Genome Editing con nucleasi zinco Finger CompoZr personalizzati (ZFNs)

Summary

Il CompoZr personalizzati a dita di zinco nucleasi (ZFN) Service consente editing preciso genoma in qualsiasi organismo o linea cellulare in qualsiasi luogo definito dall'utente. Questo articolo descrive il processo per la progettazione, produzione, validazione e implementazione del Servizio CompoZr personalizzato ZFN.

Abstract

Genome editing è una tecnica potente che può essere utilizzata per delucidare funzione genica e la base genetica della malattia. Gene modifica i metodi tradizionali come i prodotti chimici a base di mutagenesi o l'integrazione casuale di sequenze di DNA conferiscono indiscriminati cambiamenti genetici in maniera globale inefficiente e richiedono integrazione di indesiderabili sequenze sintetiche o l'uso di aberranti condizioni di coltura, potenzialmente confondibili studio biologico. Per contro, l'espressione transiente ZFN in una cellula può facilitare preciso, ereditabile editing gene in maniera altamente efficiente senza la necessità per la somministrazione di sostanze chimiche o integrazione di transgeni sintetici.

Nucleasi dito di zinco (ZFNs) sono enzimi che si legano e tagliare le sequenze distinte di DNA a doppio filamento (dsDNA). Una unità funzionale CompoZr ZFN consiste di due singole proteine ​​monomeriche che legano un DNA "half-site" di circa 15-18 nucleotidi (vedi Figura 1). Quando due ZFN monomers "casa" ai loro siti bersaglio adiacenti i DNA-scissione domini dimerizzano e creare una rottura a doppio filamento (DSB) nel DNA. ¹ Introduzione di ZFN-mediate DSB nel genoma costituisce il fondamento per la modifica del genoma altamente efficiente. Imperfect riparazione di DSB in una cella attraverso il non-omologa end-joining (NHEJ) pathway di riparazione del DNA può portare a piccole inserzioni e delezioni (indels). Creazione di indels all'interno della sequenza del gene codificante di una cellula può provocare frameshift e successiva knockout funzionale di un locus genico ad alta efficienza. ² Durante questo protocollo descrive l'uso di ZFNs per creare un gene knockout, l'integrazione di transgeni può anche essere effettuata tramite omologia-diretto di riparazione presso il sito di taglio ZFN.

Il CompoZr personalizzato ZFN Servizio rappresenta un approccio sistematico, completo e ben caratterizzato per l'editing genica mirata per la comunità scientifica con la tecnologia ZFN. Sigma scienziati lavorano a stretto contatto con gli investigatori a 1) perform l'analisi di due diligence compresa l'analisi della struttura del gene corrispondente, la biologia, e il sistema del modello conformemente agli obiettivi del progetto, 2) applicare questa conoscenza per sviluppare una buona strategia di targeting, 3) poi progettare, costruire, validare e funzionalmente ZFNs per l'attività in una rilevante linea cellulare. L'investigatore riceve positivo DNA genomico di controllo e primer, e pronto per l'uso ZFN reagenti forniti sia DNA plasmide e in-vitro formato mRNA trascritto. Questi reagenti possono poi essere consegnati per l'espressione transiente nella linea cellulare del ricercatore o tipo di cellula di scelta. I campioni vengono poi testati per la modifica genetica al locus di interesse mediante le normali tecniche di biologia molecolare tra cui PCR, digestione enzimatica ed elettroforesi. Dopo segnale positivo per l'editing gene viene rilevato nella popolazione iniziale, le cellule sono unicellulare clonato e genotipizzati per l'identificazione di cloni mutanti / alleli.

