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Biology

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

Published: April 6, 2012 doi: 10.3791/3303
* These authors contributed equally

Summary

대상 아이디 라이브러리 miRNA 목표를 식별하는 데 사용 복제된 cDNA의 플라스미드 기반의 게놈 전체 모음입니다. 여기는 이용 및 응용 프로그램을 보여줍니다.

Abstract

대상 아이디 라이브러리는 microRNA의 발견 및 식별 (miRNA) 목표를 지원하도록 설계되었습니다. 대상 아이디 도서관은 이중 선택 융합 단백질, thymidine 키나제-zeocin (TKzeo)에서 3'UTR의 하류에 복제된 플라스미드 기반의 게놈 전체 cDNA 라이브러리입니다. 선택의 첫 번째 라운드는 안정 transformants에 대한 관심이 miRNA의 도입에 따라, 그리고 마지막으로, miRNA의 목표를 포함하는 cDNAs을위한 선택입니다. 선택된 cDNAs은 시퀀싱 (대상 아이디 라이브러리 워크플로우 및 자세한 내용은 그림 1-3 참조)에 의해 식별됩니다.

인간의 transcriptome의 광범위한 적용 범위를 보장하기 위해 대상 ID가 도서관 cDNAs은 여러 사람의 조직 및 세포 라인에서 준비한 총 RNA의 수영장을 사용하여 oligo-DT의 마중물을 통해 생성되었습니다. 1.2 킬로바이트의 평균 크기, 0.5에서 4 KB로 cDNA 범위를 결과 및 (플라스미드지도 그림 4 참조) p3TKzeo 이중 선택 플라스미드로 복제되었다. 리로 표현 유전자 표적brary는 시그마 - 올드 리치 웹 페이지에서 찾을 수 있습니다. Illumina 시퀀싱 (표 3)의 결과가 도서관 UCSC RefGene에서 21,518 고유한 유전자 16,922 (79 %), 또는 10 또는 읽습 이상 (66 %)로 14,000의 유전자를 포함 것을 보여줍니다.

Protocol

1. 안정적인 세포 라인을위한 대상 아이디 라이브러리 및 선택과 Transfection

1. Zeocin 살인 곡선

Zeocin는 안정적으로 transfected 세포를 위해 선택하는 데 사용됩니다. 그러나 과잉 zeocin은 대부분의 세포 유형에 원치 않는 phenotypic 반응을 일으 킵니다. 따라서 살인 곡선 분석은 최소 치사량을 수립하기 위해 수행되어야합니다.

  1. 플레이트 1.6 × 10 미디어 120 μl의 96 - 웰 플레이트의 우물로 4 셀.
  2. 다음날은 50 μg / ML에서 1 밀리그램 / 적절한 우물에 ML에 이르기까지 농도 증가에 zeocin를 추가합니다.
  3. 이일마다 생존을 검사합니다.
  4. 매 3 일마다 zeocin를 포함하는 미디어를 교체합니다. 원하는 시간 후에 완전한 세포 사망의 원인이 선정 시약의 최소 농도는 그 세포 유형과 실험을 위해 사용해야합니다. 우리의 결과는 500 μg / ML zeocin은 A549에 대한 HELA, 그리고 MCF7 세포 최적는 것을 보여줍니다.

