Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Single Cell transkriptionel Profilering af Voksen Mouse cardiomyocytter

Published: December 28, 2011 doi: 10.3791/3302
Automatic Translation
1, 2, 1
1Buck Institute for Research on Aging, 2Department of Physiology & Biophysics, University of Washington

Summary

Enkelt celle udtryk profilering giver den detaljerede genekspression analyse af de enkelte celler. Vi beskriver metoder til isolering af cardiomyocytter, og forberede den resulterende lysates for enten hele transkriptom microarray eller qPCR af specifikke mål.

Abstract

Mens en lang række studier har undersøgt genekspression skifter fra homogenater af hjerte væv, dette forhindrer at studere den iboende stokastiske variation mellem celler i et væv. Isolering af rene cardiomyocyte befolkninger gennem en collagenase perfusion af mus hjerter letter generation af enkelt celle microarrays for hele transkriptom genekspression, eller qPCR af specifikke mål ved hjælp af nanofluidic arrays. Vi beskriver her en procedure for at undersøge enkelt celle genekspression profiler af cardiomyocytter isoleret fra hjertet. Dette paradigme giver mulighed for evaluering af målinger af interesse, som ikke er afhængig af den gennemsnitlige (for eksempel variansen mellem celler i et væv), hvilket ikke er muligt ved brug af konventionelle hele væv arbejdsgange til evaluering af genekspression (Figur 1). Vi har opnået solid forstærkning af enkelt celle transkriptomet giver mikrogram dobbelt strandede cDNA, der letter brugen af ​​microarrays om jegndividual celler. I den procedure, vi beskrive brugen af ​​NimbleGen arrays, som blev udvalgt for deres brugervenlighed og evne til at tilpasse deres design. Alternativt kan en reverse transkriptase - specifikke mål forstærkning (RT-STA) reaktion, giver mulighed for qPCR af hundredvis af mål nanofluidic PCR. Ved hjælp af en af ​​disse metoder, er det muligt at undersøge variation i udtryk mellem celler, samt undersøge udtryk profiler af sjældne celletyper inde fra en væv. Samlet set enkelt celle genekspression tilgang giver mulighed for generering af data, der potentielt kan identificere idiosynkratiske udtryk profiler, der er typisk i gennemsnit, når undersøgelsen udtryk for millioner af celler fra typiske homogenater genereret fra hele væv.

Protocol

1. Trin 1 - Cardiomyocyte isolation

  1. Forbered fordøjelsen buffer som følger:
    10 x Fordøjelsen Buffer (lavet i ultra-ren H 2 O)
    Afsluttende Konc. g / L g/500 mL 10x løsning g / L
    NaCl 130 mm 7,597 3,3 75,97
    KCl 5 mM 0,4 0,2 4,0
    Pyrodruesyre 3 Nm 0,33 0,165 3,30
    HEPES 25 mM 5,96 2,85 59,6
    MgCl 2 0,5 mm 0,101 0,05 1,01
    NaH 2PO 4monobasic 0,33 mM 0,04 0,02 0,40
    Dextrose 22 mm 3,96 1,98 39,6

    pH-buffer til 7,4 med NaOH
  2. Brug af 10x Fordøjelse Buffer, at følgende fire løsninger til hvert hjerte, der vil blive perfunderet (lavet i ultra-ren H 2 O):

Fordøjelsen Buffer A (lave tre portioner af denne løsninger)

  • 50 ml - 1x Fordøjelsen buffer indeholdende:
    • 75 μL - EGTA løsning (100 mM EGTA)

Fordøjelsen Buffer B (Lav en af disse)

  • 25 ml - 1x Fordøjelsen buffer indeholdende:
    • 1,25 μL - CaCl 2-opløsning (1 M)
    • 1 mg - Protease
    • 25 mg - Collagenase (can også bruge 75% af dette beløb = 18,75 mg) **

Indsamling Buffer (Lav en af disse)

