Summary
单细胞的表达谱可以详细的单个细胞的基因表达分析。我们描述为心肌细胞隔离的方法，并编制要么全转录组微阵列或qPCR的具体目标产生的裂解物。
Abstract
虽然许多研究都从心脏组织匀浆研究基因表达的变化，这样可以防止一个组织内的细胞之间的固有的随机变异研究。纯粹通过胶原酶灌注小鼠心脏心肌人口的分离，有利于全转录基因表达的单细胞微阵列的一代，或使用纳流控阵列的具体目标的qPCR。我们在这里描述一个过程来研究单个细胞基因的表达谱，从心脏分离心肌。这种范式允许利益的指标是不依赖于均值（例如一个组织内的细胞之间的差异），这是不可能的基因表达的评价（图1）当使用传统的整个组织工作流程的评价。我们已经取得了强大的扩增双链cDNA的单细胞转录高产微克，有利于我用的芯片ndividual细胞。在此过程中，我们描述的NimbleGen阵列易于使用和定制其设计能力选择使用。另外，逆转录 - 具体目标扩增反应（RT - STA）的，允许数以百计的纳流控PCR扩增目标的qPCR。使用这些方法之一，它是研究细胞之间的变异性的表达，以及表达谱研究从组织内一个罕见的细胞类型。总体而言，单细胞基因表达的方法可以生成的数据，可以潜在地识别配置文件，通常平均在审查从整个组织产生的典型匀浆数以百万计的细胞表达的特异表达。
Protocol
1。第1步 - 心肌隔离
- 准备消化缓冲如下：
10 ×消化缓冲液（超纯水的H 2 O ）终浓度。 g / L的 g/500 mL的 g / L的10倍的解决方案 氯化钠 130毫米 7.597 3.3 75.97 氯化钾 5毫米 0.4 0.2 4.0 丙酮酸 3纳米 0.33 0.165 3.30 HEPES 25毫米 5.96 2.85 59.6 MgCl 2的 0.5毫米 0.101 0.05 1.01 的NaH 2宝4monobasic 0.33毫米 0.04 0.02 0.40 葡萄糖 22毫米 3.96 1.98 39.6
7.4用NaOH的pH缓冲 - 使用10倍的消化缓冲，使每个将被灌注的心脏（ 在超纯水的H 2 O）以下四种解决方案：
消化缓冲（三本解决方案等分）
- 50毫升 - 1X消化缓冲区，其中包含：
- 75微升 - EGTA溶液（100毫米EGTA）
消化缓冲液B（其中之一）
- 25毫升 - 1X消化缓冲区，其中包含：
- 1.25微升- 氯化钙溶液（1 M）
- 1毫克 - 蛋白酶
- 25毫克 - 胶原酶（CAN还使用75％这一数额= 18.75毫克）**
收集缓冲区（其中之一）
- 2.5毫升 - 1个消化缓冲区，其中包含：
- 1.25微升- 氯化钙溶液（1 M）
- 0.5毫克 - 蛋白酶
- 15毫克 - 胶原酶（75％= 11.25毫克）**
- 125毫克 - 牛血清白蛋白
中和洗涤缓冲液（其中之一 ）
- 25毫升 - 1X消化缓冲区，其中包含：
- 6.25微升- 氯化钙溶液（1 M）
- 250毫克牛血清白蛋白
**胶原酶的来源和一批不同，酶的活性，可能会有所不同 。 它可能是必要的优化添加到这个缓冲区，以防止过 度消化的酶量。
- 如以前在D设立了隔离制度etail三个15毫升烧杯消化缓冲1,2上冰，50毫升的消化缓冲管和25 mL的消化缓冲液B准备灌注（消化缓冲液A应循行冲洗至少5毫升，通过该系统的运行），加热水浴中收集的缓冲区，提高温度至37℃，中和洗涤缓冲液在室温下。
- 填写灌注导管和解剖盘的心脏将被清洗和冷消化缓冲A.绑到灌注尖端松散结周围的上部套管缝合（4 - O 6 - O的大小）。这以后将用来保存滑落套管，以防止心脏的主动脉。
- 末期稳重的小鼠腹腔注射麻醉剂（0.25毫升戊巴比妥钠溶液），并确保鼠标是无意识的，对疼痛刺激的反应迟钝。剖开胸腔，沿胸保证金仔细切割膜片（图2）。切优向上反映前肋骨（这些切口被指定为B和A，分别在图2） 的关键-鼠标仍然必须呼吸之前，这些切口。
- 用塑料吸管切成一定尺寸，轻轻地吸进吸管的心脏。切开心脏的胸腔小心离开心脏的主动脉，足以认清主动脉分支（图3）。移液器使用，因为它会导致损害最小的心脏。
- 掉落到一个烧杯冰冷的消化缓冲液A的心脏和血液，冲洗。 15 - 45秒的地方，到第二个烧杯冰冷的消化缓冲的心脏后，一个简单地再次冲洗。在心脏转移到培养皿中也充满冷消化缓冲A.
