Genome redigering med CompoZr anpassade nukleaser zink finger (ZFNs)

Summary

Den CompoZr anpassad Zink-finger nukleas (ZFN) service möjliggör exakt genomet redigering i någon organism eller cellinje som helst ställe som definieras av användaren. Den här artikeln beskriver processen för konstruktion, tillverkning, validering och genomförande av CompoZr Custom ZFN Service.

Abstract

Genomet redigering är en kraftfull teknik som kan användas för att belysa genfunktion och den genetiska grunden för sjukdomen. Traditionell gen redigera metoder såsom kemisk-baserade mutagenes eller slumpvis integrering av DNA-sekvenser ge urskillningslösa genetiska förändringar i en övergripande ineffektivt sätt och kräver införande av oönskade syntetiska sekvenser eller användning av avvikande odlingsbetingelser, potentiellt förvirrande biologiska studier. Däremot kan övergående ZFN uttryck i en cell underlätta exakt, ärftliga genen redigering på ett mycket effektivt sätt utan behov för administration av kemikalier eller integrering av syntetiska transgener.

Zinkfinger nukleaser (ZFNs) är enzymer som binder och skars distinkta sekvenser av dubbelsträngat DNA (dsDNA). En funktionell CompoZr ZFN består av två individuella monomera proteiner som binder en DNA "halv-site" på ca 15-18 nukleotider (se figur 1). När två ZFN monomers "hem" till sina intilliggande målställen de DNA-klyvnings domäner dimerisera och skapar en dubbel-sträng paus (DSB) i DNA. ¹ Införande av ZFN-medierade DSB i genomet lägger en grund för högeffektiv genomet redigering. Ofullkomlig reparation av DSB i en cell via den icke-homologa ände-sammanfogning (NHEJ) DNA-reparationsvägen kan resultera i små insättningar och deletioner (indels). Skapande av indels inom genen kodande sekvensen av en cell kan resultera i ramskifte och efterföljande funktionella knockout av en gen lokus med hög effektivitet. ² Även om detta protokoll beskriver användningen av ZFNs att skapa en gen-knockout, integrering av transgener kan även genomföras via homologi-riktat reparation vid ZFN snittet webbplatsen.

Den CompoZr Custom ZFN service är en systematisk, omfattande och väl karakteriserade inställning till riktade gen redigering för det vetenskapliga samfundet med ZFN teknik. Sigma forskarna ett nära samarbete med utredare att 1) ​​perforeradrm due diligence analyser inklusive analys av relevant genstruktur, biologi och modellsystem i enlighet med projektmålen, 2) tillämpa denna kunskap för att utveckla en sund inriktning strategi 3) sedan utforma, bygga och funktionellt validera ZFNs för aktivitet i en relevant cellinje. Utredaren får positiva DNA-kontroll genomiska och primers och redo att använda ZFN reagenser som levereras i både plasmid-DNA och in-vitro transkriberat mRNA-format. Dessa reagens kan sedan levereras för transient expression i utredarens cellinje eller celltyp som väljs. Proverna testas sedan för gen redigering vid platsen för intresse genom vanliga molekylärbiologiska tekniker, inklusive PCR-amplifiering, enzymatiska digestiv, och elektrofores. Efter positiv signal för genen redigering detekteras i den initiala populationen, celler är encelliga klonats och genotypas för identifiering av mutanta kloner / alleler.

