Summary
CompoZr कस्टम जिंक फिंगर Nuclease सेवा के (ZFN) किसी भी जीव या किसी भी उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित ठिकाना पर सेल लाइन में सटीक जीनोम संपादन के लिए सक्षम बनाता है. इस लेख के डिजाइन, निर्माण, मान्यता और CompoZr कस्टम ZFN सेवा के कार्यान्वयन के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है.
Protocol
1. कस्टम ZFN डिजाइन प्रक्रिया
- ZFN डिजाइन की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए, एक अन्वेषक प्रदान करना चाहिए:
- जीन नाम, प्रजातियों, और जीन / एनोटेशन पहचान संख्या के रूप में लक्ष्य जीन पर सूचना.
- एक स्पष्ट रूप से कहा गया है पर सभी प्रयोग का उद्देश्य (जैसे, या नॉकआउट Knockin)
- जीन लक्ष्य की कोई विशिष्ट कारकों में जो atypical जीन संरचना, विशेष आनुवंशिक बिन्दुपथ में फंसा जीव विज्ञान, या किसी भी मुताबिक़ जीनोम में कहीं क्षेत्रों में शामिल हैं.
- जस्ता उंगली के लिए डीएनए अनुक्रम की विशिष्ट श्रृंखला के लिए लक्षित न्युक्लिअसिज़.
- सिग्मा जैव सूचना विज्ञान टीम - सिलिको ZFN डिजाइन में आयोजित प्रारंभिक जस्ता उंगली लक्ष्य साइटों को विकसित करने के लिए.
- प्रारंभिक ZFN लक्ष्य साइटों ZFN वैज्ञानिक तकनीकी सलाहकार के लिए प्रदान की जाती हैं. और अधिक तकनीकी रूप से जटिल परियोजनाओं के लिए, इस सिग्मा वैज्ञानिक जांचकर्ताओं के साथ परियोजना रणनीति विकसित करने के लिए काम करता है.
- बायोइनफॉरमैटिक्स समीक्षा के लिए अन्वेषक के लिए शीर्ष ZFN लक्ष्य साइटों प्रदान करता है. संभावित ZFN लक्ष्य साइटों के अनुमोदन पर, इस जानकारी के ZFN प्रोडक्शन टीम के लिए प्रदान की जाती है ZFN विनिर्माण प्रक्रिया शुरू है.
2. कस्टम ZFN उत्पादन
- जस्ता उंगली मॉड्यूल की सिग्मा संग्रह को मंजूरी दे दी ZFN डिजाइन को इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- प्रत्येक ZFN डिजाइन इकट्ठा होता है और एक उच्च throughput क्लोनिंग मंच पर सत्यापित अनुक्रम.
- एक बार सभी ZFN डिजाइन के उत्पादन के हर ZFN पूरा हो गया है सत्यापन के लिए भेजा है.
3. है कस्टम ZFNs के मान्यकरण
- ZFN परियोजनाओं मेंमानव, माउस, चूहा, या चो प्रजातियों अच्छी तरह से विशेषता प्रत्येक प्रजातियों के लिए सेल लाइनों में मान्य हैं, एक खमीर आधारित परख अन्य जीवों या सेल प्रकार के लिए प्रयोग किया जाता है.
- ZFN constructs उपयुक्त सेल लाइन में nucleofection द्वारा वितरित कर रहे हैं और ZFNs व्यक्त कर रहे हैं.
- डीएनए ZFN ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के पूल से काटा जाता है और ब्याज क्षेत्र पीसीआर परिलक्षित है.
- Cel एक - परख तो पीसीआर उत्पाद पर आयोजित किया जाता है. जेल वैद्युतकणसंचलन Cel-1 पुष्टि ZFN गतिविधि परख पर चलाया जाता है.
- Cel-1 परख द्वारा की पुष्टि के रूप में उच्चतम गतिविधि ZFN डिजाइन के फिर ग्राहक के लिए प्रदान की जाती है. ZFNs और CEL-1 परख और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में जीनोमिक डीएनए के लिए पीसीआर प्राइमरों के साथ प्लास्मिड डीएनए mRNA में वितरित कर रहे हैं.
