Genome Editing mit CompoZr Benutzerdefinierte Zinkfinger Nukleasen (ZFNs)

Summary

Die CompoZr Benutzerdefinierte Zinkfinger-Nuclease (ZFN) Service ermöglicht die präzise Bearbeitung Genoms in jedem Organismus oder einer Zelllinie an jedem Ort durch den Anwender definiert. Dieser Artikel beschreibt das Verfahren für die Konstruktion, Herstellung, Prüfung und Umsetzung der CompoZr Benutzerdefinierte ZFN-Service.

Abstract

Genome-Bearbeitung ist eine leistungsfähige Technik, die verwendet werden, um Genfunktionen und den genetischen Grundlagen von Erkrankungen aufklären können. Traditionelle Gen Bearbeitungsmethoden wie chemisch-basierten Mutagenese oder zufällige Integration von DNA-Sequenzen übertragen wahllosen genetischen Veränderungen in einer allgemeinen ineffizient und erfordern Einbau von unerwünschten oder synthetische Sequenzen mit aberranter Kulturbedingungen, möglicherweise verwirrend biologische Studie. Im Gegensatz dazu können transiente ZFN Expression in einer Zelle ermöglichen präzise, ​​vererbbare Gen-Bearbeitung in sehr effizienter Weise ohne die Notwendigkeit für die Verwaltung von Chemikalien oder die Integration von synthetischen Transgene.

Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) sind Enzyme, die binden und schneiden verschiedene Sequenzen der doppelsträngigen DNA (dsDNA). Eine funktionale CompoZr ZFN Gerät besteht aus zwei einzelnen monomeren Proteine, die eine DNA "half-site" binden von ca. 15-18 Nukleotiden (siehe Abbildung 1). Wenn zwei ZFN MonoMers "nach Hause" zu ihren benachbarten Zielstellen die DNA-Spaltung Domänen dimerisieren und erstellen Sie ein Doppel-(DSB) in der DNA. ¹ Einführung von ZFN-vermittelte DSBs im Genom wird die Grundlage für hocheffiziente Genom-Bearbeitung. Imperfect Reparatur von DSB in einer Zelle über die nicht-homologen Ende (NHEJ) DNA-Reparaturwegs in kleine Insertionen und Deletionen (indels) führen. Erstellung der indels innerhalb des Gens kodierende Sequenz von einer Zelle in Leserasters nachfolgenden funktionellen Knockout eines Genlocus mit hoher Effizienz. ² ergeben Während dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von ZFNs, ein Gen-Knockout erstellen, Integration von Transgenen kann auch über durchgeführt werden Homologie-gerichteten Reparatur an der ZFN Schnitt vor Ort.

Die CompoZr Benutzerdefinierte ZFN-Service stellt eine systematische, umfassende und gut charakterisierten Ansatz zur gezielten Gen-Bearbeitung für die wissenschaftliche Gemeinschaft mit ZFN Technologie. Sigma Forscher arbeiten eng mit den Ermittlern zu 1) perform Due-Diligence-Analyse einschließlich der Analyse der relevanten Gen-Struktur, Biologie und Modell-System gemäß den Projektzielen, 2) wenden dieses Wissen auf eine solide Targeting-Strategie, 3 entwickeln), dann planen, bauen, und funktionell zu validieren ZFNs für Aktivität in einer entsprechenden Zelllinie. Der Prüfer erhält positive Kontrolle genomischer DNA und Primer, und ready-to-use ZFN Reagenzien sowohl in Plasmid-DNA und in-vitro-transkribierten mRNA-Format geliefert. Diese Reagenzien können dann für die transiente Expression in des Ermittlers Zelllinie oder Zelltyp der Wahl geliefert werden. Die Proben werden dann für die Gen-Bearbeitung an dem Ort von Interesse durch molekularbiologische Standardtechniken, einschließlich PCR-Amplifikation, enzymatischen Verdau und Elektrophorese getestet. Nach dem positiven Signal für die Gen-Editing in der Anfangsphase Bevölkerung erkannt wird, sind Single-Cell-Zellen geklont und genotypisiert zur Identifizierung von Mutanten-Klone / Allele.