  • 2,5 ml - 1x Fordøjelsen buffer indeholdende:
    • 1,25 μL - CaCl 2-opløsning (1 M)
    • 0,5 mg - Protease
    • 15 mg - Collagenase (75% = 11,25 mg) **
    • 125 mg - BSA

Neutralisering Wash Buffer (Lav en af disse)

  • 25 ml - 1x Fordøjelsen buffer indeholdende:
    • 6,25 μL - CaCl 2-opløsning (1 M)
    • 250 mg BSA

** Afhængigt af kilden og parti collagenase, kan enzymaktiviteten varierer. Det kan være nødvendigt at optimere mængden af enzym føjes til denne buffer for at undgå over-fordøjelse.

  1. Opsæt isolation systemet som tidligere beskrevet i detail 1,2 med tre 15 mL bægerglas af Fordøjelsen Buffer A på isen, en 50 ml tube Digestion Buffer A og de ​​25 mL Digestion Buffer B klar til perfusion (destruktion Buffer A skal skylles igennem på linjen, på minimum 5 ml løber gennem systemet), Collection Buffer opvarmes i et vandbad for at hæve temperaturen til 37 ° C, og neutraliseringen vaskebuffer ved RT.
  2. Fyld perfusion kanylen og dissektion fad, hvor hjerte vil blive rengjort og bundet på perfusion spidsen med koldt Fordøjelsen Buffer A. løst knuden nogle sutur (4-O til 6-O størrelse) omkring den øverste del af kanylen. Dette vil senere blive brugt til at holde aorta at forhindre hjertet glider væk fra kanylen.
  3. Uhelbredeligt adstadig musen med en IP-injektion af bedøvelsesmiddel agent (0,25 ml natriumchlorid pentobarbital løsning) og sikre, at musen er bevidstløs og ikke reagerer på smerte stimuli. Skær åbne brysthulen forsigtigt langs bryst-margin ved at skære i mellemgulvet(Figur 2). Skær overlegent opad og afspejler den forreste brystkassen (disse snit er udpeget til B og A, henholdsvis i figur 2) Kritisk -. Musen skal stadig være at trække vejret forud for disse indsnit.
  4. Ved hjælp af en plastic pipette tilskåret, suge forsigtigt hjertet ind i pipetten. Skær hjertet ud af brysthulen være omhyggelig med at efterlade nok af aorta på hjertet til klart at identificere de aorta gren (Figur 3). En pipette bruges, da det forårsager minimale skader på hjertet.
  5. Drop hjertet i et bægerglas af iskold Digestion Buffer A og skylle blodet væk. Efter 15 til 45 sek sted midt i det andet bægerglas af iskold Fordøjelsen Buffer A til kort skylles igen. Overfør hjertet i petriskålen også fyldt med kold Fordøjelse Buffer A.
  6. Se hjertet i fadet af fordøjelsen Buffer A under dissektion omfanget og omhyggeligt isolere aorta og dens grene. Omhyggeligt trim bare ringere end den sidste branch (Figur 4).
  7. Montér kanylen spidsen ind i aorta og ligate på plads med 4-O til 6-O sutur hjælp scenen setup under en dissektion mikroskop. Sørg for, at kanylen ikke sidder for lavt i aorta og fortsat over kranspulsårerne (Figur 4).
  8. Med fordøjelsen Buffer En flyder gennem perfusionen opsætningen, skal du placere perfusion tip videre til opsætningen, og begynder at perfuse hjertet, indtil størstedelen af ​​blodet er vasket fra hjertet og væske forlader hjertet er klar. Kritisk - temperaturen på perfusionsvæske skal være så tæt som muligt på 37 ° C, når det kommer ud af kateteret. Hvis opløsningen er for varmt eller for koldt så perfusionen vil dræbe vævet. Tiden indtil perfusion af hjertet er også kritiske. Tiden Vinduet skal være mindre end 5-10 min fra fjernelse af hjerte indtil perfusion begynder. Hjertet skal fjernes under bedøvelse, ikke CO 2 paasaettelse eller dislokation af halsen.
  9. Når blodet er blevetHED fra hjertet, skifte til fordøjelsen Buffer B fra fordøjelsen Buffer A. Sørg for, at fordøjelsen Buffer B nu flyder gennem hjertet. Løsningen vil begynde at have en gul tone. Vent 2-3 minutter, indtil hjertet viser tegn på at miste sin form og begynder at se rundet hvilket er et tegn på, at fordøjelsen fungerer. Myokardiet skal vises lysere som perfusion provenuet.
  10. Skær hjertekamrene ud med en saks og anbringes i en 50 ml koniske rør, der indeholder 15 ml Collection Buffer ved 37 ° C. Forsigtigt skæres ventriklen i små stykker, mens placere vævet ind i Collection Buffer. Bland forsigtigt med en plastic pipette til at opløse den celle-celle sammenvoksninger og gøre en enkelt celle cardiomyocyte blanding.
  11. Når de fleste af vævet er opløst, (mindre end 1 min) Lad de større væv stykker synke til bunds. Fjern og gem supernatanten til en 15 ml konisk rør. Lad tyngdekraften trække en pellet fra supernatanten over 10 til 20 min (15min foretrukne) ved stuetemperatur.
  12. Fjern og kassér supernatanten. Vask pellet ved at tilsætte 5 ml af Neutralisering vaskebuffer til pellet og forsigtigt blande celler til at resuspendere dem. På dette tidspunkt celler er umiddelbart klar til at blive udvalgt til enkelt celle analyse (fortsæt til trin 2).