4. मान्य ZFNs Nucleofection द्वारा डिलिवरी
- 2x10 5 कोशिकाओं / nucleofection पहले दिन मिलीलीटर की एक घनत्व कोशिकाओं बीज.
- Nucleofection के दिन पर,सेल लाइन Nucleofector किट वी लेने के लिए और कमरे के तापमान को गर्म करते हैं.
- Nucleofection समाधान वी निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार पूरक जोड़ें.
- कोशिकाओं गिनती. सेल घनत्व 2.5 5x10 5 कोशिकाओं / एमएल के बीच होना चाहिए.
- पूर्व nucleofection कम से कम 20 मिनट के लिए मध्यम के प्रत्येक अच्छी तरह से और पूर्व सीओ 2 इनक्यूबेटर में गर्म 2ml के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 अच्छी तरह से थाली भरें.
- 200xg में 5 मिनट के लिए अभिकर्मक प्रति 2x10 6 कोशिकाओं (8x10 कुल 6) अपकेंद्रित्र.
- हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) के 20 मिलीग्राम के साथ कोशिकाओं को दो बार धो.
- प्रयोगात्मक ट्यूबों तैयार: (कस्टम ZFN तकनीकी बुलेटिन में तालिका देखें)
- 6 अच्छी तरह से इनक्यूबेटर से कदम (6.5) से युक्त मीडिया की थाली निकालें.
- 400 Nucleofection के समाधान के μl (100 μl / प्रतिक्रिया) में कोशिकाओं Resuspend वी.
- एक समय में एक प्रतिक्रिया, प्रत्येक डीएनए या ट्यूब mRNA के युक्त कोशिकाओं की 100 μl जोड़ें. Transfएर उपयुक्त कार्यक्रम के साथ एक Nucleofector पर एक 2 मिमी electroporation क्युवेट और nucleofect मिश्रण.
- प्रत्येक नमूने की nucleofection के तुरंत बाद, एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करने के लिए 6 कदम में प्लेट अच्छी तरह से (6.9) से क्युवेट करने के लिए ~ prewarmed माध्यम के 500 μl जोड़ने के लिए. तो, ध्यान से 6 अच्छी तरह से थाली में शेष prewarmed मध्यम क्युवेट से कोशिकाओं को हस्तांतरण.
- सभी प्रतिक्रियाओं को समाप्त करने और सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 अच्छी तरह से थाली वापस
5. ZFNs की डिलिवरी के बाद जीनोमिक डीएनए कटाई
- 6 अच्छी तरह से थाली जमा कोशिकाओं के सभी फसल नहीं है. यह महत्वपूर्ण है के लिए संस्कृति को बनाए रखने के क्रम में एकल सेल कमजोर पड़ने क्लोन करने के लिए कोशिकाओं के बाद आप पुष्टि करते हैं कि आप Cel-1 पाचन उत्पादों. एक से तीन दिन nucleofection के बाद कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए गुणसूत्र डीएनए तैयार GenElute स्तनधारी जीनोमिक डीएनए Miniprep किट का उपयोग कर.
6. Cel - एक परख
95 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट पहले
95 ° 85 सी डिग्री सेल्सियस, -2 डिग्री सेल्सियस / सेकंड
85 ° सी 25 डिग्री सेल्सियस -0.1 डिग्री सेल्सियस / सेकंड
4 डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल के,
7. Clonal अलगाव और विशेषता
- एकल सेल क्लोन FACS और कमजोर पड़ने क्लोनिंग सहित मानक तरीकों से ZFN इलाज के नमूने.
- क्लोन पर्याप्त विस्तार करने के लिए, तो जीनोमिक डीएनए फसल के लिए कक्षों की कुछ अनुपात विभाजित, बैंकिंग सामग्री के रूप में वापस शेष ठंड की अनुमति दें.