Protocol

1. Benutzerdefinierte ZFN Design Process

1. Um die ZFN Design Prozess zu beschleunigen, sollte ein Ermittler stellen:
• Informationen über das Ziel-Gen wie dem Gen-Namen, Arten und Gene Annotation / Identifikationsnummer.
• Ein klar gesagt über-all Ziel des Experiments (zB Knockout oder Knockin)
• Alle spezifischen Faktoren des Gens Ziel, das atypische Gen Aufbau, spezielle Biologie in der Genort verwickelt, oder keine homologen Regionen anderer Stelle im Genom enthalten.
• Das spezifische DNA-Sequenz für die Zinkfinger-Nucleasen zum Ziel.
2. Die Sigma Bioinformatik Team führt in silico Design zum ersten ZFN Zinkfinger Zielorten zu entwickeln.
3. Erste ZFN Zielorten an eine ZFN wissenschaftlichen technischer Berater zur Verfügung gestellt. Für weitere technisch komplexen Projekten arbeitet diese Sigma Wissenschaftler mit den Ermittlern, um das Projekt zu entwickeln.
4. Bioinformatik bietet die Top-ZFN Zielorten an die Ermittler für Kritik. Nach der Freigabe der potentielle ZFN Zielstellen, wird diese Information an die ZFN Produktionsteam vorgesehen, um die ZFN Herstellungsverfahren beginnen.

2. Benutzerdefinierte ZFN Produktion

1. Die Sigma-Archiv von Zink-Finger-Module verwendet, die zugelassenen ZFN Designs montieren.
2. Jedes Design ZFN montiert und Sequenz auf einem hohen Durchsatz Klonen Plattform verifiziert.
3. Sobald die Produktion aller ZFN Designs abgeschlossen ist, wird jede ZFN wird zur Validierung geschickt.

3. Validierung von Custom ZFNs

1. ZFN Projekte invon Mensch, Maus, Ratte oder CHO-Spezies in gut charakterisierten Zelllinien für jede Art validiert werden, wird ein Hefe-basierten Assays für andere Organismen oder Zelltypen verwendet.
2. ZFN Konstrukte werden in den entsprechenden Zelllinie durch Nukleofektion geliefert und die ZFNs ausgedrückt werden.
3. DNA wird aus dem Pool von ZFN transfizierten Zellen geerntet und die Region von Interesse PCR-amplifiziert.
4. Die Cel-1-Assay wird dann auf der PCR-Produkt durchgeführt. Die Gelelektrophorese basiert auf der Cel-1-Assay zu validieren ZFN Aktivität ausgeführt werden.
5. Die höchste Aktivität ZFN Design bestätigt durch die Cel-1-Assay wird dann an den Kunden. ZFNs sind in mRNA und Plasmid-DNA mit PCR-Primer für die Cel-1-Assay und genomische DNA als eine positive Kontrolle geliefert.