Protocol

1. Personalizzato ZFN Process Design

1. Per accelerare il processo di ZFN design, un investigatore dovrebbe fornire:
• Informazioni sul gene bersaglio come il nome del gene, specie, e gene annotazione / numero di identificazione.
• Un chiaramente over-all obiettivo dell'esperimento (ad esempio, Knockout o Knockin)
• Eventuali fattori specifici del gene bersaglio che comprendono struttura atipica gene, biologia speciale implicato nel locus genetico, o qualsiasi regioni omologhe in altre regioni del genoma.
• La gamma specifica di sequenza di DNA per il dito di zinco nucleasi di destinazione.
2. La squadra Sigma bioinformatica conduce nel design silico ZFN di sviluppare iniziali di zinco siti bersaglio delle dita.
3. Iniziali siti bersaglio ZFN sono prestati ad una ZFN consulente scientifico tecnico. Per i progetti tecnicamente più complessi, questo scienziato Sigma collabora con gli inquirenti per sviluppare la strategia del progetto.
4. Bioinformatica fornisce i migliori siti bersaglio ZFN al ricercatore per la revisione. Dopo l'approvazione dei siti potenziali destinatari ZFN, questa informazione viene fornita al team di produzione ZFN per iniziare il processo di fabbricazione ZFN.

2. Personalizzato ZFN Produzione

1. L'archivio dei moduli Sigma dita di zinco è usata per assemblare i disegni ZFN approvati.
2. Ogni disegno ZFN è assemblato e la sequenza verificato su una piattaforma alta clonazione throughput.
3. Una volta che la produzione di tutti i disegni ZFN è completare ogni ZFN viene inviato alla validazione.

3. Validazione dei ZFNs personalizzati

1. Progetti in ZFNspecie umana, topo, ratto o CHO sono validati nelle linee di cellule ben caratterizzati per ciascuna specie, un saggio a base di lievito viene usato per altri organismi o tipi cellulari.
2. Costrutti ZFN vengono erogati nella linea cellulare appropriata nucleofection e le ZFNs sono espressi.
3. DNA viene raccolto dal pool di cellule trasfettate ZFN e la regione di interesse è amplificato mediante PCR.
4. Il-1 Cel saggio viene quindi effettuata sul prodotto PCR. Elettroforesi su gel viene eseguito sul test-1 Cel all'attività ZFN convalidato.
5. Il disegno più alto ZFN attività come confermato dal Cel-1 test viene quindi fornito al cliente. ZFNs vengono consegnati in mRNA e DNA plasmidico con primer PCR per l'Cel-1 saggio e DNA genomico come controllo positivo.

4. Consegna dei ZFNs convalidati da Nucleofection

1. Seme le cellule ad una densità di 2x10 ⁵ cellule / ml il giorno prima nucleofection.
2. Il giorno di nucleofection,estrarre cellule Linea Nucleofector Kit V e lasciare calda a temperatura ambiente.
3. Aggiungere il supplemento al Nucleofection Solution V secondo il protocollo del produttore.
4. Contare le celle. Densità cellulare dovrebbe essere tra 2,5-5x10 ⁵ cellule / ml.
5. Riempire una piastra da 6 pozzetti con 2 ml di mezzo in ciascun pozzetto e pre-riscaldare in un incubatore a CO ₂ 37 ° C per almeno 20 minuti prima nucleofection.
6. Centrifugare 2x10 ⁶ cellule per trasfezione (8x10 ⁶ totale) a 200xg per 5 minuti.
7. Lavare le cellule due volte con 20 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS).
8. Preparare le provette sperimentali: (vedi tabella in Custom ZFN bollettino tecnico)
9. Rimuovere la piastra da 6 pozzetti contenente supporti dal punto (6,5) da incubatrice.
10. Risospendere le cellule in 400 pl (100 pl / reazione) di soluzione Nucleofection V.
11. Una reazione alla volta, aggiungere 100 microlitri di cellule di ciascun DNA o mRNA contenente tubo. Trasfer la miscela ad una elettroporazione 2 millimetri cuvette e nucleofect su un Nucleofector con il programma appropriato.
12. Subito dopo nucleofection di ciascun campione, con una pipetta di trasferimento per aggiungere ~ 500 microlitri di terreno preriscaldata dalla piastra da 6 pozzetti in fase (6,9) nella cuvetta. Quindi, trasferire accuratamente le cellule dalla cuvetta al mezzo rimanente preriscaldata nella piastra da 6 pozzetti.
13. Fine tutte le reazioni e restituire la piastra da 6 pozzetti per la CO ₂ incubatore a 37 ° C.