Protocol

1. Anpassad ZFN Design Process

1. För att påskynda ZFN designprocessen, bör en utredare ge:
• Information om den sökta genen såsom genen namn, arter, och genen annotering / identifikationsnummer.
• En tydligt över-hela syftet med försöket (t.ex. Knockout eller Knockin)
• Några särskilda faktorer i genen mål som inkluderar atypiska genstruktur, speciellt biologi inblandad i det genetiska lokus, eller några homologa regioner i andra delar av genomet.
• Den specifika urval av DNA-sekvensen för zinkfinger nukleaser att rikta.
2. Sigma bioinformatik Teamet bedriver in silico ZFN design utveckla ett första zink webbplatser finger mål.
3. Initiala ZFN målställen ges till en ZFN vetenskaplig teknisk konsult. För mer tekniskt komplexa projekt, fungerar detta Sigma vetenskapsman med utredarna att utveckla projektet strategin.
4. Bioinformatik ger de bästa platserna ZFN målet till utredaren för granskning. Efter godkännande av potentiella platser ZFN mål är denna information till ZFN produktionsteamet för att påbörja ZFN tillverkningsprocessen.

2. Anpassad ZFN Produktion

1. Sigma arkiv av zinkfinger moduler används för att montera de godkända ZFN mönster.
2. Varje ZFN design monterad och sekvensverifierades på en hög genomströmning kloning plattform.
3. När produktionen av alla ZFN konstruktioner slutföra alla ZFN skickas till validering.

3. Validering av Custom ZFNs

1. ZFN projekt imänniska, mus, råtta eller CHO arter har validerats i väl karaktäriserade cellinjer för varje art, är en jäst baserad analys som används för andra organismer eller celltyper.
2. ZFN konstruktioner levereras i lämplig cellinje genom nucleofection och ZFNs uttrycks.
3. DNA skördas från poolen av ZFN transfekterade celler och i regionen av intresse är PCR-amplifieras.
4. Den Cel-1-analys utförs sedan på PCR-produkten. Gelelektrofores körs på Cel-1-analys av godkänd ZFN aktivitet.
5. Den högsta aktiviteten ZFN konstruktion som bekräftats genom Cel-1-analys tillhandahålls sedan till kunden. ZFNs levereras i mRNA och plasmid-DNA tillsammans med PCR-primrar för den Cel-1-analys och genom-DNA som en positiv kontroll.

4. Leverans av validerade ZFNs med Nucleofection

1. Frö cellerna vid en densitet av 2x10 ⁵ celler per ml dagen före nucleofection.
2. På dagen för nucleofection,ta Cellinje Nucleofector Kit V och låt värmas till rumstemperatur.
3. Lägg till tillägget till Nucleofection Lösning V enligt tillverkarens protokoll.
4. Räkna cellerna. Celldensitet bör vara mellan 2,5-5x10 ⁵ celler per ml.
5. Fylla en 6-brunnars platta med 2 ml av mediet i varje brunn och förvärma i en _CO2 inkubator vid 37 ° C under minst 20 minuter före nucleofection.
6. Centrifugera 2x10 ⁶ celler per transfektion (8x10 ⁶ totalt) vid 200xg i 5 minuter.
7. Tvätta celler två gånger med 20 ml av Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
8. Förbered experimentella rör: (se tabell i Anpassad ZFN Technical Bulletin)
9. Avlägsna 6-brunnsplatta innehållande media från steg (6,5) från inkubatorn.
10. Återsuspendera cellerna i 400 | il (100 | il / reaktion) av Nucleofection lösning V.
11. En reaktion vid en tidpunkt, tillsätt 100 | il av celler till varje DNA-eller mRNA-innehållande rör. TransfER blandningen till en 2 mm elektroporering kyvett och nucleofect på en Nucleofector med ett lämpligt program.
12. Omedelbart efter nucleofection av varje prov, använda en överföringspipett att lägga ~ 500 | il av förvärmt medium från 6-brunnsplatta i steg (6,9) till kuvetten. Därefter försiktigt överföra celler från kyvetten till den återstående förvärmt medium i 6-brunnars platta.
13. Avsluta alla reaktioner och för att återställa 6-brunnsplatta med _CO2 inkubator vid 37 ° C.