2. Trin 2 - isolering af enkelte celler

  1. Forbered en mikromanipulator ved hjælp af en flamme og et glas kapillarrør som vil blive brugt til at manipulere cellerne. Den mikromanipulator er simpelthen en meget fin kapillarrør som derefter fastgjort til et langt stykke af fleksible rør, som kan flytte eller afhente celler, når sug anvendes.
  2. Straks over til valg af de enkelte celler under et mikroskop (Nikon Eclipse TS100, 20x) ved hjælp af en mikromanipulator som blev oprettet med en trukket pipette og en luftsluse for at forhindre, at materiale fra at blive overført til det indre celleprøver prøve. Sørg for, at cellepopulation er sundt(70% levedygtige) og ikke er beskadiget fra isolation processen.
  3. Fortynd cellerne ned i en lille petriskål, så de kan vælges individuelt. Når de skal vælge celler skal du sørge for at indfange celler i et lille volumen (mindre end 2 μL). Vælg kun sunde celler, der har den særprægede normale cardiomyocyte morfologi (Figur 5).
  4. Placer de enkelte celler i bunden af ​​individuelle PCR rør og fryse dem straks på tøris. Disse celler bliver derefter opbevaret ved -80 ° C, indtil de skal bruges til genekspression analyse.

3. Trin 3A - enkelt celle qPCR genekspression

For at udføre qPCR på enkelte celler ansætte en protokol, der er tilpasset fra et udviklet til enkelt celle genekspression ved Fluidigm Corporation for deres Biomark Nanofluidic qPCR arrays (Fluidigm - Advance Udvikling protokollen # 30) 3,4.