4. Lieferung von Validated ZFNs durch Nukleofektion

1. Samen der Zellen bei einer Dichte von 2x10 ⁵ Zellen / ml am Tag vor Nukleofektion.
2. Am Tag der Nukleofektion,nehmen Cell Line Nucleofector Kit V und lassen auf Raumtemperatur erwärmt.
3. Fügen Sie die Ergänzung des Nucleofection Lösung V nach dem Protokoll des Herstellers.
4. Zählen Sie die Zellen. Die Zelldichte sollte zwischen 2,5-5x10 ⁵ Zellen / ml liegen.
5. In eine Platte mit 6 Vertiefungen mit 2 ml des Mediums in jeder Vertiefung und Vorwärmen in einem CO _2-Inkubator bei 37 ° C für mindestens 20 Minuten vor Nukleofektion.
6. Zentrifuge 2x10 ⁶ Zellen pro Transfektion (8x10 ⁶ insgesamt) bei 200xg für 5 Minuten.
7. Waschen der Zellen zweimal mit 20 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
8. Bereiten experimentellen Röhren: (siehe Tabelle in Custom ZFN Technical Bulletin)
9. Entfernen Sie die 6-Well-Platte mit Medien aus Schritt (6,5) aus Inkubator.
10. Die Zellen in 400 ul (100 ul / Reaktion) von Nucleofection Lösung V.
11. Eine Reaktion zu einer Zeit, werden 100 ul Zellen zu jeder DNA oder mRNA-haltigen Rohr. Transfer das Gemisch auf eine 2 mm Elektroporationsküvette und nucleofect auf einem Nucleofector mit einem geeigneten Programm.
12. Unmittelbar nach Nukleofektion jeder Probe, Hilfe einer Pipette auf ~ 500 pl vorgewärmtem Medium aus der 6-Well-Platte in Schritt (6.9) hinzufügen, um die Küvette. Dann transferieren Sie Zellen aus der Küvette mit dem übrigen vorgewärmtem Medium in der 6-Well-Platte.
13. Beende alle Reaktionen und senden Sie das 6-Well-Platte auf die CO _2-Inkubator bei 37 ° C

5. Ernte genomische DNA nach Lieferung der ZFNs

1. 6-Well-Platte - nicht ernten all der gepoolten Zellen. Es ist wichtig, um die Kultur zu erhalten, um Zellen zu einzelnen Zelle Verdünnung Klon haben, nachdem Sie, dass Sie Cel-1 Verdauung Produkte zu bestätigen. Ein bis drei Tage nach Nukleofektion Sammeln der Zellen chromosomale DNA herzustellen mit der GenElute Säuger genomische DNA-Miniprep-Kit.

6. Cel-1-Test

PCR-Amplifikation der genomischen DNA aus den Proben ZFN transfizierten und der positiven Kontrolle genomischer DNA mit dem Kit mitgeliefert, mit den mitgelieferten Primer. (Siehe Tabelle in Custom ZFN Technical Bulletin): Die PCR-Reaktion wird mit den folgenden Bedingungen eingestellt.

Um Heteroduplexe aus den PCR-Homoduplexe generieren nehmen 10 ul PCR-Reaktion aus jeder ZFN behandelten Probe zuzüglich der Kontrolle und verwenden Sie das folgende Programm auf einem Thermocycler:
95 ° C, 10 Minuten
95 ° C bis 85 ° C, 2 ° C / Sekunde
85 ° C bis 25 ° C, -0,1 ° C / Sekunde
4 ° C, auf unbestimmte Zeit

Fügen Sie 1 ul-Enhancer und 1 ul Nuclease S (ab Transgenomic Katalognummer 706025) zu jeder Reaktion und inkubieren bei 42 ° C für 20-40 Minuten.

Führen Sie die Aufschlüsse auf einem 10% PAGE-TBE-Gel mit der richtigen Marker wie DirectLoad WideRange DNA-Leiter (Katalognummer D7058) (siehe Ergebnisse in Custom ZFN Technical Bulletin).

Aufce positives Signal in ZFN-behandelten Population wurde durch Cel-I-Test nachgewiesen, um klonale Isolierung und Charakterisierung fort.

7. Klonale Isolierung und Charakterisierung

1. Einzel-Zell-Klon die ZFN-behandelten Proben mittels Standardverfahren einschließlich FACS und Verdünnungsklonierung.
2. Lassen Sie die Klone, um ausreichend zu erweitern, dann spalten gewissen Anteil an Zellen für genomische DNA Ernte, Einfrieren wieder den Rest als überhöhte Material.
3. Verstärken genomische DNA aus den Klonen unter Verwendung der Primer Cel-I und Analyse der Fragments durch Cel-I-Assay (mit und ohne WT DNA versetzt in), oder alternativ diese Amplikon, direkt zum Genotypisierung.
4. Genotyp Kandidaten-Klone als mit bearbeitet Allele durch das bevorzugte Verfahren identifiziert.

8. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel des gesamten CompoZr ZFN Workflow ist in 2 dargestellt. ZFNs geliefertdie Zellen, wo sie binden und zu spalten die entsprechende DNA-Sequenz, die eine Doppel-(DSB) erstellt. Die natürliche Reparatur-Prozess, nicht-homologe Endverbindung (NHEJ), repariert die DSB. In einigen Fällen aberrante NHEJ kommt es zur Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden. PCR-Amplifikation von genomischer DNA geerntet Ergebnisse in Heteroduplex-Bildung zwischen Wildtyp und modifiziert Amplikons nach der Denaturierung / Annealing-Schritts der PCR-Reaktion. Die Zugabe der Cel-1-Enzym zur Spaltung keine Heteroduplexmoleküle. Cel-1 Ergebnisse werden durch PAGE-Analyse gelöst zu ZFN Spaltung zu bestätigen. Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung des Cel-1-Test und der erwarteten Ergebnisse.

Repräsentative Cel-1 Ergebnisse sind in den 4 und 5 enthalten Abbildung 4 enthält aus einer sehr aktiven Paar ZFNs (21%) in K562-Zellen;. Abbildung 5 enthält die Ergebnisse von einer weniger aktiven Paar (2,4%) der ZFNs inK562-Zellen. ZFN-Aktivität ist in beiden Figuren durch die Anwesenheit von zwei PCR-Fragmente unter der elterlichen PCR-Fragment bestätigt.

Abbildung 1. Darstellung der gebundenen Zink-Finger-Nukleasen. ZFNs sind Proteine ​​einer Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, fusioniert an die Spaltdomäne des FokI-Restriktionsendonuklease umfasst entwickelt. Wenn als ein Heterodimer gebunden ist, zu schaffen ZFNs eine doppelsträngige Pause zu einer vom Benutzer angegebenen DNA-Sequenz.

Abbildung 2. Schematische Darstellung des benutzerdefinierten ZFN Service-Workflow. Grafische Darstellung der Workflow um einen gentechnisch veränderten Zelllinie unter Verwendung CompoZr ZFNs generieren.

Abbildung 3. Schematische Darstellung des Cel-1-Test und die Ergebnisse. A) ZFN Plasmid-o r mRNA an Zellen geliefert. B) ausgedrückt ZFNs binden und schneiden sich Zielsequenz, eine doppelte (DSB) in einem Teil der Zellen. C) aberrante Reparatur von einigen DSBs durch nicht-homologe Endverknüpfung Ergebnisse in der Nucleotid-Insertion oder Deletion. D) Genomische DNA wird aus dem Pool von transfizierten Zellen geerntet und verstärkt an der Stelle von Interesse. EF) PCR-Produkt wird denaturiert und erneut geglüht schaffen Heteroduplexbildung zwischen Wildtyp und modifiziert Amplikons. G) Die Cel-1 Fehlpaarungsendonuclease Assay zur Spaltung von Heteroduplex-Moleküle. H) Cel-1-Enzym verdaut werden durch PAGE aufgelöst. Das beobachtete Verhältnis von Spaltprodukt auf eine parenterale Band, das von ImageJ Software bestimmt, zeigt die Fraktion Schnitt und die Effizienz der ZFNs.

Abbildung 4. Cel-1 ergibt sich aus 21% aktiven ZFNs ImageJ Software finden Sie unter.:_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Abbildung 5. Cel-1 ergibt sich aus 2,4% aktive ZFNs ImageJ Software ist verfügbar unter:. http://rsbweb.nih.gov/ij/ .