5. Skörd Genomiskt DNA efter leverans av ZFNs

1. 6-brunnars platta - inte skörda alla poolade cellerna. Det är viktigt att bibehålla kulturen för att få celler till en enda cell utspädning klon när du har bekräftat att du har Cel-1 matsmältning produkter. En till tre dagar efter nucleofection samla upp cellerna för att framställa kromosomalt DNA med användning av GenElute genomiska däggdjurs-DNA Miniprep Kit.

6. Cel-1-analys

PCR-amplifiera genom-DNA från de transfekterade ZFN prover och den positiva kontrollen genomiskt DNA tillhandahålls i kitet, använda de medföljande primrar. PCR-reaktionen sätts upp med följande villkor: (se tabellen i anpassad ZFN Technical Bulletin).

För att generera heteroduplex från PCR homoduplex tar 10 pl PCR-reaktionen från varje behandlat ZFN prov plus kontrollen och använda följande program på en termocykler:
95 ° C, 10 minuter
95 ° C till 85 ° C, -2 ° C / sekund
85 ° C till 25 ° C, -0,1 ° C / sekund
4 ° C, under obegränsad tid

Tillsätt 1 pl av förstärkare och 1 | il av nukleas S (från Transgenomic katalognummer 706.025) till varje reaktion och inkubera vid 42 ° C under 20-40 minuter.

Köra digereringar på en 10% PAGE-TBE-gel med lämpliga markörer, såsom DirectLoad WideRange DNA-stege (katalognummer D7058) (se resultat i anpassad ZFN Technical Bulletin).

Påce positiv signal har detekterats i ZFN behandlade populationer med cel-I analysen, gå vidare till klonal isolering och karakterisering.

7. Klonal Isolering och karakterisering

1. Encelliga klona ZFN-behandlade proverna med standardmetoder inkluderande FACS och utspädning kloning.
2. Låt klonerna att expandera tillräckligt, sedan upp en viss del av celler för DNA skörd, frysning tillbaka resten som bankas material.
3. Amplifiera genom-DNA från klonerna med användning av de Cel-I-primers och analysera produkten genom Cel-I-analysen (med och utan WT DNA spetsades i), eller alternativt använda denna amplikon att fortsätta direkt till genotypning.
4. Genotyp kandidatkloner identifierats ha redigerade alleler av den föredragna metoden.

8. Representativa resultat

Ett exempel på hela CompoZr ZFN arbetsflöde presenteras i figur 2. ZFNs levererastill celler där de binder och klyver den lämpliga DNA-sekvensen som skapar en dubbelsträngad avbrott (DSB). Den naturliga reparationsprocessen, icke-homologa slut gå (NHEJ), reparationer DSB. I vissa fall avvikande NHEJ resulterar i deletion, insertion eller substitution av nukleotider. PCR-amplifiering av skördade genomiska DNA resulterar i heteroduplexbildning mellan vildtyp och modifierade amplikoner efter denaturering / hybridisering steget av PCR-reaktionen. Tillsatsen av Cel-1-enzymet resulterar i klyvning av någon heteroduplexmolekyler. Cel-1 resulterar löses genom PAGE-analys för att bekräfta ZFN klyvning. Tillhandahåller en schematisk bild av den Cel-1-analys och de förväntade resultaten Figur 3.

Representativa Cel-1 Resultaten anges i figurerna 4 och 5 Figur 4 innehåller resultaten från en mycket aktiv par ZFNs (21%) i K562-celler;. Figur 5 innehåller resultat från en mindre aktiv par (2,4%) av ZFNs iK562-celler. ZFN aktivitet bekräftas i båda figurerna genom närvaron av två PCR-fragmenten under det parentala PCR-fragmentet.

Figur 1. Representation av bundna nukleaser zinkfinger. ZFNs är konstruerade proteiner bestående av en zinkfinger-DNA-bindande domän smält till klyvning domänen av Fokl restriktionsendonukleas. När den är bunden som en heterodimer, ZFNs skapa en dubbelsträngad paus på en användare specificerad DNA-sekvens.