2.Nucleofection 및 선택을 통한 도서관 Transfection

  1. 중 명시적 또는 관심의 miRNA의 낮은 수준을 표현하지 않는 세포주를 선택합니다. miRNA는 달성되는 대상 ID를 도서관의 안정적인 표현하면 대상 선정을위한 섹션 B에 소개합니다.
  2. 문화 / 세포를 확장합니다. 우리는 도서관 transfection 당 2 × 10 7 세포와 우수한 결과를 획득했습니다.
  3. > 80% confluency에있는 세포를 Trypsinize, 그리고 15 ML 멸균 나사 얹은 튜브에 2 × 10 7 세포를 전송합니다.
  4. 펠렛은 5 분 200 XG에서 세포를 trypsinized.
  5. 미디어를 제거하고 HBSS 또는 1X PBS로 세포 펠렛을 씻는다.
  6. 5 분 200 XG에 원심 분리기와 빨래를 기음.
  7. 세포 펠렛의 단계를 씻어 반복합니다.
  8. 37 전체 매체 중 2 ML과 미리 따뜻하게 6 - 잘 접시 ° C.
  9. 각 transfection에 대해 0.5 ML 관 당 대상 ID를 도서관 2 μg을 (10 μl를 초과하지 않음) 추가합니다.
  10. 2 X 10 6 셀 당 Amaxa의 Nucleofection 솔루션 100 μl (셀 특정)와 위에서 15 ML 관에서 Resuspend 세포. 예를 들어, 10 Nucleofections위한 시약 1 ML을 추가합니다.
  11. 한 번에 한 반응은 플라스미드의 2 μg에 세포를 100 μl를 추가합니다. 피펫과 함께 섞는다.
  12. Nucleofector cuvette에 혼합물을 전송합니다.
  13. Nucleofector 악기로 cuvette을 넣고 세포주 (세포 생존 능력보다 우선적으로 고효율)에 맞게 최적화된 프로그램을 실행하십시오.
  14. 사전 예열 매체로 전송 피펫을 채웁니다. 동일한 피펫 6 - 웰 플레이트에 전송에 세포를 가져가라. 각 Nucleofection에 대해 잘 하나씩 반복합니다.
  15. 하룻밤 배양을위한 성장 챔버로 돌아가기.
  16. 다음날 매체를 교체하고 세포 3-5일 동안 복구할 수 있습니다.
  17. 같은 살상 곡선 분석에서 결정 zeocin의 적절한 수준을 포함​​하는 완전한 매체와 매체를 교체하십시오.
  18. 모zeocin 선택을위한 nitor 세포 (세포가 죽어).
  19. 2~3일마다 zeocin와 매체를 교체하십시오.
  20. 일단 6 자 판, 통로, 수영장에서 합류하고 큰 flasks의 세포를 확장합니다.
  21. 세포의 확장을위한 시간의 길이는 사용자와 종속 세포주이지만, 그것은 매우 미래의 검사를위한 cryo-주식을 생성하는 zeocin 저항력 세포를 확장하는 것이 좋습니다 (~ 2-3주, 세포주에 따라 다름).

2. miRNA-식 구조로 Transfect 라이브러리 세포는 안정적인 세포주에 대해 선택하고 miRNA 목표를 선택하세요

참고 : Zeocin 선택이 더 이상 필요하거나 원하는 않습니다. miRNA 발현 및 ganciclovir (대상) 선택시 zeocin하는 세포의 노출은 miRNA 목표의 손실을 초래할 수 있습니다.

3. Puromycin, G418, 그리고 Ganciclovir 살인 곡선

  1. 야생 유형에 대한 세포와​​ ganciclovir가 안정적으로 대상 아이디 라이브러리를 표현 및 puromycin 또는 G418와 살인 곡선을 수행세포.
  2. 플레이트 1.6 × 10 120 μl 신선한 매체와 96 - 웰 플레이트의 우물로 4 셀. 다음날 0.1에서 puromycin/G418, 또는 2의 10 μg / ML 선택한 우물에 ganciclovir 32 μm의에 추가할 수 있습니다.
  3. 이일마다 생존을 검사합니다. 매 3 일마다 선택 시약이 들어있는 미디어를 교체합니다. 원하는 시간 후에 완전한 세포 사망의 원인 * 선정 시약의 최소 농도는 그 세포 유형과 실험을 위해 사용해야합니다. 우리의 결과는 0.25-1 μg / ML puromycin은 A549에 대한 HELA 최적이며, MCF7 세포, ganciclovir 0.3 μg / MCF7 세포에 대한 ML G418와 8-16 μm의 A549을위한 최적이며, HELA, 그리고 MCF7 세포 것을 보여줍니다.

    * 참고 : ganciclovir 선택으로 느리거나없이 세포 성장은 전체 세포 죽음없이 관찰 수 있습니다. 그들은 적극적으로 분열하지되었는지 확인하는 방법에는 여러 일 처리를 통해 세포를 관찰. 이 경우 다음 매체에서 페놀 레드는 빨간색으로 남아 있습니다. 또한 죽이지을 수행하기 위해 필요할 수 있습니다느끼기 쉬운 상태의 변화가 관찰되는 경우 대상의 ID 라이브러리의드립니다 곡선 분석은 세포를 transfected. 그러나이 세포 유형 특정한 기준으로 판단해야합니다.