Discussion

Sobald ZFN-modifizierten Zellen werden isoliert haben sie dauerhafte und vererbbare Änderungen der DNA. Daraus ergibt sich die Möglichkeit, stabil veränderte Zelllinien oder Zuchttiere mit gewünschten genetischen Veränderungen zu erzeugen, um Forschung zu betreiben. CompoZr Benutzerdefinierte ZFNs bieten eine robuste Methode zur Genom-Bearbeitung in einer Vielzahl von Zelltypen. Veröffentlichung der erfolgreichen Bearbeitung mit ZFNs Genom beinhaltet, ist aber nicht zu humanen Zelllinien, Maus, Ratte, Zebrafisch, Frosch-, Schweine-und CHO-Forschung Modelle beschränkt. ^{3,4,5,6,7,8,9} die Möglichkeit, eine zu erstellen doppelsträngigen Bruch an der gewünschten Zielstelle in der angegebenen Zelltyp ist gewährleistet, wenn die ZFNs ordnungsgemäß in eine Zelle abgegeben werden. Es ist auch möglich, sequentielle Zink-Finger-Modifikationen zu einer Zelle durchzuführen, um mehr als eine genetische Veränderung innerhalb einer Zelle zu haben. ^10. Die Fähigkeit, eine spezifische Ziel-Sequenz wählen und nur zu modifizieren, dass bestimmten Locus ist eine der Hauptursachen für die Fähigkeit, mehrere erstellen ModifikationenKationen.

Die CompoZr Benutzerdefinierte ZFN Zertifikat von Analyse wird mit den sehr Reagenzien im Kit wodurch sichergestellt, dass alle Komponenten des Kits sind sorgfältig den Erfolg unserer Kunden bestätigt vorausgesetzt generiert. Kritische Schritte des Workflows von Anfang bis Ende sind nachfolgend dargestellt:

Zellklonierung

Die Fähigkeit zu isolieren und zu erweitern eine bestimmte Zelllinie sollten vor Beginn jeder ZFN getestet werden. Einzelne Zellen zu isolieren und erweitert werden, um sicherzustellen, dass ein klonal abgeleitete Bevölkerung möglich ist. Manche Zelllinien sind in dieser Angelegenheit widerspenstigen und Tricks wie Bereicherung für Klone bearbeitet oder Kultur mit konditionierten Medien können helfen, diese Herausforderungen zu meistern.

Liefer-Effizienz

Optimierung der Lieferzeiten Effizienz ist ein Muss vor der Lieferung der ZFNs. Es können viele Verfahren, einschließlich Lipid-basierte Transfektion, Elektroporation und nucleofecti verwendet werdenauf. Die ideale Lieferung Methode besteht darin, eine, die die optimale Mischung aus Effizienz und Lieferung das Überleben der Zelle liefert. Quantifizieren diese Effizienz kann durch die Bereitstellung einer GFP-Kontroll-Plasmid und zur quantitativen Bestimmung durch visuelle Inspektion oder FACS 24 48 Stunden nach der Lieferung geschätzt werden.

Cel-I-Test

Es ist zwingend notwendig, dass Cel-I-Test parallel mit den entsprechenden Kontrollen durchgeführt, um sicherzustellen, dass PCR, Verdauung und Elektrophorese-Parameter werden nicht mit der Interpretation von ZFN Experiment stören. Jedes Kit beinhaltet Kontrolle genomischer DNA, mit der die Cel-I-Bild in der Bescheinigung über die Analyse zu erstellen. Verstärkung aus der Kontroll-DNA mit den mitgelieferten Primer durch Cel-I-Test gefolgt wird dem Benutzer erlauben, die Ergebnisse mit, dass in dem Certificate of Analysis (CofA) Bild zu vergleichen, und zu isolieren, mögliche Ineffizienzen in diesem Aspekt eines Experiments. Eine entsprechende negative Kontrolle z. B. irreführende oder GFP behandelten ZelleProbe sollte ebenfalls enthalten, um Aufklärung über alle nicht-spezifische Spaltung Erzeugnisse zu ermöglichen.