Figur 2. Schematisk bild av Custom ZFN Tjänsten Workflow. Grafisk representation av arbetsflödet för att skapa en genetiskt modifierad cellinje med CompoZr ZFNs.

Figur 3. Schematisk av Cel-1-analys och resultat. A) ZFN plasmid o r-mRNA levereras till celler. B) Uttryckt ZFNs binder och minska deras målsekvens skapa en dubbelsträngad brott (DSB) i en portion av cellerna. C) avvikande reparation av vissa DSB av icke-homologa slut gå resulterar i nukleotid insättning eller borttagning. D) Genom-DNA skördas från den transfekterade pool av celler och amplifierades på stället av intresse. EF) PCR-produkt är denaturerat och åter glödgades skapa heteroduplexbildning mellan vildtyp-och modifierade amplikoner. G) De Cel-1 obalans endonukleas analysresultat i klyvning av hetero molekyler. H) Cel-1-enzymet klyvningar löses med PAGE. Det observerade förhållandet av spjälkningsprodukt med parenteral bandet, som bestäms av ImageJ mjukvara, anger fraktionen skurna och effektiviteten hos de ZFNs.

Figur 4. Cel-1 resultat från 21% aktiva ZFNs ImageJ mjukvara finns på.:_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Figur 5. Cel-1 resultat från 2,4% aktiva ZFNs ImageJ mjukvara finns tillgänglig på:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .

Discussion

Once ZFN modifierade celler isolerade de har permanenta och ärftliga DNA ändringar. Detta resulterar i förmågan att generera stabilt modifierade cellinjer eller djur föder upp med önskade genetiska modifieringar att bedriva forskning. CompoZr anpassade ZFNs tillhandahålla en robust metod för genomet redigering i en mängd olika celltyper. Publicering av framgångsrika genomet redigering med ZFNs inkluderar men är inte begränsat till humana cellinjer, mus, råtta, zebrafisk, groda, gris och CHO modellerna forskning. ^{3,4,5,6,7,8,9} Förmågan att skapa en dubbelsträngad paus vid det önskade målstället i den angivna celltypen säkerställes när ZFNs korrekt levereras in i en cell. Det är också möjligt att utföra sekventiella ändringar zink finger till en cell för att få mer än en genetisk modifiering i en cell. ¹⁰ Möjligheten att välja en specifik sekvens och bara ändra just den platsen är en primär orsak till förmågan att skapa flera modifikatjoner.

Den CompoZr Custom ZFN intyg analys genereras med de allra reagenser som finns i satsen vilket garanterar att alla komponenter i satsen grundligt har validerats för kunden framgång. Kritiska steg i arbetsflödet från början till slut presenteras nedan:

Cellkloning

Förmågan att isolera och expandera en given cellinje testas innan några ZFN experiment. Enstaka celler skall isoleras och expanderas för att säkerställa att en klonalt-härledd populationen är möjlig. Vissa cellinjer är motsträviga i denna fråga, och tricks som berikande för redigerade kloner eller kultur med konditionerade medier kan bidra till att övervinna dessa utmaningar.

Avgivningseffektivitet

Optimering av leverans effektivitet är ett måste innan leverans av ZFNs. Många metoder kan användas, inklusive lipidbaserad transfektion, elektroporering, och nucleofectividare. Den ideala leveransmetod består av en som ger den mest optimala blandningen av leverans effektivitet och cellöverlevnad. Kvantifiering dessa effektivitetsvinster kan uppskattas genom att leverera en GFP kontroll plasmid och kvantifiering genom visuell inspektion eller FACS 24-48 timmar efter leverans.

Cel-I-analysen

Det är viktigt att Cel-I analysen utförs parallellt med lämpliga kontroller för att säkerställa att PCR, matsmältning, och elektrofores parametrar som inte kommer att störa tolkningen av ZFN experiment. Varje kit innehåller kontroll DNA som används för att skapa Cel-I bild i intyget om analysen. Förstärkning från kontrollen DNA med de medföljande primers följt av Cel-I analysen gör det möjligt för användaren att jämföra resultaten med uppgifterna i intyget om Analysis (CofA) bild, och isolera eventuella ineffektivitet i denna aspekt av ett experiment. En lämplig negativ kontroll t.ex. en falsk, eller GFP behandlade cellenProvet bör också inkluderas för att medge belysning av eventuella icke-specifika spjälkningsprodukter.

