिग्री सेल्सियस cecal सामग्री को 65 डिग्री सेल्सियस एसिड / ओक रिज अपकेंद्रित्र ट्यूब में phenol के क्लोरोफॉर्म / lysis नमूना. Parafilm के साथ सील टोपी.
- 65 में सेते डिग्री सेल्सियस आवधिक vortexing (हर 2 मिनट) के साथ 10 मिनट के लिए.
- 2,500 g पर 15 मिनट के लिए 4 ° पर नमूना अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से एक ताजा 50 मिलीलीटर ओक रिज अपकेंद्रित्र जलीय चरण (सफेद अंतरफलक के किसी भी परहेज) हस्तांतरण. जलीय चरण की मात्रा cecal सामग्री, lysis बफर, और phenol / क्लोरोफॉर्म एसिड की कुल मात्रा का लगभग 50% हो जाएगा. Phenol / क्लोरोफॉर्म एसिड की एक समान मात्रा में जोड़ें.
- Parafilm के साथ सील टोपी और मिश्रण अच्छी तरह से उच्च गति पर vortexing द्वारा.
- 2,500 g पर 15 मिनट के लिए 4 ° पर नमूना अपकेंद्रित्र.
- 3.7 3.9 चरण दोहराएँ जब तक वहाँ जलीय और जैविक चरणों के बीच नहीं दिखाई सफेद अंतरफलक है.
- ध्यान से एक ताजा 50 मिलीलीटर ओक रिज अपकेंद्रित्र जलीय चरण हस्तांतरण. क्लोरोफॉर्म / isoamyl शराब के एक बराबर मात्रा (24:1, v, v /) जोड़ें.
- सील टोपी और मिश्रण अच्छी तरह से vortexing द्वारा.
- 2,500 g पर 15 मिनट के लिए 4 ° पर नमूना अपकेंद्रित्र. 15 मिलीलीटर polypropylene शंक्वाकार ट्यूब जलीय चरण (मात्रा प्रतिक्रिया की कुल मात्रा का लगभग 50% हो जाएगा) निकालें और isopropanol के एक बराबर मात्रा में जोड़ें.
- कम से कम 2 घंटे या रात भर के लिए -20 ° सेते हैं.
- 2,500 g पर 45 मिनट के लिए 4 ° पर नमूना अपकेंद्रित्र. गोली की तरह जेल ट्यूब के नीचे बनेगी. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- ठंडा 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ गोली धो लें. भंवर. 5 मिनट के लिए 4 ° पर 10,000 जी पर नमूना अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गोली सूख जाने ट्यूब पलटना.
- RNase मुक्त पानी के 200 μl में शाही सेना गोली Resuspend.
4. DNase उपचार (टर्बो डीएनए नि: शुल्क, एप्लाइड Biosystems)
- 10X टर्बो DNase बफर और 2 μl टर्बो DNase के 20 μl जोड़ें और धीरे मिश्रण.
- 20 मिनट के लिए 37 ° पर सेते हैं.
- Resuspended DNase निष्क्रियता अभिकर्मक के 20 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट सेते हैं, कभी कभी मिश्रण.
- 1.5 मिनट के लिए 10,000 कमरे के तापमान पर छ अपकेंद्रित्र और एक नया microfuge ट्यूब करने के लिए सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण.
- ठंड (4 °) फिनोल / क्लोरोफॉर्म एसिड की एक मात्रा में जोड़ें और 1 मिनट के लिए vortexing द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से.
- 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 12,500 जी पर अपकेंद्रित्र.
- एक नया ट्यूब जलीय चरण स्थानांतरण और क्लोरोफॉर्म / isoamyl (49:1 v / v) शराब, भंवर 1 की मात्रा जोड़ें.
- 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 12,500 जी पर अपकेंद्रित्र.
- जलीय चरण (प्रतिक्रिया की कुल मात्रा का लगभग 50%) एक नया ट्यूब पर स्थानांतरण.