- 盘消化缓冲下一个剥离范围的心脏和仔细分离主动脉及其分支。仔细修剪劣势到最后brancH（图4）。
- 适合进入主动脉导管尖端和6 - O使用阶段设置下解剖镜下缝合结扎与4 - O到位。确保套管不坐太低的主动脉内，仍以上的冠状动脉（图4）。
- 消化缓冲液A通过灌注设置流动，设置放置灌注头，并开始灌注心脏，直到大部分血液从心脏是明确的心脏和离开流体洗净。关键 - 灌注液的温度必须尽可能接近至37 ° C，当它出来的导管。如果解决方案是太热或太冷，然后灌注杀死组织。直到灌注在心脏的时间也很关键。时间窗口必须从清除心脏少于5-10分钟开始，直到灌注。心脏必须拆除在麻醉下，没有CO 2附加或颈椎脱位。
- 一旦血液是从心脏HED，消化缓冲A.切换到消化缓冲液B确保消化缓冲液B现在是通过流经心脏。该解决方案将开始有一个黄色的色调。等待2-3分钟，直到心脏有迹象显示失去它的形状，开始显得圆润，这是一个迹象表明，消化工作。心肌灌注收益应该出现轻。
- 心室成50 ml锥形管含15毫升收集缓冲区，用剪刀和地点，在37 ° C。轻轻切成小块心室同时放入收藏缓冲区组织。轻轻混匀，用塑料吸管解散细胞与细胞间的粘连和一个单细胞的心肌细胞混合。
- 当大多数组织的解散，（不到1分钟），让较大的组织块沉底。删除和保存上清15 mL锥形管。让我们从上清引力球团超过10至20分钟（15分钟的首选）在室温下。
- 取下并丢弃上清液。加入5毫升中和洗涤缓冲颗粒，轻轻混匀细胞重悬于他们清洗沉淀。此时细胞会立即准备为单细胞分析（继续执行步骤2）选择。
2。第2步 - 单核细胞的分离
- 准备一个使用火焰和玻璃毛细管将用于操纵细胞的显微。显微操作是简单的很细的毛细管，然后附加到一个长的软管可以移动或拿起吸力时的细胞。
- 立即着手选择的单个细胞在显微镜下使用一把拉住吸管和气密舱，以防止材料被转移到单细胞样本样本创建显微（尼康Eclipse的TS100，20X）。确保是健康的细胞群（70％可行的），而不是从隔离过程中损坏。
- 稀释一个小培养皿中的细胞，使他们可以单独选择。采摘细胞时，一定要捕获的细胞体积小（小于2μL）。只选择健康的细胞，具有独特的正常心肌细胞形态（图5）。
- 单个细胞放入单个PCR管底部，并立即冻结干冰。这些细胞，然后保存于-80℃直至他们将被用于基因表达分析。
3。步骤3A - 单细胞的qPCR基因表达
要执行单细胞的qPCR采用从单细胞基因表达他们的Biomark纳流控的qPCR阵列Fluidigm公司开发适应协议（Fluidigm公司-促进发展协议＃30）3,4 。
- 反转录 - 特定目标扩增（RT - STA）的准备。要杜松子酒，悬浮感兴趣的所有基因的引物对（我们已经使用了125对引物，成功）在100微米（10毫米三，pH值8.0，0.1毫米EDTA）1X DNA悬浮缓冲。合并和进一步淡化正向和反向引物对每个检测20微米。最后，一个终浓度为200 nm为每个将在RT - STA反应扩增检测引物对稀释成一个解决方案。要做到这一点，每对引物，并稀释他们1:100。例如，如果你有30对引物检测20微米，你将需要添加1μL每对（30μL总），然后进行70μLDNA悬浮缓冲量的其余部分进入决赛稀释体积为100μL。
- 现在，底漆解决方案准备，组装的RT - STA反应预混。准备足够的掌握每一个你想放大的单个细胞混合。
表1 RT - STA预混试剂 μL，卷（每反应） CellsDirect 2X反应混合 5.0 标III RT Plantinum的Taq混合 0.2 RT - STA底漆的组合（200 nm的每个检测） 2.5 核酸游离H 2 O（或1X DNA的悬浮缓冲液） 1.3 共有 9.0 - 立即除去最大相对离心力冷冻细胞和离心30秒，以确保细胞在试管底部定位。加入9μLRT - STA的混合管进行热循环的反应。
- 50℃ - 15分钟
- 95℃ - 2分钟
- 18个周期的
- 95℃15秒
- 60℃，4分钟
- 保持在4 ° C