Kvalitativ / Kvantitativ analys av enkel-cellkloner

Efter ZFN behandling och enskild cell kloning kan populationer av celler screenas för redigering på stället av intresse genom ett antal metoder. Cel-I-analysen kan utföras på genomiskt DNA från kloner för att identifiera kandidat-kloner för ytterligare genotypning. Det är viktigt att spetsen WT PCR-amplikon i provet amplikonema vid ett 1:1-förhållande innan du utför Cel-I smälta som homozygot mutant kloner kommer att innehålla homogena molekyler och därmed förmedla en negativ Cel-I analysresultatet. En alternativ metod för screening av dessa kandidatkloner är att utforma en PCR-primer landning direkt på ZFN målstället. Användas tillsammans med en av kontrollgrupperna primrar, indikerar en negativ analys, följd förlust av WT-sekvensen. En heterozygot klon som innehåller minst en WT-allelen kommer att yield PCR-signal, men kan vara skilda från helt WT kloner genom att utföra PCR i samband med SYBR qPCR.

När kandidatkloner har identifierats av ovanstående metoder kan de genotypas av standard Pyrosequencing, djup sekvensering, eller andra metoder sekvensering. För alla sekvenseringsmetoder, bör en amplikon som skapats från den klonala genomiskt DNA genereras. För traditionella Pyrosequencings alleler kan vara åtskilda av TA-kloning av PCR-produkten och sekvensering av individuella kolonier. För metoder, t ex djup-sekvensering detta steg är inte nödvändigt.

Homologi Riktad Repair (HDR)

Detta protokoll ger metoden för ZFN medierad gen knockout via NHEJ. Integration av transgener kan också genomföras genom införande av en donator plasmid med homologi armar som flankerar en ZFN snitt webbplats. ¹¹ I detta scenario skapade ZFN dubbelsträngade paus repareras av HDR i stället för NHEJ. HDRn riktad iIntegrationen av transgener kan bekräftas med liknande metoder med de förfaranden som hela detta protokoll.

Felsökning

Leverans av ZFNs

ZFN leverans och uttryck-avgivning kan kontrolleras genom att tillhandahålla en GFP eller annan sådan plasmid för visualisering och / eller kvantifiering. Lågt uttryck på grund av promotorn oförenlighet med cellen typ av intresse kan övervinnas genom leverans av ZFNs i mRNA-format. Dessutom kan köldchock metoden användas för att ytterligare öka effekten av ZFNs i celler. ¹² Om mRNA används är det viktigt att celler tvättas innan leverans för att säkerställa alla serumhärlett RNaser har tagits bort. Det är också klokt att tina mRNA på is, och lägg till den till cellerna vid den allra sista stund för att minimera alla chanser för nedbrytning.

Cel-I-analysen

Grunden för Cel-I assay är specifik och gott förstärkning av orten av intresse. Om icke-specifika PCR-produkterna iakttas använda vanliga PCR felsökning för att öka specificiteten som optimering av mall beloppet, primer koncentration, och cykling parametrar. Gör PAGE-analys i motsats till standard agaroselektrofores som senare metoden inte ger tillräcklig upplösning och känslighet. Cel-I smälta tillstånd kan också optimeras om ingen ned produkten eller smet observeras. Titrering av mängden Cel-1-nukleas och / eller längden av koktiden kan titreras för att förbättra dessa aspekter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease S (Cel-1 Enzyme)	Transgenomic	706025
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	03 300 242 001
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza Inc.	VCA-1003
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit	Sigma-Aldrich	NA0400