- 3M सोडियम एसीटेट के 0.1 मात्रा, 5.5 पीएच और जोड़ेंठंडा 100% इथेनॉल के 2.5 संस्करणों. भंवर.
- कम से कम 2 घंटे के लिए या 30 मिनट के लिए -80 ° -20 ° सेते हैं.
- 4 में 30 मिनट के लिए 12,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र °
- सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- 4 ° पर 10,000 जी पर 5 मिनट के लिए centrifuging द्वारा गोली ठंडा 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ धोएं.
- 10 मिनट के लिए सतह पर तैरनेवाला और शुष्क हवा निकालें.
- RNase मुफ्त पानी के 100 μl में गोली Resuspend. 65 ° पानी स्नान में जगह के लिए resuspend और गोली भंग पड़ सकता है.
- DNase उपचार की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए, एक ribosomal प्रोटीन (या अन्य संदर्भ जीन) के प्रवर्धन के लिए एक मानक प्रतिक्रिया RT-पीसीआर इलाज और गैर इलाज के नमूने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है, कोई आरटी नियंत्रण का उपयोग.
5. शाही सेना क्लीनअप चरण (Qiagen, RNeasy किट)
- Qiagen RNeasy मिनी हैंडबुक (4 वें संस्करण, अप्रैल 2006) के 56-57 पृष्ठों का संदर्भ लें. पालन के रूप में संकेत दिया.
6. प्रतिनिधि परिणाम
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीवाणु कुल बरामद शाही सेना की राशि दो cecums से लगभग 2-3 μg है. बरामद शाही सेना और बाद qPCR, प्रतिलेखन रूपरेखा, और आरएनए Seq प्रयोगों के लिए पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता की है. आरएनए शुद्धता नियमित 260nm/280nm अनुपात नमूने के 7 को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया है, अभी तक इस पद्धति आरएनए अखंडता के बारे में कोई जानकारी प्रदान करता है. Agilent Bioanalyzer microfluidics आधारित नौकरशाही का आकार घटाने मात्रा का ठहराव और डीएनए, शाही सेना, प्रोटीन और कोशिकाओं की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक मंच है, और एक शाही सेना अखंडता आरएनए वफ़ादारी (RIN) संख्या 8 के रूप में जाना जाता मीट्रिक इस्तेमाल . आरएनए निकाले के साथ इस प्रोटोकॉल 260/280 अनुपात 1.7 से 2.0 और RIN मूल्यों ≥ 7.0 लेकर पैदा. इस प्रोटोकॉल से बरामद बैक्टीरियल शाही सेना के एक Agilent Bioanalyzer विश्लेषण का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है.
चित्रा 1. Agilent Bioanalyzer electropherogram और जेल की तरह Pseudomonas aeruginosa कुल शाही सेना नमूना छवि और अलग murine cecal सामग्री से बरामद. 8.0 RIN.
Discussion
शाही सेना निष्कर्षण विधि यहाँ वर्णित उच्च गुणवत्ता Pseudomonas aeruginosa कुल murine GI पथ से काटा शाही सेना के लिए पर्याप्त मात्रा की वसूली के लिए अनुमति देता है . इस विधि के लिए पी. लिए आरक्षित नहीं है aeruginosa और संभावित अन्य जीवाणुओं के लिए लागू किया जा सकता है . आंत से पर्याप्त माइक्रोबियल जीवों की वसूली में काफी जीव से जीव के लिए अलग अलग होंगे. हमारे murine मॉडल, पी. aeruginosa आमतौर पर 5 10 x 7 से 5 x 10 / 8 cfu जी 4 मल के बीच murine स्तरों पर GI पथ colonizes . चूंकि cecal सामग्री बरामद 0.5 मोटे तौर पर ग्राम, पी. की अनुमानित संख्या दो cecums से बरामद aeruginosa 5 x 10 7 करने के लिए 5 x 8 10 cfu के बीच है . यदि अन्य सूक्ष्मजीवों का उपयोग किया जाता है, यह समझदारी सैनिक उपनिवेशण के स्तर को सत्यापित करने और फिर cfu की लक्षित संख्या ठीक करने की जरूरत cecums की संख्या की गणना होगा. यह भी महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि जब इस विशेष murine मॉडल का उपयोग कर, एंटीबायोटिक इलाज फिलीस्तीनी अथॉरिटी के साथ नहीं संक्रमित चूहों शाही सेना का कोई quantifiable मात्रा उनके cecal सामग्री से अलग है.