  1. Forberedelse af reverse transcription - specifikt mål Amplification (RT-STA). At væregin, resuspender alle primerpar (vi har brugt op til 125 primerpar held) for gener af interesse på 100 ìm i 1x DNA suspension buffer (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA). Kombiner og yderligere udvande frem og bak primerpar til 20 μM for hver analyse. Endelig, fortyndes alle primerpar i én løsning med en endelig koncentration på 200 nm for hver analyse, som vil blive forstærket i RT-STA reaktion. For at gøre dette, tager hver primerpar og fortyndes dem 1:100. For eksempel, hvis du har 30 assay primerpar ved 20 μM bliver du nødt til at tilføje 1 ml af hvert par (30 μL i alt), og derefter foretage den resterende del af volumen med 70 μL af DNA suspension buffer at nå den endelige fortyndingsvolumen på 100 μL.
  2. Nu, hvor primer løsninger er forberedt, samle RT-STA reaktion mester mix. Forbered nok Master Mix for hver af de enkelte celler, du ønsker at forstærke.
    Reagens Volumen i μL (per reaktion)
    CellsDirect 2x reaktionsblanding 5,0
    Hævet III RT Plantinum Taq mix 0,2
    RT-STA primermix (200 nM hver analyse) 2,5
    Nuklease Gratis H 2 O (eller 1x DNA suspension buffer) 1,3
    Samlet 9,0
    Tabel 1. RT-STA Master Mix
  3. Fjern straks frosne celler og centrifuger ved maksimal RCF i 30 sekunder for at sikre, at cellerne er placeret i bunden af ​​røret. Tilføje 9 μL af RT-STA mix til røret og videre til reaktion i en thermocycler.
    1. 50 ° C - 15 minutter
    2. 95 ° C - 2 minutter
    3. 18 cykler på
      1. 95 ° C i 15 sekunder
      2. 60° C i 4 minutter
    4. Hold ved 4 ° C
  4. Tag rør fra PCR-maskinen og tilsæt 4 μL af ExoSAP-IT til reaktionen. ExoSAP-IT er en PCR oprydning reagens, der vil fjerne overskydende primere og enzym fra RT-STA reaktion. Kør rørene gennem følgende reaktion i en PCR-maskine.
    1. 37 ° C - 15 minutter
    2. 80 ° C - 15 minutter
    3. Hold ved 4 ° C
  5. Når ExoSAP-IT behandlingen er afsluttet, fortynde prøver 1:05 med DNA suspension buffer. Prøverne er nu klar til qPCR analyse. Vi bruger dette materiale i forbindelse med Fluidigm Genekspression qPCR Arrays (48,48 eller 96,96 plader). Det er også muligt at bruge denne fremgangsmåde med mere traditionelle qPCR instrumentering (96 godt eller 384 vel-formater). Men disse instrumenter kræver typisk meget mere stikprøve input, der begrænser antallet af analyser, der kan performed fra en enkelt celle.

3. Trin 3B - Hele transkriptom forstærkning og microarray af enkelte celler

Udvinding og Forstærkning

  1. Brug Sigma WTA2 kit (Cat # WTA2) til at forstærke dobbelt strandede cDNA fra både piller og enkelte celler. Enkelt celler er "udvundet" via det første skridt i Sigma WTA2 protokol i henhold til producentens anvisninger. I løbet af dette første skridt til inkubation med bibliotek syntese buffer ved 37 ° C i 5 minutter forstyrrer membran af det indre celler og "uddrag" meddelelsen for forstærkning.
  2. Forstærk enkelte celler i to runder, ved hjælp af instruktioner fra den Sigma-Aldrich er WTA2 kit. Udfør biblioteket prep skridt i henhold til producentens protokollen, hvorefter der tilsættes 1 / 5 af bibliotekets prøven til 70 μL af WTA2 forstærkning
    Master Mix. Forstærk prøverne i 25 cykler ved hjælp af de anbefalede cykling parametre.
  3. Rense prøver USIng Qiagen er QIAquick PCR Purification Kit (Cat # 28104) og proces på Qiagen er Qiacube bruge "Oprydning QIAquick PCR-amplifikation Reaktioner Standard V4" protokol.
  4. Koncentrer den oprensede prøver til 5 mikroliter, med en hastighed vakuum, og satte gennem en anden runde af forstærkning for 17 perioder (WTA2 forstærkning protokol og cykling parametre gentages).
  5. Rense prøver med det QIAquick PCR Purification Kit og tjekke kvaliteten ved hjælp af en NanoDrop spektrofotometer og Agilents BioAnalyzer DNA-7500 kit ifølge producenternes protokol.