5. Raccolta DNA genomico dopo la consegna del ZFNs

1. Piastra da 6 pozzetti - non raccogliere tutte le celle pool. E 'importante mantenere la cultura in modo da avere le celle a singolo clone di diluizione cella dopo aver confermato di avere Cel-1 digestione prodotti. Da uno a tre giorni dopo nucleofection raccogliere le cellule per preparare il DNA cromosomico con il GenElute mammiferi DNA genomico Kit Miniprep.

6. Cel-1 test

PCR amplificare il DNA genomico nei campioni di ZFN trasfettate e il positivo DNA genomico di controllo fornito nel kit, utilizzando i primer forniti. La reazione PCR è impostato con le seguenti condizioni: (vedi tabella in Custom ZFN bollettino tecnico).

Per generare eteroduplex dai homoduplexes PCR prendono 10 microlitri di reazione PCR di ogni campione ZFN trattato più il controllo e utilizzare il seguente programma in un termociclatore:
95 ° C, 10 minuti
95 ° C a 85 ° C, -2 ° C / secondo
85 ° C a 25 ° C, -0,1 ° C / secondo
4 ° C, indefinitamente

Aggiungere 1 ml di enhancer e 1 ml di nucleasi S (dal numero di catalogo Transgenomic 706.025) ad ogni reazione e incubare a 42 ° C per 20-40 minuti.

Eseguire le digestioni su un 10% di PAGE-TBE gel con marcatori adeguati, come ad esempio DNA Ladder DirectLoad widerange (Numero di catalogo D7058) (vedere i risultati in bollettino personalizzato ZFN tecnico).

Suce segnale positivo è stato rilevato in ZFN trattati con le popolazioni di cel-I test, procedere all'isolamento e alla caratterizzazione clonale.

7. Isolamento e caratterizzazione di cloni

1. Single-cell clonare i ZFN trattati con campioni con metodi standard, tra cui FACS e la clonazione di diluizione.
2. Lasciare i cloni di espandersi a sufficienza, quindi dividere una certa proporzione di cellule per il raccolto DNA genomico, il congelamento indietro il resto come materiale sopraelevata.
3. Amplificare il DNA genomico dai cloni usando i Cel-I primer e analizzare l'amplicone di Cel-I test (con e senza DNA WT diluiti in), oppure utilizzare questa amplicone di procedere direttamente genotipizzazione.
4. Cloni candidati genotipo identificata come avente alleli cura il metodo preferito.

8. Risultati rappresentativi

Un esempio di tutta CompoZr ZFN flusso è presentata in Figura 2. ZFNs vengono consegnatialle cellule dove si legano e si unirà la sequenza corretta di DNA che crea una rottura a doppio filamento (DSB). Il processo di riparazione naturale, non omologhe fine unione (NHEJ), ripara il DSB. In alcune istanze aberranti risultati NHEJ a delezione, inserzione o sostituzione di nucleotidi. Amplificazione PCR del DNA genomico risultati raccolti nella formazione eteroduplex tra wild type e ampliconi modificati dopo la denaturazione / fase di ricottura della reazione PCR. Aggiunta dei Cel-1 risultati enzimatiche nella scissione di eventuali molecole eteroduplici. Cel-1 risultati vengono risolti mediante analisi PAGE per confermare clivaggio ZFN. Figura 3 fornisce una schematica del saggio Cel-1 ed i risultati attesi.

Rappresentative Cel-1 risultati sono contenuti nelle figure 4 e 5 Figura 4 contiene i risultati di una coppia molto attiva di ZFNs (21%) in cellule K562;. Figura 5 contiene i risultati di una coppia meno attivo (2,4%) di ZFNs inK562. Attività ZFN è confermato in entrambe le figure dalla presenza di due frammenti di PCR sotto il frammento di PCR parentale.

Figura 1. ZFNs rappresentazione delle nucleasi associati dito di zinco. Sono progettati proteine ​​costituite da un dito di zinco DNA-binding dominio fuse al dominio di clivaggio della endonucleasi di restrizione FokI. Quando è legato come un eterodimero, ZFNs creare un doppio filamento pausa una specifica sequenza di DNA utente.

Figura 2. Schema del flusso di lavoro personalizzato Servizio ZFN. Rappresentazione grafica del flusso di lavoro per generare una linea di cellule geneticamente modificate usando ZFNs CompoZr.