- Cel मैं प्राइमरों का उपयोग क्लोन से जीनोमिक डीएनए बढ़ाना और Cel मैं परख (WT में नुकीला डीएनए के साथ और बिना) द्वारा amplicon का विश्लेषण, या वैकल्पिक रूप से इस amplicon उपयोग जीनोटाइपिंग के लिए सीधे आगे बढ़ना.
- जीनोटाइप उम्मीदवार क्लोन पसंदीदा विधि द्वारा संपादित alleles के होने के रूप में पहचान की है.
8. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 2 में पूरे CompoZr ZFN कार्यप्रवाह का एक उदाहरण प्रस्तुत किया है. ZFNs वितरित कर रहे हैंकोशिकाओं जहां वे बाँध और फोड़ना उचित डीएनए अनुक्रम है जो एक को तोड़ने डबल असहाय (DSB) बनाता है. प्राकृतिक मरम्मत की प्रक्रिया, गैर मुताबिक़ मरम्मत (NHEJ), DSB में शामिल होने के अंत. विलोपन प्रविष्टि, या nucleotides के प्रतिस्थापन में कुछ उदाहरणों न्यायपालिका NHEJ परिणाम में. विकृतीकरण / पीसीआर प्रतिक्रिया के annealing के कदम के बाद जंगली प्रकार और संशोधित amplicons की के बीच heteroduplex गठन में काटा जीनोमिक डीएनए परिणाम की पीसीआर प्रवर्धन. Cel-1 किसी भी heteroduplex अणुओं की दरार में एंजाइम परिणाम के अलावा. Cel एक परिणाम पृष्ठ विश्लेषण के द्वारा हल कर रहे हैं ZFN दरार की पुष्टि चित्रा 3. Cel-1 परख और अपेक्षित परिणाम के एक योजनाबद्ध प्रदान करता है.
प्रतिनिधि Cel 1 परिणाम आंकड़े 4 और 5 में निहित हैं चित्रा 4 ZFNs की एक बहुत सक्रिय जोड़ी (21%) K562 कोशिकाओं में से परिणाम हैं, चित्रा 5 ZFNs की एक कम सक्रिय जोड़ी (2.4%) से परिणामों में शामिल है.K562 कोशिकाओं. ZFN गतिविधि दोनों आंकड़े में पैतृक पीसीआर टुकड़ा नीचे दो पीसीआर टुकड़े की उपस्थिति की पुष्टि की है.
आकृति 1. बाध्य जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ प्रतिनिधित्व ZFNs जस्ता डीएनए बाध्यकारी डोमेन उंगली FokI प्रतिबंध है endonuclease की दरार डोमेन के लिए जुड़े हुए शामिल प्रोटीन इंजीनियर हैं. जब एक heterodimer के रूप में ही, ZFNs एक उपयोगकर्ता निर्दिष्ट डीएनए अनुक्रम में एक ब्रेक डबल असहाय बना.
चित्रा 2. कस्टम ZFN सेवा वर्कफ़्लो के योजनाबद्ध वर्कफ़्लो ग्राफिक प्रतिनिधित्व करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से संशोधित CompoZr ZFNs का उपयोग करते हुए सेल लाइन उत्पन्न.
चित्रा 3. Cel-1 परख और परिणाम के योजनाबद्ध ए) ZFN प्लाज्मिड ओ. आर mRNA के कोशिकाओं को दिया है. बी) ZFNs बाँध एक्सप्रेस्ड किए जाते हैं और अपने लक्ष्य कोशिकाओं के एक हिस्से में एक डबल असहाय (DSB) को तोड़ने बनाने के अनुक्रम में कटौती. सी) गैर मुताबिक़ द्वारा कुछ DSBs की न्यायपालिका की मरम्मत nucleotide सम्मिलन या विलोपन में परिणाम में शामिल होने के अंत. डी) जीनोमिक डीएनए कोशिकाओं के ट्रांसफ़ेक्ट पूल से काटा जाता है और ब्याज की बिन्दुपथ में परिलक्षित. एफई) पीसीआर उत्पाद विकृत है और जंगली प्रकार और संशोधित amplicons की के बीच heteroduplex गठन बनाने के फिर से annealed. जी) Cel-1 heteroduplex अणुओं की दरार में बेमेल है endonuclease परख परिणाम है. ) एच Cel-1 एंजाइम हज़म द्वारा हल कर रहे हैं. दरार उत्पाद मनाया आंत्रेतर बैंड अनुपात, ImageJ सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित, अंश कटौती और ZFNs की दक्षता को दर्शाता है.