4. Nucleofection 및 대상 선정을 통해 miRNA의 Transfection

  1. 2 X 10 7 세포를 달성하기 위해 대상 ID 라이브러리 세포를 확장하고 세포가> 80% confluency에있을 때 trypsinize / 성장.
  2. 전송 2 15 ML 멸균 나사에 대한 X 10 7 세포는 5 분 동안 200 XG에 튜브와 펠렛을 얹은.
  3. 미디어를 제거하고 HBSS 또는 1X PBS로 세포 펠렛을 씻는다.
  4. 5 분 200 XG에 원심 분리기와 빨래를 기음.
  5. 세포 펠렛의 단계를 씻어 반복합니다.
  6. 37 물론 당 전체 매체 중 2 ML과 미리 따뜻하게 6 - 잘 접시 ° C.
  7. 각 transfection에 대한 miRNA 발현 플라스미드 (10 μl를 초과하지 않음) 당 0.5 ML 관 2 μg을 추가합니다. Origene의 MicroRNA 식 Plasmids (네오 마이신 - G418 선택 사항) 또는 pBABE-Puro (1764 플라스미드의 자기 복제 miRNA 유전자, Addgene)이 성공적으로 사용되었습니다. 후자의 경우 양쪽에 ~ 200 BP와 miRNA의 머리핀은 PCR은 인간의 DNA를 복제했다.
  8. 2 X 10 6 셀 당 Amaxa의 Nucleofection 솔루션 100 μl (셀 특정)와 위에서 15 ML 관에서 Resuspend 세포. 예를 들면 : 10 Nucleofections 들어, 시약의 1 ML을 추가합니다.
  9. 한 번에 한 반응은 플라스미드의 2 μg에 세포를 100 μl를 추가합니다. 피펫과 함께 섞는다.
  10. Nucleofector cuvette에 혼합물을 전송합니다.
  11. Nucleofector 악기로 cuvette을 넣고 세포주 (세포 생존 능력보다 우선적으로 높은 효율)에 맞게 최적화된 프로그램을 실행하십시오.
  12. 사전 예열 매체로 전송 피펫을 채웁니다. 동일한 피펫 6 - 웰 플레이트에 전송에 세포를 가져가라. 각 Nucleofection에 대해 잘 하나씩 반복합니다.
  13. 하룻밤 배양을위한 성장 챔버로 돌아가기.
  14. <리> 미디어를 교체하고 세포 3~5일 동안 복구할 수 있습니다.
  15. miRNA는 구조로 transfection하기 전에 수행 살상 곡선 시험에서 결정된 puromycin 또는 G418의 적절한 수준을 포함​​하는 완전한 매체와 매체를 교체하십시오.
  16. puromycin / G418 선택 (세포가 죽어)에 대한 세포를 모니터링합니다.
  17. puromycin / G418 매 2-3일와 매체를 교체하십시오.
  18. 일단 6 자 판, 통로, 수영장에서 합류하고 큰 flasks의 세포를 확장합니다.
  19. 세포의 확장을위한 시간의 길이는 사용자에 의존하지만, 그것은 매우 미래의 검사를위한 cryo-주식을 생성하는 puromycin / G418 내성 세포를 확장하는 것이 좋습니다 (~ 2-3주, 세포주에 따라 다름).
  20. 같은 miRNA는 구조로 transfection하기 전에 수행 살상 곡선 시험에서 결정된 적절한 수준 ganciclovir (GCV)와 puromycin / G418와 매체를 교체하십시오.
  21. 선택에 대한 세포 (세포 때문에 죽을 모니터G,) 타겟팅 및 TK-ZEO의 최저 miRNA.
  22. GCV와 puromycin / G418의 면전에서 세포를 확장합니다.
  23. GCV 선택한 세포로부터 게놈 DNA를 준비합니다.
  24. PCR은 키트 primers (PCR 증폭 참조)과 삽입을 증폭.
  25. 표준 시퀀싱이나 깊은 시퀀싱을위한 PCR 제품을 제출을위한 TOPOTA 벡터 (Invitrogen)에 복제품이다.

3. PCR - 증폭 선택된 라이브러리 삽입물 및 순서

참고 :이 절차를 수행 ganciclovir 선택을 살아남은 도서관의 목표를 PCR - 증폭.

5. GenElute 포유류의 게놈 DNA를 Miniprep 키트 (카탈로그 번호 G1N10) 또는 동급을 사용하여 염색체 DNA를 준비하는 ganciclovir 선택된 세포를 수집합니다. 우리는 PCR의 대상 선택된 세포에서 DNA와 비교를 위해 부정적인 컨트롤로 사용할 대상 아이디 라이브러리가 포함되지 않은 부모 세포주에서 DNA를 준비하는 것이 좋습니다.