Mærkning og NimbleGen Gene Expression Arrays

  1. Etiket 2 mikrogram dobbelt strandede cDNA fra hver forstærket celle prøve ved hjælp NimbleGen One farvemærkning Kit (Cat # 05223555001) i henhold til fabrikantens protokollen.
  2. Hybridisere 5 mikrog af Cy3 mærket prøve til Mus musculus 12x135k, NimbleGen Gene Expression Arrays (Cat # 05543797001) accOrding til producentens protokol. Efter hybridisering af prøver til arrays, burde de dias, derefter vaskes og tørres, før de kan afbildes på en laserscanner.
  3. Scan Gene Expression arrays ved hjælp af en laserscanner. Her bruger vi en Molecular Devices GenePix 4200A Scanner med indstillinger af 100POW, og 300-350PMT. Derefter genererer par filer for hver matrix hjælp NimbleGen er NimbleScan software og efterfølgende analysere for hele transkriptom udtryk fra hver enkelt celle array (en tabel over typiske stabilt udtrykt cardiomyocyte udskrifter indgår som et supplement, tabel S1).

Hvis hjertet perfusionen fungeret godt der bør være en høj procentdel af sundt hjerte celler, der bevarer deres typiske rektangulære morfologi ved isolation. Hvis perfusionen ikke gik godt så vil der være en stor procentdel af døde celler (se billeder i figur 5). Hvis cellerne korrekt forstærkes ved hjælp af enten WTA2 eller RT-STA metoder tiln slutprodukterne skal passere den efterfølgende kvalitetskontrol test for kvaliteten af ​​mRNA prøver ved NanoDrop og BioAnalyser (figur 6). For microarray workflow, er dette afsluttet efter WTA-forstærkning, hvor mRNA er testet af både NanoDrop og Bioanalyzer. Repræsentant positive resultater for denne analyse er vist i figur 6. Den WTA2 Prøverne skal vise en robust forstærkning med både NanoDrop spektrofotometeret læsning, samt electropherogram udlæsningen fra Bioanalyzer (BA) chip (Figur 6). En tabel af gener, der var stabilt opdaget via microarray af enkelte celler er medtaget som et eksempel (tabel S1). For qPCR processen, kan kvaliteten af ​​de data, der skal vurderes ved at udføre en smelte skridt i slutningen af ​​PCR-reaktionen at sikre, at primer sæt er at forstærke den ønskede vare (Figur 7). Hvis det er korrekt, bør dette smelte trin generere én specifik smelte højdepunkt. For at illustrere dette punkt, er en delmængde af nanofluidic qPCR data vist i et Heatmap af top smelte temperatur (Figur 8) 8. Det er muligt at vurdere kvaliteten af et PCR-produkt ved dets smelte temperatur for at sikre fravær af non-specifikke produkter 5. Hver række i dette kort repræsenterer en celle prøve (S1-S40) testet i 43 separate qPCR assays (A1-A43). I dette tal, er det klart, at nogle analyser er ganske variabel og er sandsynligvis mindre pålidelige end de mere stabile assays med højere PCR specificitet.

Figur 1
Figur 1. Oversigt over de enkelt celle isolation og genekspression analyse. Proceduren vil demonstrere kirurgisk fjernelse af musen hjertet og isolering af enkelte cardiomyocytter. De metoder, der diskuteres i denne procedure omfatter metoder til enten qPCR eller microarray analyse efter hele transkriptom forstærkning (WTA). WTA Proceduren begynder med lysering (A), så binding af Sigma er universelle primere (B) til mRNApool. Udvidelsen af ​​disse primere (C) og forstærkning (D) fase skabe mikrogram forstærket materiale. Denne forstærkning er derefter gentages (E) til at generere nok materiale til microarray procedure.

Figur 2
Figur 2. Repræsentationen af placeringen af snit til at fjerne hjertet fra musen. Klip langs den laterale væg af brystkassen (A), derefter klippe langs den ringere margen af ​​brystkassen (B). Beskæring af skibe over og under hjertet mulighed for at fjerne, mens du stadig efterlader nok af aorta til cannulate hjertet. Billeder tilpasset fra MJ Cook-6.