- 从PCR机器管，加4μLExoSAP - IT的反应。 ExoSAP - 它是一个PCR清理RT - STA的反应，将删除多余的引物和酶试剂。通过下列反应在PCR机器的运行管。
- 37℃ - 15分钟
- 80℃ - 15分钟
- 保持在4 ° C
- 当ExoSAP治疗是完整的;稀释样品与DNA悬挂缓冲1:5。现在准备的qPCR分析样品。 Fluidigm的基因表达的qPCR阵列（48.48，或96.96板）一起，我们使用这种材料。它也可以使用这种方法与传统的qPCR仪器仪表（96孔或384孔的格式）。然而，这些仪器通常需要更多的样本输入检测的数量限制，可以是Performed从一个单细胞。
3。步骤3B - 全转录扩增单细胞和基因芯片
提取和扩增
- 使用Sigma的WTA2套件（CAT＃WTA2）扩增双链颗粒和单核细胞的cDNA。单细胞通过第一步Sigma的WTA2协议，根据制造商的指示“提取”。在这第一步库合成缓冲区的潜伏期在37 ° C 5分钟，扰乱了单细胞的细胞膜和“提取”消息进行放大。
- 单细胞扩增两轮，Sigma - Aldrich的WTA2套件的使用方向。执行的库准备步骤，根据制造商的协议，然后再添加库样本的1 / 5到70μLWTA2放大
混合液。放大使用建议的循环参数为25个周期的样本。 - 净化样品USI吴Qiagen公司的QIAquick PCR纯化试剂盒（CAT＃28104）和Qiagen公司的Qiacube进程，使用“清理QIAquick PCR扩增反应标准V4”协议。
- 至5μL浓缩纯化的样品，使用高速真空，并提出通过第二轮的扩增为17个周期（WTA2的扩增，循环参数反复）。
- Purify的使用QIAquick PCR纯化试剂盒的样品和质量检查，使用NanoDrop分光光度计，安捷伦的生物分析DNA 7500试剂盒，根据制造商的协议。
标签和NimbleGen的基因表达阵列
- 标签2微克双滞留的cDNA每个扩增的细胞样品使用NimbleGen的一种颜色标记试剂盒（CAT＃05223555001）根据制造商的协议。
- 5微克Cy3标记标记样品杂交12x135k， 小家鼠的NimbleGen基因表达阵列（CAT＃05543797001）ACC奥尔丁制造商的协议。阵列的样品杂交后，幻灯片，然后洗净，干燥，才可以在激光扫描仪成像。
- 使用激光扫描仪扫描的基因表达阵列。在这里，我们使用分子器件100POW设置GenePix 4200A扫描仪，和300 350PMT。然后生成每个阵列使用NimbleGen的NimbleScan软件对文件和随后全转录表达分析每个单细胞阵列（一个典型的稳定表达的心肌成绩单的表是作为补充;表S1）。
如果心脏灌注行之有效应该有一个健康的心脏细胞，保留其典型的矩形形态后隔离的高比例。如果没有进行很好的灌注，然后将有一个大的死细胞百分比（在图5中看到的图像）。如果正确使用WTA2或RT - STA方法的扩增细胞n的高端产品应通过随后的质量控制测试NanoDrop和BioAnalyser（图6）的mRNA样品的质量。对于芯片的工作流程，这是完成后，WTA的扩增的mRNA NanoDrop和生物分析仪测试。为这一分析的代表积极结果如图6所示。 WTA2样品应显示NanoDrop分光光度计读数，以及从生物分析仪（BA）的芯片（图6）电泳读出一个强大的放大。一个稳定，通过单细胞的基因芯片检测的基因表为例（表S1）。对于qPCR的过程中，数据的质量进行评估执行一个在PCR反应，以确保引物扩增所需的产品（图7）年底熔体一步。如果正确的话，这融化的步骤应该产生一个特定的熔融峰。为了说明这一点，纳流控的qPCR数据的一个子集显示在峰值融化吨热图emperature（图8）8。它是可能的，以评估其熔融温度的PCR产物的质量，以确保对非特定产品 5的情况下。这张地图上的每一行代表一个细胞样本（S1 - S40）在43个独立的qPCR实验（A1 - A43号）测试。在这个数字中，很明显，一些分析变化很大，很可能低于PCR的特异性更高更稳定的检测可靠。