  1. PCR 앰증폭 프라이머 1과 증폭 프라이머 2 게놈 DNA를 plify. PCR (카탈로그 번호 P0982)을위한 - 성공적인 증폭이 Jumpstart를 REDTaq ReadyMix 반응 믹스로 얻은되었습니다. 다른 효소를 사용하는 경우에는 조건의 최적화가 필요할 수 있습니다. PCR 사이클 조건에 대한 샘플 PCR 설정 및 표 2에 대해 표 1을 참조하십시오.
  2. 1 % 아가로 오스 겔에 PCR 제품 2-5 μl를 해결합니다. 예상 제품은 몇 가지 눈에 띄는 DNA가 banding과 비방이어야합니다. 대상 아이디 라이브러리없​​이 세포의 게놈 DNA의 PCR 제품을 제어하는​​ 비교합니다.
  3. 복제 및 / 또는 PCR 제품의 깊은 시퀀싱을 진행합니다. 더 증폭 제품이 관찰하거나 DNA를 통제할 동일 경우, PCR 증폭 조건 (즉, 프라이머 농도, 어닐링 온도 및 사이클) 최적화합니다.

6. 복제 및 장면

주 : 우리는 고도로 복제를 추천 PCR 제품S는 다음 키트에 제공된 증폭 Primers를 사용 클론 중 최소 96에서 표준 시퀀싱을 수행. 이 절차가 성공적으로 96도 야간 문화와 플라스미드 정화 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 깊은 시퀀싱이 필요한 경우에도 복제 및 표준 시퀀싱의 예비 결과는 깊은 시퀀싱의 추가 경비가 신경써야 여부를 결정하는 품질 검사로 사용될 수 있습니다.

  1. 클로닝 PCR 증폭 제품 (위)에 대한 TA 클로닝 키트 제작의 절차를 따르십시오.
  2. 유능한 박테리아 세포에 클론을 변환하고 항생제 함유 배지에서 하룻밤을 선택합니다.
  3. 적절한 항생제를 포함하는 액체 문화의 개별 식민지 격리하고 성장.
  4. 플라스미드 DNA를 정화. 6.5. 증폭 Primers과 시퀀싱 반응을 수행합니다.
  5. (소설 TR에 대한 인간의 transcriptome (알려진 성적 증명서) 및 인간 게놈과 시퀀스의 폭발 정렬에 의해 유전자 표적을 식별anscripts). *

* 복제 문제 해결 : 배열에서 삽입의 높은 수의 플라스미드 시퀀스 경우 같은 복제 / 시퀀스 조건을 최적화 :

  • PCR 증폭 생성물 (인서트) 품질 및 수량
  • 결합 반응
  • 플라스미드 준비 (품질 및 수량)
  • 반응 조건을 순서

4. 대표 결과

미르-373 타겟을위한 라이브러리 화면
미션 목표 아이디 라이브러리의 성능을 평가하기 위해 미르-373 목표는 MCF-7 라이브러리를 표현 세포에서 선택되었다. 그것이 조금을 표현하거나 감지하지 미르-373 (데이터가 표시되지 않음) 때문에 MCF-7이 선택되지 않았습니다. 미르-373은 그 생물 학적 관심에 선정되었습니다. 미르 - 373 표현은 MCF-7에 종양이 침략과 전이를 촉진, 일반적으로 비 전이성 세포주 [2]. 또한, 미르-373 orthologues 마우스에서 미르-290 클러스터는 마우스 배아 줄기 세포에 관련된세포 유지 [3], 그리고 미르-373 가족, 미르-372은 유도된 pluripotent 줄기 세포로 [4] 프로그래밍 fibroblast을 촉진합니다. 마지막으로, 우리는 아연 손가락 발기인 - 미르-373 표현 MCF-7 세포에서 AAVS1 사이트로 구축 PGK를 삽입 nucleases 사용하고, RNA microarray 분석 (데이터가 표시되지 않음)에 의해 잠재 미르-373 목표의 목록을 생성.

대상 아이디 라이브러리는 MCF-7 세포로 transfected되고, 세포의 안정 인구가 선택되었으며 zeocin 함유 매체에서 증폭. 그 결과 세포 (MCF-7 라이브러리)이 안정적으로 미르-373 표현하는 구조로 transfected와 미르-373 목표를 표현하는 세포를 위해 풍부 ganciclovir 함유 배지에서 선택되었다. 우리는 부정적인 제어 MCF-7 라이브러리 세포 (미르-373 제외)을 분리하고 같은 죽은 세포에 대한 예상 반올림되기 아니라고 보여집니다. 그러나, 그들은 구경이 관찰로 페놀 레드 함유 매체 오렌지 - 노란색 설정하지 않았기 때문에 쉽게 발견되었고, 성장을 멈춘 한미르-373을 표현 R 전지 (그림 5). 세포는 ganciclovir 함유 매체로 확대하고, 대상 시퀀스는 살아남은 세포에서 준비 대상 아이디 도서관 cDNA 삽입하고 DNA를 측면 primers로 PCR에 의해 격리되었다. PCR 제품은 Illumina 순서가 있었다.