Qualitative / Quantitative Analyse von Einzel-Zell-Klone

Nach ZFN Behandlung und Einzelzell-Klonierung, können die Populationen von Zellen für die Bearbeitung an dem Ort von Interesse durch eine Anzahl von Verfahren gescreent werden. Cel-I-Assay kann mit genomischer DNA von Klonen werden zum Zwecke der Identifizierung von Kandidaten-Klone für weitere Genotypisierung durchgeführt. Es ist wichtig, Spike WT PCR-Fragments in die Probe Amplikons im Verhältnis 1:1 vor der Durchführung der Cel-I verdauen als homozygot mutierten Klone homogene Moleküle enthalten wird, zu vermitteln und damit einen negativen Cel-I-Test Ergebnis. Ein alternatives Verfahren zum Screening von Kandidaten-Klone diese ist, um einen PCR-Primer Landung direkt auf der ZFN Zielstelle zu entwerfen. In Verbindung mit einem der Kontroll-Primer, zeigt ein negatives Ergebnis Ergebnis Verlust des WT-Sequenz. Eine heterozygote Klon, enthaltend mindestens eine WT-Allel yield PCR-Signal, sondern kann aus vollständig WT Klone durch die Durchführung der PCR im Zusammenhang mit SYBR qPCR getrennt werden.

Sobald Kandidaten-Klone durch die obigen Verfahren identifiziert wurden, können sie durch Standard-Pyrosequenzierung, tief-Sequenzierung oder anderen Sequenzierverfahren genotypisiert werden. Für alle Sequenzierungsmethoden, sollte ein Fragment aus der genomischen DNA klonale erstellt generiert werden. Für traditionelle Pyrosequenzierung Allele können durch TA-Klonierung der PCR-Produkt getrennt werden, und Sequenzierung der einzelnen Kolonien. Für Methoden, wie tief die Sequenzierung dieser Schritt ist nicht erforderlich.

Homologie Regie Repair (HDR)

Dieses Protokoll bietet die Methode für die ZFN vermittelte Gen-Knockout über NHEJ. Integration von Transgenen kann auch durch Einführung eines Donor-Plasmids mit Homologiearme durchgeführt werden, die Flanke eine ZFN Schnitt Seite. ^11. In diesem Szenario wird das ZFN erstellt doppelsträngigen Pause von HDR anstelle von NHEJ repariert wird. HDR gerichtet integration von Transgenen kann bestätigt mit ähnlichen Methoden auf die Verfahren in diesem Protokoll zur Verfügung gestellt werden.

Fehlerbehebung

Lieferung von ZFNs

ZFN Lieferung und Ausdruck-Lieferung können durch Lieferung einer GFP oder andere solche Plasmid für die Visualisierung und / oder die Quantifizierung. Gesteuert werden Niedrige Expression aufgrund Promoter Inkompatibilität mit dem Zelltyp von Interesse können durch Zustellung ZFNs in mRNA-Format überwunden werden. Darüber hinaus kann die Kälte-Schock-Methode verwendet werden, um weiteren Erhöhung der Wirksamkeit von ZFNs in Zellen. ^12. Wenn mRNA verwendet wird es unerlässlich, dass die Zellen vor der Lieferung gewaschen, um sicherzustellen, dass alle aus Serum stammender RNasen wurden entfernt wird. Es ist auch klug, um die mRNA auf Eis auftauen, und fügen Sie es zu den Zellen im allerletzten Moment eine Chance für den Abbau zu minimieren.

Cel-I-Test

Die Gründung der Cel-I ASSAy ist spezifisch und ausreichend Verstärkung des Locus von Interesse. Wenn nicht-spezifische Amplifikationsprodukte beobachtet werden verwenden Standard-PCR-Verfahren zur Problembehandlung, um die Spezifität wie Optimierung der Vorlage Betrag, Primer-Konzentration, und Radfahren Parameter zu erhöhen. Führen Sie PAGE-Analyse als Standard zu Agaroseelektrophorese entgegengesetzt, wie das letztgenannte Verfahren keine ausreichende Auflösung und Empfindlichkeit. Cel-I-Digest Bedingungen können auch optimiert werden, wenn nicht verdaute Produkt oder übermäßigen Schlieren beobachtet werden. Titration der Menge an Cel-1-Nuclease und / oder Länge der Kochzeit kann titriert werden, um diese Aspekte zu verbessern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease S (Cel-1 Enzyme)	Transgenomic	706025
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	03 300 242 001
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza Inc.	VCA-1003
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit	Sigma-Aldrich	NA0400