图1单细胞的分离和基因表达分析的概述。该程序将展示的鼠标心脏手术切除和单个心肌细胞的隔离。在此过程中所讨论的方法包括：要么全转录扩增（WTA）后的qPCR或微阵列分析的方法。 WTA的过程开始然后Sigma的通用引物结合（二）的mRNA裂解（一）池。扩增的材料，这些引物（C）和扩增（四）阶段的扩展创建微克。然后重复这种放大（五）芯片过程中产生足够的材料。
图2：删除从小鼠的心脏切口位置的代表性。切沿左肋侧壁（一），然后沿左肋下缘（二）削减。切割的上方和下方的心脏血管，允许移除主动脉，同时还留下足够cannulate的心脏。库克6兆焦耳适应的图片。
图3图的胸部鼠标。虚线表示切除的心脏从胸腔切口的位置（一）没有损坏的H eart组织。库克6兆焦耳适应的图片。
图4。主动脉弓及其分支的图像。灰线表示的理想的位置在哪里修剪主动脉（一）。其余的心脏主动脉连接空心套管（二）提示，使主动脉内的适当水平（三）。 F.盖拉德7改编而成的图像。
图5。单个细胞的基因表达分析的选择。每个面板显示在灯光下呈现出典型的心肌细胞形态显微镜成像心肌。健康的心肌细胞是由绿色箭头表示。死亡或濒临死亡的细胞，这些细胞是用红色箭头所示。这些死细胞不应该在分析中使用。
iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg“ALT =”图6“/>
图6。质量控制WTA的单细胞扩增的结果。 （a）图像的一个NanoDrop分光光度计读数，是适合于从WTA反应扩增成绩单。 （二）从生物分析仪芯片的读数显示从三个细胞扩增的结果。
图7。定量PCR扩增曲线（左图）和峰值熔融温度曲线（右图）。 （一）从质量检测中的表达结果显示，尽管不同的扩增曲线与一个单一的熔融峰。 （二）一个贫穷的引物，有高度可变的熔融峰，这是不理想的表达分析熔融曲线。
图8。质量控制的单细胞定量PCR反应结果离子。此热图的建立是为了显示一种颜色规模的熔融温度。每个定量PCR检测峰的熔融温度（A1 - A43号）40（S1 - 40）的单个细胞。集群分析根据其熔融温度。俯视列每个检测有可能看到的变化融化所有的样品。这个数字表明，一些qPCR实验是非常具体的，而有些则是充满变数，因此不适合单细胞分析。
表S1，这些基因微阵列数据的补充表 。列出根据它们在大型数据集的单一心肌细胞检测的鲁棒性。这个基因列表表示通常在单一心肌细胞中表达的基因数目的检测灵敏度。
Discussion
这种方法有可能产生的功能以及基因表达研究心肌。检查单细胞基因表达分析中的一个新兴领域。研究在单细胞水平的转录水平的优势在于，它允许一个纯粹的细胞群，这是没有可能从整个组织的筹备工作检查。此外，单细胞分析允许为单个细胞中的mRNA水平的随机变异的检查，以定义单元，以前被认为是同质8,9人口。除了 确定的基因有可能在他们的基因表达10,11,12随机，该方法还允许为特定人群的罕见细胞基因表达谱鉴定。
虽然这种方法提供了一个令人兴奋的潜在用途，基因表达分析，有SOM发送警告和注意事项，使用单细胞。单细胞分析的主要限制因素，是在实验中收集足够的细胞，例如方差，实现利益的度量方面的统计意义。在地方利益的组织细胞的数目是不是限制的情况下，可以检查数百个细胞每组，使用方法，如新一代测序，或纳流控阵列。然而，在某些情况下，有可能难以取得足够的细胞从组织利益。这可以部分特质针对性的细胞类型的集合时间密集型程序引起的。然而，精心的策划和单细胞采集出发前准备，可能仍然允许进行严格的单细胞分析与有限的技术性错误。当研究必须考虑的结果，即使隔离细胞的程序已经在众多studie使用S（包括显微镜，电等），隔离本身可能会影响基因的表达。至于用任何方法操纵生物样品，你的调查结果结果应仔细验证，以确保单个细胞中的表达是代表组织本身，而不是技术偏见。如原位杂交的方法可以证明是有用的的，完整的组织，以验证这些结果。最后，关键是要确保生成的数据是经过精心的质量控制检查。如图8所示的数据表明，qPCR实验可能会非常强劲，其特殊性，如法＃13（A13），或有高层次的变化，从而导致检测＃34（A34）的技术，如方差。