표 4에 나타난 바와 같이, 우리는 11,076 고유한 유전자에 매핑 17,740,719 cDNA 읽기를 획득하였습니다. 이러한 고유의 유전자 중, 2898은 40 개 이상의 읽기와 함께 발견되었다, 따라서 안정적인 히트로 간주되었다. cDNA 삽입을 증폭하는 데 사용되는 PCR primers의 40가 300 기지 거리에 삽입 사이트에서하기 때문에 읽는다 13106469 벡터가 예상되었다. 따라서, 그것은 대부분의 결과로 시퀀스 게놈 소재의 더 전통 깊은 시퀀싱 달리 벡터에서 될 예정입니다. 천 %가 벡터 또는 cDNA 중 하나에 매핑하지 못했지만, NCBI의 비 중복 뉴클레오 티드 데이터베이스 (즉, NR 조회 포함)으로 정렬 않았다, 그리고 1 %는 더 cDNA 삽입 없었다.

초기 비교 대상 ID를 도서관을 통해 식별되는 고유한 유전자의 10 TarBase 이전에 확인된 미르-373 목표 (표 5)의 목록에도 것으로 나타났습니다. 이러한 10 호-373 목표는 이전 transiently 합성 미르-373가 [5]을 모방으로 transfected HELA 세포에서 RNA와 microarray에 의해 확인되었다. 더욱이, 우리는 AAVS1 사이트 (데이터가 표시되지 않음)에서 미르-373을 표현 MCF-7 세포에서 아래쪽 규제 동일한 10 유전자를 발견했습니다. 따라서 이러한 10 호-373의 가능성이 유효한 대상입니다. 작업은 잠재적인 목표와 RT-qPCR, 서양 얼룩 및 루시페라제 리포터 분석에 의해 실험적으로 선정 히트를 확인할 시도의 목록을 특성화하기 위해 진행 중입니다.

그림 1
그림 1. 대상 아이디 라이브러리를위한 워크플로우. 섹션 교류는 : 프로 시저 섹션을 참조하십시오. 각 단계에서 그림과 자세히 설명되어 있습니다 3의 오른팔.

그림 2
그림 2. Transfection 및 Zeocin 선택. 대상 아이디 라이브러리 plasmids의 풀 (), thymidine 키나제-zeocin 융합 단백질 (; 그림 4 TKzeo) 이후 3'-UTR에 삽입 인간 cDNA 각입니다. 전지는 타겟 ID를 도서관 (B)로 transfected 및 3~5일 동안 복구할 수있게됩니다. 구조는이 복구 기간 (C) 동안 게놈에 통합하고, 인코딩된 성적 증명서 (D)를 표현할 수 있습니다. 복구 후, 세포 zeocin (E)에 노출됩니다. 안정적으로 통합 대상의 ID 구조에서 TKzeo 융합 단백질을 표현 세포는 zeocin 선택 (F)에 남아있다. Untransfected 세포 (G) 죽어라. 또한, 모든 세포는 내생 miRNA를위한 대상 구조 또는 oth을 포함하는음 요소는 구조가 죽을 대상 ID (H)에서 TKzeo의 표현을 억제 세포로 표현.

그림 3
타겟 ID를 도서관 (즉, zeocin 선택된 세포)가 포함된 그림 3. miRNA의 transfection하고 ganciclovir 선택. 세포 선택 microRNA 발현 건설 ()로 transfected 있습니다. 복구하는 동안, miRNA의 표현 구조는 (B)를 통합 및 miRNA 구조에 인코딩 선택 마커를 표현할 수 있습니다. 안정적인 통합 (C)와 셀 확장을위한 선택 후, 세포는 ganciclovir (D)로 처리됩니다. ganciclovir의 존재 (즉, 세포가 TKzeo이 miRNA의 표적이되지 구조 표현)에 thymidine 키나제 (TK)를 생산하는 전지 (E) 반면에 죽을 것이다, miRNA 표적 s와 라이브러리 구조를 포함하는 세포 ites은 TK를 생산하지 않으며, 따라서 ganciclovir 선택 (F)를 살아남을 것입니다. 살아남은 세포는 gDNA를 격리 재배 수 있으며, cDNA 포함하는 miRNA 대상 사이트는 대상 아이디 증폭 primers를 사용하여 PCR - 증폭. PCR 제품은 miRNA 목표를 식별하는 인간 게놈과 순서가 정렬됩니다.

