Genoma Edición con CompoZr nucleasas de dedos de zinc personalizados (ZFNs)

Summary

El CompoZr personalizado nucleasa dedo de zinc (ZFN) Servicio permite la edición precisa en el genoma de cualquier organismo o línea celular en cualquier lugar definido por el usuario. En este artículo se describe el proceso para el diseño, fabricación, validación e implementación del Servicio de CompoZr ZFN personalizado.

Abstract

Genoma de edición es una potente técnica que puede utilizarse para dilucidar la función del gen y la base genética de la enfermedad. Gen tradicional de edición de métodos tales como la química basada en la mutagénesis aleatoria o la integración de secuencias de ADN confieren los cambios genéticos indiscriminados de una manera ineficiente en general y requerir la incorporación de secuencias sintéticas no deseados o el uso de aberrantes condiciones de cultivo, lo que podría confundir a los estudios biológicos. Por el contrario, la expresión transitoria ZFN en una célula puede facilitar precisa, heredable edición gen de una manera altamente eficiente sin la necesidad de administración de productos químicos o la integración de los transgenes sintéticos.

Nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) son enzimas que se unen y cortar secuencias diferentes de ADN de doble cadena (dsDNA). Una unidad funcional CompoZr ZFN consta de dos proteínas monoméricas individuales que se unen un ADN "medio-sitio" de aproximadamente 15-18 nucleótidos (ver Figura 1). Cuando dos ZFN monodores "casa" a sus lugares de destino adyacentes a los dominios de escisión del ADN-dímeros y crear un salto de doble cadena (DSB) en el ADN. ¹ Introducción de ZFN mediadas DSBs en el genoma establece una base para la edición de genoma altamente eficiente. Reparación imperfecta de DSBs en una celda a través de la de extremos no homólogos a participar (NHEJ) vía de reparación del ADN puede dar lugar a pequeñas inserciones y deleciones (indeles). Creación de indeles dentro de la secuencia del gen codificante de una célula puede resultar en marco de lectura y posterior nocaut funcional de un locus del gen en una alta eficiencia. ² Aunque este protocolo se describe el uso de ZFNs para crear un gen knockout, la integración de los transgenes también puede llevarse a cabo a través homología dirigida reparación en el sitio de corte ZFN.

El CompoZr personalizado ZFN servicio representa un enfoque sistemático, integral y bien caracterizado-en la edición dirigida de genes para la comunidad científica con la tecnología ZFN. Sigma científicos trabajan en estrecha colaboración con los investigadores a 1) perforaciónEl análisis rm debida diligencia incluye el análisis de la estructura del gen correspondiente, la biología, y el sistema de modelo de acuerdo con las metas del proyecto, 2) aplicar este conocimiento para desarrollar una buena estrategia dirigida, 3) a continuación, diseñar, construir, validar y funcionalmente ZFNs para la actividad en una importante la línea celular. El investigador recibe ADN genómico positivo control y cebadores, y listo para usar reactivos ZFN suministrados tanto en el ADN plásmido e in vitro formato ARNm transcrito. Estos reactivos pueden entonces ser entregado para la expresión transitoria en la línea celular del investigador o tipo de célula de elección. Las muestras se ensayan para la edición en el locus del gen de interés mediante técnicas estándar de biología molecular, incluyendo la amplificación por PCR, digestión enzimática, y la electroforesis. Después de señal positiva para la edición de gen se detecta en la población inicial, las células son de una sola célula clonado y genotipo para la identificación de clones mutantes o alelos.