Figura 3. Schematica del Cel-1 test e risultati. A) ZFN plasmide o mRNA r è consegnato alle cellule. B) Espressa bind ZFNs e tagliare la loro sequenza bersaglio creando una rottura a doppio filamento (DSB) in una porzione di cellule. C) la riparazione aberrante di alcuni DSB da parte di non-omologa finiscono entrare risultati in nucleotide inserimento o la cancellazione. D) Il DNA genomico viene raccolto dal pool di cellule transfettate e amplificato a livello del locus di interesse. EF) PCR prodotto è denaturato e ri-creando la formazione di ricotta heteroduplex tra wild type e ampliconi modificati. G) I Cel-1 di mismatch tra le endonucleasi di risultati del test in scissione delle molecole eteroduplici. H) Cel-1 enzima digerisce vengono risolti PAGE. Il rapporto osservato del prodotto di scissione a banda parenterale, determinato da ImageJ software, indica il taglio frazione e l'efficienza dei ZFNs.

Figura 4. Cel-1 risultati dal 21% ZFNs attivi software ImageJ è disponibile all'indirizzo:._blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Figura 5. Cel-1 risultati dal 2,4% ZFNs attivi software ImageJ è disponibile all'indirizzo:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .

Discussion

Una volta ZFN modificati cellule sono isolate hanno permanenti e modificazioni ereditabili del DNA. Il risultato è la capacità di generare linee cellulari stabilmente modificati o di animali di razza con desiderati modificazioni genetiche per condurre una ricerca. CompoZr ZFNs personalizzati fornire un metodo efficace per la modifica del genoma in un'ampia varietà di tipi cellulari. Pubblicazione del genoma successo editing con ZFNs include ma non si limita a linee cellulari umane, topo, ratto, zebrafish, rana, suini e modelli di ricerca CHO. ^{3,4,5,6,7,8,9} La possibilità di creare un doppio filamento pausa al sito bersaglio desiderato nel tipo cellulare specificato è garantita quando le ZFNs siano correttamente consegnato in una cellula. È anche possibile eseguire sequenziali modifiche zinc finger a una cella in modo da avere più di una modificazione genetica all'interno di una cellula. ¹⁰ La possibilità di selezionare una specifica sequenza bersaglio e modificare solo che locus particolare, è una causa principale per la capacità di creare più modificationi.

Il CompoZr personalizzata certificato ZFN di analisi è generato con i reagenti stessi forniti nel kit assicurando così che tutti i componenti del kit sono stati accuratamente convalidato per il successo del cliente. Passaggi critici del flusso di lavoro dall'inizio alla fine sono presentati qui di seguito:

Cella clonazione

La capacità di isolare ed espandere una linea cellulare dato dovrebbe essere testato prima di iniziare qualsiasi esperimento ZFN. Cellule singole devono essere isolate ed espanse per assicurare che un derivato clonale popolazione è possibile. Alcune linee cellulari sono recalcitranti in questa materia, e trucchi, come arricchimento per i cloni modificati, o cultura con mezzi condizionati può aiutare a superare queste sfide.

Consegna l'efficienza

Ottimizzazione dell'efficienza di consegna è un must prima della consegna delle ZFNs. Molti metodi possono essere usati anche a base lipidica trasfezione, elettroporazione, e nucleofectisul. Il metodo di consegna ideale consiste di una miscela che offre la più ottimale di efficacia di somministrazione e la sopravvivenza cellulare. Quantificare tali incrementi di efficienza può essere stimata, fornendo un controllo GFP plasmide e quantificare mediante ispezione visiva o FACS 24-48 ore post-parto.

Cel-I test

È indispensabile che Cel-I test viene eseguito in parallelo con gli opportuni controlli per assicurare che i parametri di PCR, la digestione, e elettroforesi non interferire con l'interpretazione di ZFN dell'esperimento. Ogni kit comprende il DNA genomico di controllo che viene utilizzato per creare il Cel-I immagine nel certificato di analisi. Amplificazione dal DNA di controllo con i primers fornite seguiti da Cel-I test permetterà all'utente di confrontare i risultati con quanto previsto nel certificato di analisi (COFA) di immagini, e isolare eventuali inefficienze potenziali in questo aspetto di un esperimento. Un controllo adeguato negativo, come una finta, o GFP trattati cellularecampione devono essere inclusi anche per consentire chiarimento di eventuali prodotti non specifici scissione.