그림 4
그림 4. 플라스미드지도 및 증폭 Primers의 위치. SFI 나 cDNA 복제의 사이트입니다.

프라이머 시퀀스

선교 대상 아이디 증폭 프라이머 1

5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3

선교 대상 아이디 증폭 프라이머 2

5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3

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그림 5. 세포 성장에 Ganciclovir 효과. 스물넷 잘 플레이트는 2-100000 MCF-7 세포 또는 타겟 ID 라이브러리를 포함하는 MCF-7 세포에 놓는 있었다. 스물 네 시간 후에, 매체는 ganciclovir 0 8, 또는 16 μm의를 포함하는 매체로 대체되었습니다. 십오일 후, 번호판 (6 위 우물) 사진에 찍혔다 다음, 브릴리언트 블루의 R 염색법 솔루션 (B6529) (6 낮은 우물)와 HBSS와 스테인드로 씻어 우물. 그들이 thymidine 키나제 (TK)를 표현하지 않기 때문에 ganciclovir는 도서관 않고 MCF-7 세포에 영향을 미치지 않습니다. 한편, MCF-7 도서관 전지는 표현 TK해야하지만 Brillinat 블루 차지하지 라이브 세포에 의해 그림과 같이 완전히, 8 또는 16 μm의에서 ganciclovir에게 살해되지 않습니다. 그러나 도서관 세포들은 중간에서 페놀 적색 염료의 색깔에 의해 입증로서, ganciclovir에 성장을 멈춘 않습니다. 체포 세포들이 매체를 시어지다하지 않으며, 색상 대신하거나 바꿀려고 붉은 남아앙 - 노란색.

시약 볼륨 / 반응
Jumpstart를 REDTaq ReadyMix 반응 믹스 10 μl
증폭 프라이머 일 (25 μm의) 0.2 μl
증폭 프라이머 2 (25 μm의) 0.2 μl
게놈 DNA를 50-200 NG
물, 분자 학년 20 μl로

표 1.

단계 온도. 시간 사이클
초기 변성 95 ° C 5 분 거리에 있습니다.
변성 95 ° C 30 초. 팬 = "3"> 40 사이클
*를 어닐링 62 ° C 30 초.
확장 68 ° C 2 분.
결승전 연장 68 ° C 5 분 거리에 있습니다.
보유 4 ° C 보유

표 2.

* 어닐링 온도가 다를 수 있지만 53와 64 사이에 이르는 다양한 어닐링 온도와 최고의 증폭 제품을 살펴 봤으니 ° C.

표 3

Illumina의 시퀀싱에 의해 표 3. 대상 아이디 라이브러리 콘텐츠입니다.

표 4

표 4. Illumina 시퀀싱에 의해 미르 - 373 선택한 대상으로하고 있습니다.

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표 5. 이전에 RNA microarray에 의해 식별 10 목표.

Discussion

microRNAs는 억제 mRNA의 번역에 의해 사후 transcriptionally 유전자 발현을 조절하고, 자주, 타겟 mRNA를 ([6]에서 검토) 약화 20-24 염기 RNAs 있습니다. 단일 miRNA는 개발과 환경 신호에 대한 세포의 반응을 제어하기 위해 수백 mRNAs을 조절할 수 있습니다. 식별 및 대상 mRNAs을 확인하면 해당 경로에서 miRNA의 역할과 기능을 결정하는 것이 필수적입니다. 동물에 miRNAs과 타겟 사이트가 완전히 보완하지 않습니다, 때문에, 표적 식별은 간단하지 않습니다. "종자"지역, miRNA의 5' 엔드에서 7을 통해 2 기준으로, 보통의 목표를 보완합니다. 그러나 거기에 씨앗 규칙에 여러 예외이며,베이스 - 페어링 하류는 불완전한 씨앗 경기 보정할 수 있습니다. 컴퓨터 알고리즘의 숫자는 종자 매칭 및 다운 스트림 보상, 대상 구조를 기반 miRNA 목표를 예측하기 위해 개발되었습니다D 위치, 순서 보존, 그리고 실험적으로 검증 대상 ([7]에서 검토)에 대한 관찰되어 여러 가지 다른 매개 변수. 예측이 편리하고 식별 많은 유효 miRNA 목표를 silico에있는 동안 대부분의 유전자는 실험적인 검증 테스트에 실패, 많은 실제 대상이 예측되지 않는 예측했다. 컴퓨터 알고리즘은 이전에 결정된 목표 기능을 기반으로하고 있기 때문에 또한, 그들은 이미 잘 알려져 있습니다 무엇 이탈 표적의 발견을 허용하지 않습니다.