Protocol

1. Custom ZFN Proceso de Diseño

1. Para acelerar el proceso de diseño ZFN, el investigador debe proporcionar:
• La información sobre el objetivo de genes tales como el nombre de genes, especies y el número de genes anotación / identificación.
• Un declaró claramente por encima de todo-objetivo del experimento (por ejemplo, o el golpe de gracia Knockin)
• Los factores específicos de la diana de genes que incluyen la estructura de genes atípica, biología especial implicado en el locus genético, o cualquier regiones homólogas de otras partes del genoma.
• La gama específica de la secuencia de ADN para el dedo de zinc nucleasas para apuntar.
2. El equipo de Sigma bioinformática lleva a cabo in silico de diseño para desarrollar ZFN iniciales de zinc sitios de destino de los dedos.
3. Iniciales de los sitios objetivo ZFN se proporcionan a un ZFN consultor técnico científico. Para los proyectos de mayor complejidad técnica, este científico Sigma trabaja con los investigadores para desarrollar la estrategia del proyecto.
4. Bioinformática ofrece los mejores sitios ZFN objetivo para el investigador para su revisión. Tras la aprobación de los lugares de destino potenciales ZFN, esta información se proporciona al equipo de producción ZFN para comenzar el proceso de fabricación ZFN.

2. Producción personalizada ZFN

1. El archivo de los módulos de Sigma dedo de zinc se utiliza para montar los diseños ZFN aprobados.
2. Cada diseño ZFN está montada y secuencia verificada sobre una plataforma de rendimiento clonación alta.
3. Una vez que la producción de todos los diseños ZFN se completa cada ZFN se envía a la validación.

3. Validación de ZFNs personalizados

1. ZFN proyectos enespecies humano, ratón, rata o CHO se validan en líneas celulares bien caracterizadas para cada especie, un ensayo basado en la levadura se utiliza para otros organismos o tipos de células.
2. Construcciones ZFN se entregan en la línea celular apropiada por nucleofection y los ZFNs expresan.
3. ADN se extrae de la piscina de las células transfectadas ZFN y la región de interés es amplificado por PCR.
4. El Cel-1 ensayo se llevó a cabo entonces en el producto de PCR. La electroforesis en gel se ejecuta en el Cel-1 ensayo a la actividad ZFN validado.
5. El diseño de la actividad más alta ZFN como se confirma por el ensayo de Cel-1 A continuación se proporcionan para el cliente. ZFNs son entregados en el ARNm y ADN plásmido junto con los cebadores de PCR para el ensayo de Cel-1 y ADN genómico como un control positivo.

4. La entrega de ZFNs Validado por nucleofection

1. Semillas de las células a una densidad de 2x10 ⁵ células / ml el día antes de nucleofection.
2. En el día de nucleofection,sacar Línea Celular nucleofector Kit V y deje calentar a temperatura ambiente.
3. Agregue el complemento de la solución nucleofection V de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4. Cuenta las células. La densidad celular debe estar entre 2,5-5x10 ⁵ células / ml.
5. Llenar una placa de 6 pocillos con 2 ml de medio en cada pocillo y se pre-calentamiento en una incubadora de CO ₂ a 37 ° C durante al menos 20 minutos antes de nucleofection.
6. Centrifugar 2x10 ⁶ células por transfección (8x10 ⁶ total) a 200xg durante 5 minutos.
7. Lavar las células dos veces con 20 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS).
8. Preparar los tubos experimentales: (véase el cuadro personalizado ZFN boletín técnico)
9. Retirar la placa de 6 pocillos que contienen los medios de comunicación desde el paso (6,5) de la incubadora.
10. Resuspender las células en 400 l (100 l / reacción) de la solución de nucleofection V.
11. Una reacción a la vez, añadir 100 ml de células para cada ADN o ARNm tubo que contiene. Transfer la mezcla a una cubeta de electroporación de 2 mm y nucleofect en un nucleofector con el programa apropiado.
12. Inmediatamente después de nucleofection de cada muestra, utiliza una pipeta para añadir ~ 500 l de medio precalentado de la placa 6-bien en el paso (6,9) a la cubeta. Entonces, cuidadosamente transferir las células de la cubeta para el medio restante precalentada en la placa de 6 pocillos.
13. Terminar todas las reacciones y devolver la placa de 6 pocillos a la incubadora de CO ₂ a 37 ° C.

5. La recolección de ADN genómico tras la entrega de ZFNs

1. 6-así placa - no recoger todas las células agrupadas. Es importante mantener la cultura a fin de que las células a solo clon de células de dilución después de confirmar que usted tiene productos Cel-1 digestión. De uno a tres días después de nucleofection recoger las células para preparar ADN cromosómico utilizando el ADN de mamífero genómico GenElute Miniprep kit.