चित्रा 4. 21% सक्रिय ZFNs से cel-1 परिणाम ImageJ सॉफ्टवेयर में उपलब्ध है._blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.
चित्रा 5. Cel 1 परिणामों से 2.4% सक्रिय ZFNs ImageJ सॉफ्टवेयर में उपलब्ध है: http://rsbweb.nih.gov/ij/ .
Discussion
एक बार ZFN संशोधित कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं वे स्थायी है और डीएनए संशोधन पैतृक. यह stably संशोधित सेल लाइनों वांछित आनुवंशिक संशोधन के साथ या नस्ल के पशुओं को उत्पन्न करने के लिए अनुसंधान का संचालन करने की क्षमता में यह परिणाम है. CompoZr कस्टम ZFNs जीनोम कोशिका प्रकार की एक विस्तृत विविधता में संपादन के लिए एक मजबूत तरीका प्रदान करते हैं. सफल ZFNs साथ संपादन जीनोम का प्रकाशन शामिल है, लेकिन मानव कोशिका लाइनों, माउस, चूहा, zebrafish, मेंढक, सुअर का और चो अनुसंधान के मॉडल तक सीमित नहीं है 3,4,5,6,7,8,9. बनाने की क्षमता डबल असहाय निर्दिष्ट सेल प्रकार में वांछित लक्ष्य साइट पर तोड़ जब ZFNs ठीक से एक सेल में वितरित कर रहे हैं आश्वासन दिया है. यह भी संभव है एक सेल करने के लिए अनुक्रमिक जस्ता उंगली संशोधनों प्रदर्शन के क्रम में एक कोशिका के भीतर एक से अधिक आनुवंशिक संशोधन है 10 के लिए एक विशिष्ट लक्ष्य अनुक्रम का चयन करें और केवल संशोधित करने के लिए एकाधिक बनाने की क्षमता के लिए है कि विशेष रूप से ठिकाना एक प्रमुख कारण है की क्षमता modifiफैटायनों.
CompoZr कस्टम ZFN विश्लेषण के प्रमाण पत्र बहुत किट में इस प्रकार आश्वस्त है कि किट के सभी घटकों को अच्छी तरह से ग्राहक सफलता के लिए मान्य किया गया है प्रदान अभिकर्मकों के साथ उत्पन्न होता है. अंत तक शुरू से वर्कफ़्लो का महत्वपूर्ण कदम नीचे प्रस्तुत कर रहे हैं:
सेल क्लोनिंग
को अलग करने के लिए और एक दिया सेल लाइन का विस्तार करने की क्षमता किसी भी ZFN प्रयोगों की शुरुआत से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए. एकल कक्षों और अलग किया जाना चाहिए करने के लिए सुनिश्चित करें कि आबादी clonally व्युत्पन्न संभव है विस्तार है. कुछ सेल लाइनों इस मामले में अड़ियल हैं, और संपादित क्लोन के लिए संवर्धन, या कंडीशन मीडिया के साथ संस्कृति के रूप में ऐसी चालें करने के लिए इन चुनौतियों से उबरने में मदद कर सकते हैं.