실험 시스템의 숫자는 살아있는 세포의 기능적인 miRNA 목표를 식별하거나 발견하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 글로벌 심사 방법은 microarrays와 RNA 시퀀싱, RNA 공동 immunoprecipitation (RIP) 및 세포 배양에서 아미노산과 안정 동위 원소 라벨링 (SILAC), proteomic 방법 ([7]에서 검토)가 있습니다. 각 방법은 장점과 단점이 있습니다. 타겟팅 miRNA는 종종 mRNA를 destabilizes과 열화, 분실 O로 연결하기 때문에miRNA는 각각 모방하거나 억제제를 도입 후 mRN​​A 수준에서 R 게인은 miRNA 목표를 식별할 수 있습니다. mRNA의이 손실이나 이득은 쉽게 microarray 또는 크게 시퀀싱에 의해 감지된다. mRNA 검출 방법은 간단하고 단백질 검출 방법보다 더 민감한 반면, mRNA 탐지가 타락되지 않은 miRNA 목표를 놓칠 것이다. SILAC에서 이들과 함께 RNA 검출에서 miRNA 목표 결과를 비교 Bartell 연구소의 최근 보고서 [8] 또는 ribosome 파일링 [9] 포유 동물 miRNAs는 주로 타겟 mRNA 수준을 줄임으로써 행동을 나타냅니다. 그러나 개별 miRNA 목표와 협력 많은 다른 연구진이 단백질의 변화하지만 mRNA 수준에는 변화를 감지했습니다. 노 감지 mRNA의 손실과 translational 규제하는 것으로 보이는 보고서는 다음과 같습니다 미르-10B HOXD10에 [10] p27kip1에서 miR221/222 [11] Pd​​cd4에서 미르-21 [12] 미르-126 p85β에 [13] , SIRT1의 미르-34 [14] PTEN [15] 미르-302d Arid4b에 [16] 미르-200c JAG1에 [17], 그리고 미르-299, 297, 567,에, 미르-21VEGFA에 ND 609 [18]. 또한, 클랜 외 [19] 최근 가주-7 대상 사이트를 포함하는 각각의 mRNA의 isoforms이 선택적으로 발견되었을 때 가주-7에 의해 translational 규제에만 발견되었다고 보도했다. 모든 mRNA의 isoforms 하나의 mRNA로 감지되면 그것은, -로 - 많은 microarray 및 시퀀스 분석으로 얻은 후자는 최소한 어떤 경우에는, translational 규제가​​ 복합 프로파일에 간과할 수있다,하는 것이 좋습니다. argonaute (보통 ago2) 또는 다른 관련된 단백질 (RNA immunoprecipitation, 또는 RIP)를 통해 miRNA-mRNA의 단지의 공동 immunoprecipitation에 관계없이 규제 메커니즘의 miRNA 목표를 분리합니다. 또한, RIP는 상호 작용을 내생, 그리고 아마도 생물학적으로 관련성이 감지합니다. 그러나, 그것은 모든 miRNA-mRNA의 상호 작용 기능이며, RIP 만 transiently 연결하거나 급속하게 저하에있다는 mRNA 목표를 놓칠 것인 지 알 수 없습니다. 또한, 특정 miRNA-mRNA 파트너는 bioinformati에게 유추되어야합니다모든 miRNA-mRNA 쌍 함께 공동 시켰던 캘리 때문입니다. 마지막으로, SILAC 직접 miRNA 조절, 단백질 자체의 최종 제품을 식별하지만, 구별이므로 희귀 단백질 및 단백질 수준의 작은 배 변화를 그리워합니다.