6. Cel.-1 Ensayo

Amplificar por PCR del DNA genómico de las muestras de ZFN transfectadas y el ADN genómico de control positivo incluido en el kit, utilizando los cebadores suministrados. La reacción de PCR se configura con las siguientes condiciones: (véase el cuadro personalizado ZFN boletín técnico).

Para generar heterodúplex de los homodúplex PCR tomar 10 l de reacción de PCR de cada muestra ZFN trata además de un control y utilizar el siguiente programa en un termociclador:
95 ° C, 10 minutos
95 ° C a 85 ° C, -2 ° C / segundo
85 ° C a 25 ° C, -0,1 ° C / segundo
4 ° C, por tiempo indefinido

Añadir 1 l de potenciador y 1 l de nucleasa S (número de catálogo de Transgenomic 706.025) a cada reacción y se incuba a 42 ° C durante 20-40 minutos.

Ejecutar las digestiones en un 10% PAGE-TBE gel con marcadores adecuados, tales como escalera DirectLoad ADN WideRange (Número de catálogo D7058) (ver resultados en Custom ZFN boletín técnico).

Ence la señal positiva se ha detectado en ZFN tratados con las poblaciones por la CEL-I de ensayo, proceder al aislamiento y la caracterización clonal.

7. Aislamiento y caracterización de clones

1. De un solo clon de células de las muestras ZFN tratados por métodos estándar, incluyendo FACS y la clonación de dilución.
2. Permita que los clones para ampliar lo suficiente, a continuación, dividir una cierta proporción de las células para la cosecha de ADN genómico, congelando de nuevo el resto como material de bancos.
3. Amplificar el ADN genómico de los clones usando los cebadores Cel-I y analizar la amplificación por Cel-I de ensayo (con y sin ADN WT se disparó en), o, alternativamente, utilizar este amplicón de proceder directamente a la determinación del genotipo.
4. Genotipo clones candidatos identificados con alelos editados por el método preferido.

8. Los resultados representativos

Un ejemplo de la totalidad del flujo de trabajo CompoZr ZFN se presenta en la Figura 2. ZFNs se entregana las células donde se unen y escindir la secuencia de ADN adecuada que crea un salto de doble hebra (OSD). El proceso de reparación natural, de extremos no homólogos (NHEJ), reparaciones del OSD. En algunos casos los resultados aberrantes NHEJ en eliminación, inserción o sustitución de nucleótidos. Amplificación por PCR del DNA genómico cosechado resultados en la formación de heterodúplex entre el tipo salvaje y amplicones modificados después de la desnaturalización / hibridación paso de la reacción de PCR. La adición de los resultados de enzimas Cel-1 en la escisión de las moléculas heterodúplex. Cel-1 resultados se resuelven mediante el análisis PAGE para confirmar la escisión ZFN. Figura 3 proporciona una vista esquemática del ensayo Cel-1 y los resultados esperados.

Representativos Cel-1 resultados están contenidos en las figuras 4 y 5 Figura 4 contiene los resultados de un par muy activa de ZFNs (21%) en células K562;. Figura 5 contiene los resultados de un par menos activo (2,4%) de ZFNs enCélulas K562. Actividad ZFN se confirma en ambas figuras por la presencia de dos fragmentos de PCR por debajo del parental fragmento de PCR.

Figura 1. ZFNs Representación de los plazos nucleasas de dedos de zinc. Se han diseñado compuestos por proteínas dedo de zinc de unión al ADN de dominio fusionado al dominio de corte de la endonucleasa de restricción FokI. Cuando se une como un heterodímero, ZFNs crear un salto de doble cadena en una secuencia de ADN de usuario especificado.

Figura 2. Esquema del flujo de trabajo de servicio personalizado ZFN. Representación gráfica del flujo de trabajo para generar una línea de células modificadas genéticamente utilizando ZFNs CompoZr.