Figur 3
Figur 3. Diagram af brystkassen på musen. De stiplede linjer angiver placeringen af ​​snit (A) for udtagelse af hjertet fra brysthulen uden at beskadige h AETR væv. Billeder tilpasset fra MJ Cook-6.

Figur 4
Figur 4. Billede af aortabuen og dens grene. Den grå linje angiver det ideelle sted, hvor at trimme aorta (A). De resterende aorta knyttet til hjertet er kanylerede således, at spidsen af ​​kanylen (B) går til et passende niveau i aorta (C). Billeder tilpasset fra F. Gaillard 7.

Figur 5
Figur 5. Udvælgelse af enkelte celler til genekspression analyse. Hvert panel viser cardiomyocytter afbildet under lysmikroskop viser typiske morfologi cardiomyocytter. Sund cardiomyocytter er markeret med grønne pile. Celler, der er døde eller døende, er vist med røde pile. Disse døde celler bør ikke anvendes i analysen.

iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg "alt =" Figur 6 "/>
Figur 6. Kvalitetskontrol WTA resultater for enkelt celle forstærkning. (A) Billede af en NanoDrop spektrofotometer udlæsning, der er passende for den forstærkede udskrifter fra WTA reaktion. (B) Udlæsningen fra BioAnalyzer chip viser resultaterne fra tre forstærkes celler.

Figur 7
Figur 7. QPCR forstærkning kurver (venstre figur) og peak smelte temperatur kurver (højre figur). (A) Udtrykket resultater fra et kvalitets-analysen er vist med en enkelt smelte højdepunkt på trods af forskellige forstærkning kurver. (B) Smelt kurver til en fattig primer sæt, som har meget varierende smelte toppe, som ikke er ideel til udtryk analyse.

Figur 8
Figur 8. Kvalitetskontrol resultater for enkelt celle qPCR reagereioner. Denne varme kort blev oprettet for at vise smelte temperaturer som en farveskala. Den maksimale smeltetemperatur for hver qPCR assay (A1-A43) er vist for 40 individuelle celler (S1-40). Analyserne var samlet efter deres smelte temperatur. Ved at kigge ned i kolonnen for hver analyse er det muligt at se variationen smelte på tværs af alle prøverne. Dette tal viser, at nogle qPCR analyser er meget specifikke, mens andre er meget varierende, og de er derfor ikke egnet til enkelt celle analyse.

Tabel S1. Supplemental tabel med microarray data. Disse gener er opført efter den robusthed, hvor de er fundet i en enkelt cardiomyocytter over et stort datasæt. Dette gen liste viser følsomheden af ​​påvisning af en række gener, der typisk udtrykkes i en enkelt cardiomyocytter.

Discussion

Denne metode har mulighed for at generere cardiomyocytter for en række funktionelle og genekspression studier. Undersøgelsen af ​​enkelte celler er et spirende område i genekspression analyse. Fordelen ved at undersøge transkriptionel niveauer på samme niveau som den enkelt celle er, at det giver mulighed for undersøgelse af en ren cellepopulation, hvilket ikke er muligt fra hele vævspræparater. Derudover enkelt celle analyse giver mulighed for undersøgelse af stokastiske variation af mRNA niveauer i enkelte celler til at definere cellepopulationer, der tidligere blev anset for at være homogent 8,9. Ud over at identificere gener, som er potentielt stokastiske i deres genekspression 10,11,12, også den metode, der giver mulighed for identifikation af sjældne cellepopulationer defineret ved deres genekspression profiler.