हमारे Pseudomonas aeruginosa जठरांत्र उपनिवेशण और प्रसार पी. के रोगजनन का अनुकरण करने का प्रयास की murine मॉडल कैंसर और स्टेम सेल प्रत्यारोपण के रोगियों में bacteremia aeruginosa. इस रोगी जनसंख्या में, खानेवाला वनस्पति अक्सर एंटीबायोटिक या chemotherapeutic (उदाहरण के लिए सैनिक खानेवाला वनस्पति के एंटीबायोटिक रिक्तीकरण) उपचार रोगजनक रोगाणुओं के अतिवृद्धि (जैसे मोनो पी. aeruginosa के साथ संघ) में जिसके परिणामस्वरूप के लिए माध्यमिक समाप्त हो गया है और प्रतिरक्षा दमन के बाद फिर बाद के प्रसार. इस murine मॉडल के फायदे और सीमाएं पहले से ही 4 पहले से संबोधित किया गया है . इस वर्तमान अध्ययन के उद्देश्य से GI पथ से माइक्रोबियल कुल शाही सेना को अलग करने के लिए एक पद्धति प्रदान की है. इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य murine मॉडल है कि GI पथ (यानी खानेवाला वनस्पति बातचीत, सूजन आंत्र रोग, आदि पर बैक्टीरिया प्रभाव) में माइक्रोबियल रोगजनन के अन्य पहलुओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
इस पद्धति का एक लाभ यह फ्रीज / पिघलना, यांत्रिक (/ मोर्टार और मूसल homogenization के साथ pulverizing) विघटन, उबलते, और रासायनिक lysis (जैसे एसडीएस) सहित कई lysis चरणों का समावेश है. Lysis चरणों की भीड़ के बावजूद, कुछ सूक्ष्मजीवों (विशेषकर ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया और कवक खमीर /) अतिरिक्त यांत्रिक विघटन की आवश्यकता हो सकती है. गर्म lysis / एसिड phenol के क्लोरोफॉर्म ऊष्मायन (3.5 चरण), मोती (बैक्टीरिया और खमीर के लिए / या 0.5-0.7 मिमी लिए 0.1 मिमी) के अलावा और बाद में एक कदम मनका पिटाई के बाद इन 9 जीवों lyse करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, 10.
Murine अंधान्त्र, दोहराया ठंड acid-phenol/chloroform extractions (3.7 करने के लिए 3,9 चरण) से बरामद माल की जटिल प्रकृति को देखते हुए बिल्कुल क्रम में स्वीकार्य शाही सेना और आगे डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रियाओं के लिए गुणवत्ता और अखंडता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. 3-5 ठंड acid-phenol/chloroform extractions के बीच जलीय और जैविक चरणों के बीच सफेद अंतरफलक से पहले की आवश्यकता हो सकती है सफाया. अंत में, दोनों DNase (4 चरण) उपचार और RNeasy सफाई प्रोटोकॉल (कदम 5) के संयोजन डीएनए contaminating और छोटे गैर - mRNA (5s और tRNA) को हटाने के लिए आवश्यक हैं. जैसा कि पहले कहा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके बरामद शाही सेना और बाद प्रतिलेखन रूपरेखा 3 qPCR (अप्रकाशित) और आरएनए Seq प्रयोगों (अप्रकाशित) के लिए पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता की है .
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम स्वास्थ्य अनुदान AI62983 के राष्ट्रीय संस्थान (AYK), AI22535 (GPB) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mortar and Pestle | Fisher Scientific | 12-947-1 | |
| Homogenizer | Omni | TM-125 | |
| Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalge Nunc international | 3119-0050 | |
| Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74104 | |
| 3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |
References
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