Figura 3. Esquema del ensayo Cel-1 y los resultados. A) ZFN plásmido o ARNm r es entregado a las células. B) Expresó unen ZFNs y cortar la secuencia objetivo la creación de una rotura de doble cadena (DSB) en una porción de las células. C) la reparación aberrante de algunos DSBs por no unirse a fin homóloga resultados en la inserción o deleción de nucleótidos. D) El ADN genómico se extrae de la piscina de las células transfectadas y amplificada en el locus de interés. FE) del producto de PCR se desnaturaliza y se re-creación de recocido formación de heterodúplex entre el tipo salvaje y amplicones modificados. G) Los Cel-1 desajuste los resultados del ensayo de endonucleasas en la escisión de las moléculas heterodúplex. H) Cel-1 enzima digiere se resuelven por PAGE. La relación observada de producto de escisión a la banda parenteral, determinado por el software ImageJ, indica la fracción de corte y la eficiencia de los ZFNs.

Figura 4. Cel-1 los resultados de ZFNs 21% activos de software ImageJ está disponible en:._blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Figura 5. Cel-1 los resultados de un 2,4% ZFNs activos de software ImageJ está disponible en:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .

Discussion

Una vez modificados ZFN células son aisladas tienen permanente y hereditaria modificaciones del ADN. Esto da como resultado la capacidad de generar líneas de células establemente modificados o animales de raza con modificaciones genéticas deseadas para llevar a cabo la investigación. CompoZr ZFNs personalizados proporcionan un método robusto para el genoma de edición en una amplia variedad de tipos de células. La publicación del genoma de la edición con éxito ZFNs incluye pero no se limita a las líneas celulares humanas, ratón, rata, el pez cebra, la rana, porcina y los modelos de CHO de investigación. ^{3,4,5,6,7,8,9} La capacidad de crear un bicatenario descanso en el sitio diana deseado en el tipo de célula especificada está asegurada cuando los ZFNs están debidamente entregado en una celda. También es posible realizar secuenciales modificaciones dedos de zinc a una celda con el fin de tener más de una modificación genética dentro de una célula. ¹⁰ La capacidad de seleccionar una secuencia diana específica y sólo modificar ese locus particular, es una causa principal de la capacidad de crear múltiples modificacionescationes.

El certificado de ZFN CompoZr personalizado de análisis se genera con los reactivos mismos incluidos en el kit asegurando así que todos los componentes del kit han sido ampliamente validado para el éxito del cliente. Los pasos críticos del flujo de trabajo de principio a fin se presentan a continuación:

Clonación celular

La capacidad de aislar y expandir una línea celular determinada debe ser probado antes de comenzar cualquier experimento ZFN. Las células individuales deben ser aislados y ampliado para garantizar que una población clonal derivado es posible. Algunas líneas celulares son recalcitrantes en esta materia, y los trucos como el enriquecimiento de los clones editados, o cultura con los medios de comunicación acondicionado pueden ayudar a superar estos retos.

Entrega la eficiencia

Optimización de la eficiencia en la entrega es una necesidad antes de la entrega de los ZFNs. Muchos métodos se pueden utilizar como base de lípidos de la transfección, electroporación, y nucleofectisucesivamente. El método de entrega ideal se compone de un que permite la mezcla óptima de la eficacia del suministro y la supervivencia celular. La cuantificación de estas eficiencias se puede estimar mediante la entrega de un control de plásmido GFP y cuantificar mediante inspección visual o FACS 24-48hrs después de la entrega.

Cel-I de ensayo

Es imperativo que Cel-I ensayo se realiza en paralelo con los controles adecuados para asegurar que los parámetros de PCR, la digestión y electroforesis no interfiera con la interpretación de experimento ZFN. Cada kit incluye control de ADN genómico que se utiliza para crear la imagen de Cel-I en el certificado de análisis. La amplificación del ADN con los cebadores de control previstas seguidas por Cel-I del ensayo le permitirá al usuario comparar los resultados con lo establecido en el Certificado de Análisis (COFA) de la imagen, y aislar los posibles ineficiencias en este aspecto de un experimento. Un adecuado control negativo, como una maqueta, o las buenas prácticas agrarias de células tratadasmuestra también deben ser incluidos para permitir la elucidación de los productos de escisión no específicos.