Qualitativa / Analisi quantitativa di singoli cloni di cellule

Dopo il trattamento ZFN e clonazione singola cellula, le popolazioni di cellule possono essere sottoposti a screening per la modifica al locus di interesse da un certo numero di metodi. Cel-I test può essere effettuata su DNA genomico da cloni allo scopo di identificare cloni candidati per la genotipizzazione ulteriore. È importante amplicone spike WT PCR nelle ampliconi campione in un rapporto 1:1 prima di eseguire la Cel-I digerire cloni mutanti omozigoti conterrà molecole omogenee, e quindi trasmettere un negativo Cel-I test risultato. Un metodo alternativo per lo screening di questi cloni candidati è quello di progettare un atterraggio di PCR direttamente sul sito bersaglio ZFN. Usato in combinazione con uno dei primer di controllo, un risultato negativo saggio indica la perdita della sequenza WT. Un clone eterozigote contenente almeno un allele WT sarà aySUL POSTO PCR segnale, ma possono essere separati dai cloni completamente WT eseguendo la PCR nel contesto di SYBR qPCR.

Una volta cloni candidati sono stati identificati con i metodi di cui sopra, possono essere genotipizzati mediante pirosequenziamento standard, sequenziamento profondo, o altri metodi di sequenziamento. Per tutti i metodi di sequenziamento, un amplicone creato dal DNA genomico clonale deve essere generata. Per alleli pirosequenziamento tradizionali possono essere separati da TA-clonaggio del prodotto di PCR e sequenziamento le colonie individuali. Per i metodi di sequenziamento profondo come questo passaggio non è necessario.

Omologia Repair Regia (HDR)

Questo protocollo fornisce il metodo per knockout gene ZFN via mediata NHEJ. L'integrazione dei transgeni possono anche essere condotte mediante l'introduzione di un donatore plasmide con le braccia di omologia che fiancheggiano un sito di taglio ZFN ^11. In questo scenario, il ZFN creato a doppio filamento pausa è riparato da HDR, invece di NHEJ. HDR ho direttontegrazione dei transgeni può essere confermata con metodi simili alle procedure previste in questo protocollo.

Risoluzione dei problemi

Consegna dei ZFNs

ZFN consegna e di espressione-delivery può essere controllato dalla consegna di una GFP o di altra natura plasmide per la visualizzazione e / o la quantificazione. Bassa espressione a causa di incompatibilità promotore con il tipo cellulare di interesse possono essere superate con la consegna di ZFNs in formato mRNA. Inoltre, il metodo urto a freddo può essere utilizzato per aumentare ulteriormente l'efficacia di ZFNs nelle cellule. MRNA ¹² Se viene utilizzato è imperativo che le cellule sono lavate prima della consegna per garantire che tutti siero-RNasi derivati ​​sono stati rimossi. E 'anche prudente per scongelare il mRNA su ghiaccio, e aggiungere il che le celle a l'ultimo momento per ridurre al minimo ogni possibilità di degrado.

Cel-I test

La fondazione del Cel-I ASSAy è amplificazione specifica e ampia del locus di interesse. Se non specifici prodotti di amplificazione sono stati osservati utilizzare PCR standard delle procedure di risoluzione dei problemi per aumentare la specificità come l'ottimizzazione della quantità template, concentrazione dei primer, e il ciclismo parametri. Eseguire analisi PAGE rispetto a standard di agarosio come quest'ultimo metodo non fornisce adeguata risoluzione e la sensibilità. Cel-I Condizioni digest può anche essere ottimizzata se nessun prodotto digerito o sbavature eccessive si osserva. Titolazione della quantità di Cel-1 nucleasi e / o la lunghezza del tempo di digestione può essere titolati per migliorare questi aspetti.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease S (Cel-1 Enzyme)	Transgenomic	706025
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	03 300 242 001
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza Inc.	VCA-1003
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit	Sigma-Aldrich	NA0400