현재 miRNA 목표 식별 방법과 한계에 비추어, 우리는 다른 메커니즘에 의해 기능적인 miRNA 목표를 식별하기위한 추가적인 글로벌 분석이 필요했다 느꼈다. 이러한 필요성을 충족하기 위해 줍 Gaken와 킹스 칼리지 런던의 Azim Mohamedali에 의해 발명 기술을 허가. 그들의 발명은 이중 선택 융합 단백질이며, 특히, thymidine 키나제-zeocin 융합, 그 3'UTR의 잠재적인 miRNA 목표 시퀀스의 cDNA 라이브러리에 의해 규제. 그림 2에서 그림과 같이 안정적으로 TKzeo-cDNA 구조와 함께 표현 transfected 세포는 zeocin으로 선택할 수 있습니다. 관심 miRNA을 표현하면, 그 miRNA의 목표 이래 선택할 수 있습니다일 ganciclovir와 같은 그림 3 그림. Ganciclovir는 모든 세포의 관심 miRNA에 대한 목표를 부족한 TKzeo-cDNA 표출하는 thymidine의 키나제를 표현하는 세포를 죽이는. 타겟 cDNA는 측면 cDNA와 PCR 제품은 목표를 식별하기 위해 순서가 수 ganciclovir 사용 primers를 생존 세포에서 DNA의 PCR 증폭에 의해 격리 수 있습니다.

선교 대상 아이디 도서관 - 저희 기능성 인간 miRNA 목표의 글로벌 식별 및 검색을위한 새로운 도구에 국왕의 대학 기술을 개발했습니다. 대상 아이디 라이브러리를 통해 사용자는 포유 동물 세포 배양 transfection과 약물 선택 일련의 단계에 의해 miRNA 목표를 분리할 수 있습니다. 도서관은 포괄적이며, 인간 유전자의 66-79%가 포함되어 있습니다. 초기 결과는 모두 이전에 발견뿐만 아니라 새로운 목표는 선교 대상 ID를 도서관에서 격리 수 있음을 나타냅니다.

프로토콜은 몇 가지 길이 있지만포유 동물 세포 배양, transfection, 약물 선택, PCR 및 시퀀싱 - - 타겟 ID 라이브러리의 사용은 표준 분자 실험 기법을 필요로하므로, 대부분의 생물학 자의 수단 내에서 잘해야합니다. 우리는 충분한주의가 문화 환경을 최적화, 적절한 실험 설계에 납부하고, 가장 중요한 목표 아이디 라이브러리 성공을 보장하는 선택 단계 (죽이기-커브)에 대한 최적의 약물 수준을 결정하기 위해 각각의 새로운 세포 유형을 미리 테스트하는 것이 좋습니다.

모든 miRNA 목표 식별 방법과 마찬가지로, 그것은 높은 대상 아이디 도서관을 분석해 식별 대상이 같은 microarray, qRT-PCR, 기자 분석 (즉, 루시페라제) 또는 서양 분석과 같은 두 번째 방법과 함께 확인하는 것이 좋습니다.

Disclosures

저자는 제출한 작품에 관심을 가지고 상업적 주체와 재정 관계를 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 그녀의 지원과 결실 문제 해결 논의에 참여하기 위해 전체 시그마 생명 과학 미션 대상 아이디 라이브러리 개발팀, 특히 기술을 발견하고 라이센스 조항을 협상에 대한 케빈 Gutshall 및 헤더 Holemon 감사드립니다. 우리는 또한 자유롭게 그것이 복제지고에 큰 cDNA의 배치와 그의 지속성을 준비를 위해 게시되지 않은 결과 제안 및 RxBiosciences의 Qazi 하미드을 공유 킹스 칼리지 런던의 박사 줍 Gäken 감사드립니다. 우리는 cDNA 배열과 데이터 분석을 수행하기 위해 SAFC에서 할머니 린 스콧 Bahr을 인정하고 싶습니다.

목표는 시그마 - 올드 리치 생명 공학 LP의 등록 상표입니다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JumpStart REDTaq ReadyMix Sigma-Aldrich P0982
Ganciclovir Sigma-Aldrich G2536
G418 Sigma-Aldrich G8168
Puromycin Sigma-Aldrich P9620
Topo TA Invitrogen KNM4500-01
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit Sigma-Aldrich G1N10
Cell Specific Nucleofection kit Lonza Inc.
Nucleofector Lonza Inc. AAD-1001
Zeocin Invitrogen R250-01
Target ID Library Sigma-Aldrich MREH01

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References

  1. Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from: http://www.sigma-aldrich.com (2012).
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유전학 이슈 62 대상 ID miRNA 유전체학 ncRNA RNAi,
선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린
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Coussens, M. J., Forbes, K.,More

Coussens, M. J., Forbes, K., Kreader, C., Sago, J., Cupp, C., Swarthout, J. Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library. J. Vis. Exp. (62), e3303, doi:10.3791/3303 (2012).

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