वितरण दक्षता
वितरण दक्षता का अनुकूलन ZFNs के वितरण से पहले जरूरी है. कई तरीकों लिपिड आधारित अभिकर्मक, electroporation, और nucleofecti के सहित इस्तेमाल किया जा सकता हैपर. आदर्श वितरण पद्धति एक है कि वितरण दक्षता और सेल अस्तित्व के सबसे इष्टतम मिश्रण देता है के होते हैं. इन क्षमता Quantitating के दृश्य निरीक्षण या FACS 24 48hrs प्रसव के बाद से एक GFP नियंत्रण के प्लाज्मिड और quantitating देने से अनुमान लगाया जा सकता है.
Cel - मैं परख
यह आवश्यक है कि मैं Cel - परख समानांतर में उचित नियंत्रण के साथ किया जाता है करने के लिए सुनिश्चित करें कि पीसीआर, पाचन, और वैद्युतकणसंचलन मापदंडों ZFN प्रयोग की व्याख्या के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा. प्रत्येक किट नियंत्रण जीनोमिक डीएनए कि Cel मैं विश्लेषण के प्रमाण पत्र में छवि बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है शामिल हैं. प्रदान की Cel - मैं परख के बाद प्राइमरों के साथ नियंत्रण डीएनए से प्रवर्धन उपयोगकर्ता का विश्लेषण प्रमाणपत्र (CofA) छवि में प्रदान की गई है कि के साथ परिणाम की तुलना करने के लिए अनुमति देगा, और एक प्रयोग के इस पहलू में किसी भी संभावित inefficiencies को अलग. के रूप में एक नकली, या GFP एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण सेल का इलाजनमूना भी किसी भी गैर विशिष्ट दरार उत्पादों की व्याख्या की अनुमति देने के लिए शामिल किया जाना चाहिए.
एकल सेल क्लोनों की / गुणात्मक मात्रात्मक विश्लेषण
ZFN उपचार और एकल कोशिका क्लोनिंग के बाद, कक्षों की आबादी तरीकों की एक संख्या से ब्याज का ठिकाना पर संपादन के लिए जांच की जा सकती है. Cel - मैं परख क्लोन से जीनोमिक डीएनए पर आगे जीनोटाइपिंग के लिए उम्मीदवार क्लोन की पहचान के उद्देश्य के लिए आयोजित किया जा सकता है. यह नमूना amplicons में एक 1:1 अनुपात में कील WT पीसीआर amplicon के लिए महत्वपूर्ण है से पहले प्रदर्शन Cel मैं के रूप में समयुग्मजी उत्परिवर्ती क्लोन सजातीय अणु होते पचाने में है, और इस तरह एक नकारात्मक परिणाम Cel मैं परख हूं. इन उम्मीदवार क्लोन स्क्रीनिंग के लिए एक वैकल्पिक पद्धति के सीधे ZFN लक्ष्य साइट पर एक पीसीआर प्राइमर लैंडिंग डिजाइन है. नियंत्रण प्राइमरों के साथ संयोजन के रूप में प्रयुक्त, एक नकारात्मक परख परिणाम WT अनुक्रम के नुकसान को इंगित करता है. एक इतरयुक्ती कम से कम एक WT एलील युक्त क्लोन y जाएगाield पीसीआर संकेत, लेकिन SYBR qPCR के संदर्भ में पीसीआर के प्रदर्शन से पूरी तरह से WT क्लोन से अलग किया जा सकता है.
एक बार उम्मीदवार क्लोन उपरोक्त तरीकों से पहचान की गई है, वे मानक pyrosequencing, गहरी अनुक्रमण या अन्य अनुक्रमण विधियों द्वारा genotyped किया जा सकता है. सभी अनुक्रमण विधि के लिये, एक प्रतिरूप जीनोमिक डीएनए से बनाया amplicon के उत्पन्न किया जाना चाहिए. पारंपरिक pyrosequencing alleles के लिए TA-क्लोनिंग पीसीआर उत्पाद से अलग किया जा सकता है, और व्यक्तिगत कालोनियों अनुक्रमण. गहरी अनुक्रमण इस कदम के रूप में इस तरह के तरीके के लिए आवश्यक नहीं है.