Acknowledgments
作者要感谢在本议定书的拍摄技术援助C. Zambataro。我们非常感谢为弥敦道冲击中心奖葛兰基金会的医学研究（SM），希尔布鲁姆的基础，和国立卫生研究院（P30AG025708）和PO1AG025901支持。 JMF的支持T32AG000266关于老龄问题的巴克研究所的研究授予。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71378 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P4562 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1020 | |
| NaH2PO4 monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G6721 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | O3777 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Protease, Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase, Type I | Worthington Biochemical | C9891 | |
| 1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | TEKnova, Inc. | PN T0221 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B8667 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | Contact supplier for ordering | *must be procured through a Veterinarian or lab animal professional |
| ExoSAP IT | Affymetrix | 78201 | |
| CellsDirect 2x Rxn Mix | Invitrogen | 11737-030 | |
| SuperScript III RT Platinum Taq Mix | Invitrogen | 10928-042 | |
| RT-STA Primer Mix | IDT | Custom | |
| Nuclease Free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| WTA2 | Sigma-Aldrich | WTA2-50rxn | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | 2000c | |
| BioAnalyzer DNA 7500 kit | Agilent Technologies | 7500 kit | |
| One Color Labeling kit | Roche Group | 5223555001 | |
| Mus Musculus 12x135k array | Roche Group | 5543797001 | |
| GenePix 4200A Scanner | Molecular Devices | 4200A | |
| TransPlex Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) | Sigma-Aldrich | WTA2-50RXN |
References
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