Cualitativa / cuantitativa de análisis de una sola célula de los clones

Después del tratamiento ZFN y la clonación de células individuales, las poblaciones de células pueden ser examinados para la edición en el locus de interés por un número de métodos. Cel.-I ensayo puede llevarse a cabo en el ADN genómico a partir de clones con el fin de identificar clones candidatos para el genotipado adicional. Es importante espiga WT amplificación de PCR en los amplicones de muestra en una proporción de 1:1 antes de realizar la Cel-I digerir como clones mutantes homocigóticas contendrá moléculas homogéneas, y por lo tanto transmitir una negativa Cel-I ensayo resultado. Un método alternativo para la detección de estos clones candidatos es diseñar un cebador de PCR aterrizaje directamente en el sitio de destino ZFN. Usado en conjunción con uno de los cebadores de control, un resultado del ensayo negativo indica una pérdida de la secuencia de WT. Un clon heterocigoto que contiene al menos un alelo WT na suield PCR señal, pero pueden estar separados de los clones completamente WT mediante la realización de la PCR en el contexto de SYBR qPCR.

Una vez que los clones candidatos han sido identificados por los métodos anteriores, se pueden genotipo por pirosecuenciación estándar, la secuenciación de profundidad, u otros métodos de secuenciación. Para todos los métodos de secuenciación, una amplicón creado a partir del ADN genómico clonal debe ser generada. Para alelos pirosecuenciación tradicionales pueden estar separados por TA-clonación del producto de PCR y secuenciación de las colonias individuales. Para los métodos tales como la secuenciación profunda este paso no es necesario.

Homología Dirigida Reparación (IDH)

Este protocolo proporciona el método de octavos de final ZFN génica mediada a través de NHEJ. La integración de los transgenes también puede llevarse a cabo mediante la introducción de un plásmido donante con los brazos de homología que flanquean un sitio de corte ZFN. ¹¹ En este escenario, el ZFN creó doble cadena rotura sea reparada por el Informe sobre Desarrollo Humano en lugar de NHEJ. Informe sobre Desarrollo Humano que dirigentegración de transgenes puede ser confirmado mediante métodos similares a los procedimientos establecidos a través de este protocolo.

Solución de problemas

La entrega de ZFNs

La entrega ZFN y la expresión de entrega-puede ser controlada por la entrega de un GFP o cualquier otro plásmido para la visualización y / o cuantificación. Bajo la expresión debido a la incompatibilidad promotor con el tipo de células de interés puede ser superado por la entrega de ZFNs en formato ARNm. Además, el método del choque en frío puede ser utilizada para aumentar aún más la eficacia de ZFNs en las células. ¹² Si se utiliza ARNm es imperativo que las células se lavan antes de la entrega para asegurar que todos RNasas suero derivados se han eliminado. También es prudente que se descongele el ARNm en el hielo, y añadir el que las células en el último momento para minimizar el riesgo de la degradación.

Cel-I de ensayo

La fundación de la ASSA Cel-Iy es la amplificación específica y amplia del locus de interés. Si no específicos productos de amplificación se observan uso estándar de los procedimientos de solución de PCR para aumentar la especificidad como la optimización de la cantidad de plantilla, la concentración de iniciador, y el ciclo de los parámetros. Realizar análisis PAGE en oposición a electroforesis en agarosa estándar como el último método no proporciona una resolución adecuada y sensibilidad. Cel.-I Condiciones digerir también puede optimizarse si ningún producto digerido o manchas excesiva que se observa. La valoración de la cantidad de Cel-1 nucleasa y / o la duración del tiempo de digestión se pueden valorar para mejorar estos aspectos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease S (Cel-1 Enzyme)	Transgenomic	706025
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	03 300 242 001
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza Inc.	VCA-1003
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit	Sigma-Aldrich	NA0400