अनुरूपता निर्देशित मरम्मत (HDR)
इस प्रोटोकॉल के माध्यम से मध्यस्थता जीन पीटा ZFN NHEJ के लिए विधि प्रदान करता है. Transgenes के एकीकरण एक अनुरूपता हथियार के साथ प्लाज्मिड दाता का परिचय द्वारा भी आयोजित हो सकती है कि पार्श्व ZFN कटौती इस परिदृश्य में. साइट 11, ZFN बनाया डबल असहाय को तोड़ने के बजाय HDR NHEJ द्वारा मरम्मत की है. HDR मैं निर्देशन कियाtransgenes की ntegration इस प्रोटोकॉल भर में प्रदान की प्रक्रियाओं के लिए इसी तरह के तरीकों का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है.
समस्या निवारण
ZFNs की डिलिवरी
ZFN वितरण और अभिव्यक्ति वितरण GFP या अन्य इस तरह के दृश्य और / या quantitation के लिए प्लाज्मिड. की डिलीवरी के लिए नियंत्रित किया जा सकता है कम ब्याज की सेल प्रकार के साथ प्रमोटर असंगति के कारण अभिव्यक्ति mRNA के प्रारूप में ZFNs की डिलीवरी के द्वारा दूर किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, ठंड झटका विधि करने के लिए आगे कोशिकाओं में ZFNs की प्रभावकारिता बढ़ाने के लिए उपयोग किया जा सकता है 12. यदि mRNA के लिए प्रयोग किया जाता है यह जरूरी है कि कोशिकाओं को प्रसव के लिए पहले धो रहे हैं सुनिश्चित करने के सभी सीरम व्युत्पन्न Rnases हटा दिया गया है. बर्फ पर mRNA के पिघलना, और बहुत आखिरी पल में कोशिकाओं को जोड़ने के लिए गिरावट के लिए कोई मौका कम से कम यह भी समझदारी है.
Cel - मैं परख
Cel मैं Assa के नींवy ब्याज की बिन्दुपथ की विशिष्ट और पर्याप्त प्रवर्धन है. यदि गैर विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादों मनाया जाता है मानक पीसीआर समस्या निवारण प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए ऐसे टेम्पलेट राशि का अनुकूलन, प्राइमर एकाग्रता, और साइकिल चालन के मापदंडों के रूप में विशिष्टता वृद्धि. पृष्ठ विश्लेषण प्रदर्शन के रूप में मानक agarose वैद्युतकणसंचलन के लिए विरोध के रूप में उत्तरार्द्ध विधि पर्याप्त संकल्प और संवेदनशीलता प्रदान नहीं करता है. Cel मैं पचाने शर्तों को भी अगर कोई से पचा उत्पाद या अत्यधिक smearing मनाया जाता है अनुकूलित किया जा सकता है. Cel-1 nuclease और या पाचन समय की लंबाई / राशि का अनुमापन इन पहलुओं में सुधार करने के लिए में titrated किया जा सकता है.
Disclosures
शोधकर्ताओं ने मानक अनुसंधान लाइसेंस समझौते के तहत ZFN संशोधित कोशिकाओं या जानवरों सहयोगियों को प्रदान कर सकते हैं. इस परिस्थिति में सिग्मा पूछता है कि एक सामग्री हस्तांतरण समझौते में सिग्मा, ZFN ग्राहक और उनके सहयोगी के बीच में डाल दिया है. : अनुसंधान लाइसेंस http://www.sigma.com/zfn देखा जा सकता है .
यदि वहाँ एक वाणिज्यिक ZFN संशोधित कोशिकाओं सिग्मा का उपयोग कर आवेदन के लिए एक संभावित है तो पूछता है कि एक वाणिज्यिक लाइसेंस जगह में डाल दिया है.
उत्पादन और इस लेख के लिए नि: शुल्क प्रवेश सिग्मा इंक द्वारा प्रायोजित है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease S (Cel-1 Enzyme) | Transgenomic | 706025 | |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche Group | 03 300 242 001 | |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza Inc. | VCA-1003 | |
| GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
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