Selv om denne fremgangsmåde giver en række spændende potentielle anvendelser i genekspression analyse, der er whoe forbehold og overvejelser i brugen af ​​enkelte celler. Den primære begrænsning for enkelt celle analyse, er indsamling af nok celler i forsøget på at opnå statistisk signifikans med hensyn til metriske af interesse, for eksempel varians. I de tilfælde, hvor antallet af celler isoleret fra vævet af interesse er ikke en begrænsning, kan man undersøge flere hundrede celler per gruppe, ved hjælp af metoder som næste generation sekventering, eller nanofluidic arrays. Men i nogle tilfælde kan der være vanskeligheder med at skaffe tilstrækkeligt celler fra væv af interesse. Dette kan til dels være forårsaget af idiosynkratiske tidskrævende procedurer for indsamling af de målrettede celletype. Dog kan omhyggelig planlægning og forberedelse før de går med single celleudtagningsmetoden stadig mulighed for streng enkelt celle analyse med begrænset teknisk fejl. Ved behandlingen af ​​de resultater, det skal tages i betragtning, at selv om denne procedure til at isolere celler har været anvendt i talrige studies (herunder mikroskopi, elektrofysiologi, osv.), kan den isolation, selv potentielt effekt genekspression. Som med enhver metode, der manipulerer biologiske prøver, bør resultaterne af dine resultater omhyggeligt valideres for at sikre den enkelt celle udtryk er repræsentativ for vævet sig selv og ikke tekniske bias. Metoder såsom in situ hybridisering kan vise sig nyttigt at verificere disse resultater i intakt væv. Endelig er det afgørende at sikre, at de genererede data undersøges grundigt for kvalitetskontrol. De data, vist i figur 8 viser, at qPCR assays kan være meget robuste i deres særegenhed, som f.eks assay # 13 (A13) eller har en høj grad af variabilitet, som kan føre til tekniske varians som assay # 34 (A34).

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende den tekniske bistand fra C. Zambataro under optagelserne af denne protokol. Vi takker for støtten fra Glenn Institut for Medicinsk Forskning (SM), The Hillblom fundament, og National Institutes of Health i en Nathan Shock center Award (P30AG025708) og PO1AG025901. JMF blev støttet af T32AG000266 tildelt den Buck Institute for Research on Aging.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich 71378
KCl Sigma-Aldrich 60128
Pyruvic Acid Sigma-Aldrich P4562
Hepes Sigma-Aldrich 54457
MgCl2 Sigma-Aldrich M1020
NaH2PO4 monobasic Sigma-Aldrich P9791
Dextrose Sigma-Aldrich G6721
NaOH Sigma-Aldrich 72068
EGTA Sigma-Aldrich O3777
CaCl2 Sigma-Aldrich 21115
Protease, Type XIV Sigma-Aldrich P5147
Collagenase, Type I Worthington Biochemical C9891
1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) TEKnova, Inc. PN T0221
BSA Sigma-Aldrich B8667
Sodium Pentobarbital Henry Schein Contact supplier for ordering *must be procured through a Veterinarian or lab animal professional
ExoSAP IT Affymetrix 78201
CellsDirect 2x Rxn Mix Invitrogen 11737-030
SuperScript III RT Platinum Taq Mix Invitrogen 10928-042
RT-STA Primer Mix IDT Custom
Nuclease Free water Sigma-Aldrich W4502
WTA2 Sigma-Aldrich WTA2-50rxn
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
Qiacube Qiagen 9001292
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop 2000c
BioAnalyzer DNA 7500 kit Agilent Technologies 7500 kit
One Color Labeling kit Roche Group 5223555001
Mus Musculus 12x135k array Roche Group 5543797001
GenePix 4200A Scanner Molecular Devices 4200A
TransPlex Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) Sigma-Aldrich WTA2-50RXN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).
  2. Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
  3. Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).
  4. Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  5. D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR. Methods. 50 (4), 262-270 (2010).
  6. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. Informatics. , Academic Press. (1965).
  7. Gaillard, F. Aorta. Radiopaedia. , (2008).
  8. Ståhlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations. Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).
  9. Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells. Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).
  10. Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart. Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).
  11. Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135 (2), 216-226 (2008).
  12. Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).

Tags

Molekylær Biologi enkelt celle analyse Microarray genekspression Cardiomyocyte mus hjerte perfusion mus qPCR
Single Cell transkriptionel Profilering af Voksen Mouse cardiomyocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, … More

Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), e3302, doi:10.3791/3302 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter