Genoom bewerken met CompoZr Custom Zinc Finger Nucleasen (ZFNs)

Summary

De CompoZr Custom Zink-vinger Nuclease (ZFN) Service maakt een nauwkeurige genoom bewerken in een organisme of cel lijn op elk locus bepaald door de gebruiker. In dit artikel beschrijft het proces voor het ontwerp, de fabricage, validatie en implementatie van de CompoZr Custom ZFN Service.

Abstract

Genoom bewerken is een krachtige techniek die kan worden gebruikt om genfunctie en de genetische basis van ziekte te verduidelijken. Traditionele gen het bewerken van methoden, zoals de chemische-based mutagenese of random integratie van DNA-sequenties kennen willekeurige genetische veranderingen in een algemeen inefficiënte manier en vereisen integratie van ongewenste synthetische sequenties of het gebruik van afwijkende cultuur voorwaarden, mogelijk verwarrende biologische studie. Daarentegen kan kortstondige ZFN expressie in een cel het nauwkeurig, erfelijke gen bewerking op zeer efficiënte wijze zonder toediening van stoffen of integratie van synthetische transgenen.

Zinkvinger nucleasen (ZFNs) zijn enzymen die binden en snijd verschillende sequenties van dubbelstrengs DNA (dsDNA). Een functionele CompoZr ZFN unit bestaat uit twee individuele monomere proteïnen die een DNA "half-site" binden van ongeveer 15 tot 18 nucleotiden (zie figuur 1). Wanneer twee ZFN monoMers "home" om hun aangrenzende doelsites het DNA-splitsing domeinen dimeriseren en maak een dubbelstrengs breuken (DSB) in het DNA. ¹ Inleiding van ZFN-gemedieerde DSB's in het genoom legt een basis voor zeer efficiënte genoom bewerken. Imperfect reparatie van DSB's in een cel via de niet-homologe end-joining (NHEJ) DNA-reparatie-traject kan leiden tot kleine inserties en deleties (indels). Instelling van indels in het gen coderende sequentie van een cel kan leiden tot frameshift en vervolgens functionele knockout van een locus met genen hoog rendement. ² Hoewel dit protocol beschrijft het gebruik van ZFNs een knockout maken integratie van transgenen ook via homologie-gericht reparatie bij de ZFN cut site.

De CompoZr Custom ZFN service staat voor een systematische, uitgebreide en goed gekarakteriseerde aanpak voor gerichte gen-editing voor de wetenschappelijke gemeenschap met ZFN technologie. Sigma wetenschappers werken nauw samen met onderzoekers op 1) perform due diligence-onderzoek met inbegrip van analyse van relevante structuur van genen, biologie en model systeem op grond van de projectdoelen, 2) toepassing van deze kennis op een goede targeting strategie, 3 te ontwikkelen), dan ontwerpen, bouwen, en functioneel ZFNs te valideren voor de activiteit in een relevante cellijn. De onderzoeker ontvangt positieve controle genomisch DNA primers en klaar voor gebruik ZFN reagentia geleverd zowel plasmide DNA in vitro getranscribeerde mRNA formaat. Deze reagentia kunnen vervolgens worden geleverd voor transiënte expressie in de cel van de onderzoeker lijn of celtype van de keuze. Monsters worden vervolgens getest gen bewerking op de plaats van belang door standaard moleculair-biologische technieken zoals PCR amplificatie, enzymatische digest en elektroforese. Na een positief signaal voor gen-bewerking wordt gedetecteerd in de oorspronkelijke populatie, cellen zijn eencellige gekloond en gegenotypeerd voor de identificatie van mutant klonen / allelen.

Protocol

1. Custom ZFN ontwerpproces

1. Om de ZFN ontwerp-proces te versnellen, moet een onderzoeker te bieden:
• Informatie over de target-gen, zoals het gen naam, soort, en gen annotatie / identificatienummer.
• Een duidelijk vermeld over-all doel van het experiment (bijvoorbeeld Knockout of Knockin)
• Een factoren van het gen doel dat atypische genstructuur bijzondere biologie betrokken bij de genetische locus of een homologe gebieden elders in het genoom bevatten.
• De specifieke bereik van DNA-sequentie voor de zinkvinger nucleasen te richten op.
2. De Sigma bioinformatica team voert in silico ZFN ontwerp tot de ontwikkeling van de eerste zinkvinger doelsites.
3. Eerste ZFN doelsites worden geleverd aan een ZFN wetenschappelijke technisch consultant. Voor meer technisch complexe projecten, is dit Sigma wetenschapper werkt samen met de onderzoekers de ontwikkeling van de project strategie.
4. Bio-informatica biedt de top ZFN doel sites om de onderzoeker voor de beoordeling. Na goedkeuring van de potentiële ZFN doelplaatsen, wordt deze informatie verstrekt aan de ZFN Production team om de ZFN productieproces beginnen.

2. Aangepast ZFN Productie

1. De Sigma archief van zinkvinger modules wordt gebruikt om de goedgekeurde ZFN ontwerpen monteren.
2. Elke ZFN ontwerp wordt gemonteerd en de volgorde gecontroleerd op een high throughput klonen platform.
3. Zodra de productie van alle ZFN ontwerpen voltooid is, elke ZFN wordt verzonden naar validatie.

3. Validatie van Custom ZFNs

1. ZFN projecten inmens, muis, rat of CHO soorten worden gevalideerd in goed gekarakteriseerde cellijnen voor elke soort, is een gist gebaseerde test gebruikt worden voor andere organismen of celtypen.
2. ZFN constructen worden geleverd in de juiste cellijn door nucleofectie en de ZFNs worden uitgedrukt.
3. DNA wordt geoogst uit de pool van ZFN getransfecteerde cellen en de regio van belang is PCR versterkt.
4. De Cel-1 test wordt uitgevoerd op het PCR-product. Gel elektroforese wordt uitgevoerd op de Cel-1-test tot gevalideerde ZFN activiteit.
5. De hoogste activiteit ZFN ontwerp zoals bevestigd door de Cel-1-test wordt vervolgens aan de klant verstrekt. ZFNs worden in mRNA en plasmide DNA met PCR-primers voor de Cel-1 assay en genomisch DNA als een positieve controle.

4. Levering van gevalideerde ZFNs door Nucleofectie

1. Zaad de cellen een dichtheid van 2x10 cellen ⁵ / ml dag voor nucleofectie.
2. Op de dag van nucleofectie,nemen cellijn Nucleofector Kit V en laat warm tot kamertemperatuur.
3. Voeg de aanvulling op de Nucleofectie Solution V volgens protocol van de fabrikant.
4. Tel de cellen. Celdichtheid moet tussen 2,5 5x10 ⁵ cellen / ml.
5. Vul een 6-wells plaat met 2 ml medium in elk putje voorverwarmen in _een CO2 incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 20 minuten voor nucleofectie.
6. Centrifugeer 2x10 ⁶ cellen per transfectie (8x10 ^{6 in} totaal) op 200xg gedurende 5 minuten.
7. Tweemaal wassen cellen met 20 ml Balanced Salt Solution Hank's (HBSS).
8. Bereid experimentele buizen: (zie tabel in Custom ZFN technische bulletin)
9. Verwijder de 6-wells plaat met daarin media van stap (6,5) van de incubator.
10. Resuspenderen cellen in 400 ul (100 ul / reactie) van Nucleofectie Solution V.
11. Een reactie tegelijk worden 100 pi cellen elke DNA of mRNA bevattende buis. TransfER het mengsel in een 2 mm elektroporatie cuvette en nucleofect op een Nucleofector met het juiste programma.
12. Onmiddellijk na nucleofectie van elk monster, gebruikt een transferpipet ~ 500 ul medium toegevoegd voorverwarmde van de 6-wells plaat in stap (6.9) van de cuvet. Vervolgens voorzichtig overbrengen cellen van de cuvet van de resterende voorverwarmde medium in de 6-wells plaat.
13. Werk alle reacties en geeft het 6-well plaat de _CO2 incubator bij 37 ° C.

5. Oogsten Genomic DNA na Levering van ZFNs

1. 6-wells plaat - niet oogsten alle gepoolde cellen. Het is belangrijk om de cultuur te behouden om cellen om enkele cel verdunning kloon hebben na bevestigt u dat u Cel-1 spijsvertering producten. Een tot drie dagen na het verzamelen nucleofectie de cellen chromosomaal DNA voor te bereiden met behulp van de GenElute zoogdieren Genomic DNA Miniprep Kit.

6. Cel-1-test

PCR versterken het genomisch DNA van de ZFN getransfecteerde monsters en de positieve controle genomisch DNA die in de kit, met behulp van de meegeleverde primers. De PCR-reactie is ingesteld met de volgende voorwaarden: (zie tabel in Custom ZFN technische bulletin).

Om heteroduplexen van de PCR-homoduplexes genereren neemt 10 pi PCR-reactie van elk ZFN behandelde monster plus de controle en gebruik de volgende programma op een thermocycler:
95 ° C, 10 minuten
95 ° C tot 85 ° C, 2 ° C / seconde
85 ° C tot 25 ° C -0,1 ° C / seconde
4 ° C, voor onbepaalde tijd

Voeg 1 pi enhancer en 1 pi Nuclease S (van Transgenomic catalogusnummer 706025) aan elk reactievat en incuberen bij 42 ° C gedurende 20-40 minuten.

Voer de vertering op een 10% PAGE-TBE gel met de juiste markeringen, zoals DirectLoad widerange DNA Ladder (catalogusnummer D7058) (zie resultaten in Custom ZFN technische bulletin).

Opce positief signaal is aangetroffen in ZFN behandelde populaties door de cel-I bepaling, ga dan naar klonale isolatie en karakterisering.

7. Klonale Isolatie en karakterisering

1. Single-cell kloon van de ZFN behandelde monsters door middel van standaard methoden, met inbegrip FACS en verdunning klonen.
2. Laat het klonen voldoende vervolgens uit te breiden, wat deel van de cellen te splitsen voor genomisch DNA oogst, het bevriezen terug de rest als dwarshelling materiaal.
3. Amplify genomisch DNA van de klonen met behulp van de Cel-I primers en de amplicon door de Cel-I test (met en zonder WT DNA verrijkt in) te analyseren, of gebruik dit amplicon rechtstreeks naar genotypering.
4. Genotype kandidaat-klonen geïdentificeerd als zijnde bewerkt allelen door de voorkeur.

8. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van de volledige CompoZr ZFN werkstroom in figuur 2. ZFNs worden geleverdom cellen waar binden en klieven geschikte DNA sequentie die een dubbelstrengs onderbreking (DSB) maakt. Het natuurlijke herstelproces, niet-homologe eind mee (NHEJ), herstelt de DSB. In sommige gevallen afwijkende NHEJ resulteert in een deletie, insertie of substitutie van nucleotiden. PCR amplificatie van de geoogste genomisch DNA resultaten heteroduplex vorming van wild type en aangepast amplicons na de denaturatiestap / hybridisatie stap van de PCR-reactie. Toevoeging van de Cel-1-enzym resulteert in een splitsing van heteroduplex moleculen. Cel-1 resultaten worden opgelost door PAGE-analyse te ZFN decollete te bevestigen. Figuur 3 geeft een schematische weergave van de Cel-1-test en de verwachte resultaten.

Representatieve Cel-1 resultaten zijn opgenomen in figuren 4 en 5 figuur 4 bevat de resultaten van een zeer actieve paar ZFNs (21%) in K562 cellen. Figuur 5 bevat de resultaten van een minder actieve paar (2,4%) in ZFNsK562 cellen. ZFN activiteit bevestigd in beide figuren van de aanwezigheid van twee PCR-fragmenten onder de ouderlijke PCR fragment.

Figuur 1. Vertegenwoordiging gebonden zinkvinger nucleasen. ZFNs zijn ontworpen eiwitten uit een zinkvinger DNA-bindende domein gefuseerd aan de splitsing domein van de Foki restrictie-endonuclease. Wanneer gebonden als heterodimeer ZFNs een dubbelstrengs onderbreking een gebruiker bepaalde DNA-sequentie.

Figuur 2. Schematische voorstelling van de Custom ZFN Dienst Workflow. Grafische weergave van de workflow van een genetisch gemodificeerde cellijn door het gebruik CompoZr ZFNs te genereren.

Figuur 3. Schematische voorstelling van de Cel-1 test en de resultaten. A) ZFN plasmide o r mRNA wordt aan cellen. B) Uitgedrukt ZFNs binden en snijden de doelsequentie om een ​​dubbelstrengs onderbreking (DSB) in een deel van cellen. C) afwijkend herstel van ongeveer DSB door niet-homologe eind verbinden resulteert in nucleotide insertie of deletie. D) Genomisch DNA wordt gewonnen uit de getransfecteerde verzameling van cellen en versterkt de locus van belang. EF) PCR-product wordt gedenatureerd en opnieuw gegloeid het creëren van heteroduplex vorming van wild type en gewijzigd amplicons. G) Cel-1 mismatch endonuclease testresultaten in splitsing van heteroduplex moleculen. H) Cel-1 enzym verteert worden opgelost door PAGE. De waargenomen verhouding gekliefd product parenterale band, bepaald door ImageJ software blijkt de fractie gesneden en efficiëntie van de ZFNs.

Figuur 4. Cel-1 resultaten van 21% actief ZFNs ImageJ software is te vinden op.:_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Figuur 5. Cel-1 het gevolg is van 2,4% actieve ZFNs ImageJ software is beschikbaar op:. http://rsbweb.nih.gov/ij/ .

Discussion

Zodra ZFN-gemodificeerde cellen worden geïsoleerd ze permanent te hebben en erfelijke DNA-wijzigingen. Dit resulteert in het vermogen om stabiel gemodificeerde cellijnen of ras dieren gewenste genetische modificaties genereren onderzoek. CompoZr maat ZFNs een stevige werkwijze voor genoom bewerking in een grote verscheidenheid van celtypen. Publicatie van de succesvolle genoom bewerken met ZFNs omvat, maar is niet beperkt tot menselijke cellijnen, muis, rat, zebravis, kikker, varkens en CHO onderzoeksmodellen. ^{3,4,5,6,7,8,9} De mogelijkheid om een te creëren dubbelstrengs onderbreking op de gewenste doelgebied in het opgegeven celtype wordt gegarandeerd wanneer de ZFNs goed geleverd in een cel. Het is ook mogelijk om sequentiële zinkvinger wijzigingen uit te voeren om een cel in om meer dan een genetische modificatie hebben binnen een cel. ¹⁰ De mogelijkheid om een specifieke doelgroep volgorde te selecteren en alleen te wijzigen dat bepaalde locus is een primaire oorzaak voor de mogelijkheid om meerdere te creëren modificatieskationen.

De CompoZr Custom ZFN certificaat van analyse wordt gegenereerd met de zeer reagentia die in de kit dus zorgen dat alle componenten van de kit grondig zijn gevalideerd voor succes van de klant. Kritische stappen van de workflow van begin tot eind worden hieronder weergegeven:

Cell klonen

De mogelijkheid om te isoleren en uit te breiden een bepaalde cellijn moet worden getest voor het begin van elke ZFN experimenten. Enkele cellen worden geïsoleerd en uitgebreid zodat een klonaal afgeleide populatie mogelijk is. Sommige cellijnen zijn recalcitrante in deze kwestie, en trucs, zoals verrijking voor bewerkte klonen, of cultuur met geconditioneerde media kan helpen om deze uitdagingen te overwinnen.

Levering efficiëntie

Optimalisatie van levering efficiëntie is een must voor de levering van de ZFNs. Vele werkwijzen kunnen worden toegepast met inbegrip lipide gebaseerde transfectiesystemen, elektroporatie en nucleofectiop. De ideale levering methode bestaat uit een die de meest optimale mix van levering efficiëntie en de overleving van de cel biedt. Kwantificeren van deze efficiëntie kan worden geschat door het leveren van een GFP controle plasmide en kwantificeren door visuele inspectie of FACS 24-48u na de levering.

Cel-I bepaling

Het is noodzakelijk dat Cel-I test wordt uitgevoerd in parallel met de nodige controles om ervoor te zorgen dat de PCR, de spijsvertering, en elektroforese parameters niet zal bemoeien met de interpretatie van ZFN experiment. Elk pakket omvat de controle genomisch DNA dat wordt gebruikt om de Cel-I beeld in het certificaat van onderzoek te creëren. Versterking van de controle-DNA met de meegeleverde primers, gevolgd door Cel-I-test kan de gebruiker om de resultaten te vergelijken met die welke in de Certificate of Analysis (BvL) beeld, en isoleer eventuele inefficiënties in dit aspect van een experiment. Een passende negatieve controle, zoals een mock, of GFP behandeld celmonster mogelijk te toelichting van een niet-specifieke splitsing mogelijk te maken.

Kwalitatieve / Kwantitatieve analyse van single-cell klonen

Na ZFN behandeling cel klonen kunnen populaties van cellen worden gescreend voor het bewerken van de locus van belang door een aantal methoden. Cel-I bepaling kan worden uitgevoerd op genomisch DNA van klonen voor het identificeren van kandidaat-klonen voor verdere genotypering. Het is belangrijk spike WT PCR amplicon in het monster amplicons een 1:1 verhouding voordat de Cel-I verteren als homozygote mutant klonen bevatten homogene moleculen, dus brengen negatieve Cel-I assay resultaat. Een alternatieve methode voor het screenen van deze kandidaat klonen een PCR primer landing ontwerpen rechtstreeks op de ZFN doelplaats. In combinatie met een van de besturingszones primers, een negatieve test resultaat geeft verlies van WT sequentie. Een heterozygote kloon die ten minste een allel WT ygewasopbrengst PCR-signaal, maar kan worden gescheiden van volledig WT klonen door het uitvoeren van de PCR in het kader van SYBR qPCR.

Zodra kandidaat klonen zijn geïdentificeerd door de bovenstaande werkwijzen, kunnen zij worden getypeerd door standaard pyrosequencing, diepe sequencing of andere sequentie methoden. Voor sequentie methoden moet een amplicon gemaakt van de genomische DNA klonen gegenereerd. Voor traditionele pyrosequencing allelen kan worden gescheiden door TA-klonen van de PCR-product, en de volgorde van de individuele kolonies. Voor de methoden zoals diep sequentie deze stap is niet nodig.

Homologie Directed Repair (HDR)

Dit protocol biedt de methode voor ZFN gemedieerde gen knock-out via NHEJ. De integratie van transgenen kan ook worden uitgevoerd door invoering van een donor plasmide met homologie armen die flank een ZFN cut site. ¹¹ In dit scenario, de ZFN gemaakt dubbelstrengs breuk wordt hersteld door HDR in plaats van NHEJ. HDR gericht integration van transgenen kan worden bevestigd met vergelijkbare methoden om de procedures die in dit protocol.

Problemen oplossen

Levering van ZFNs

ZFN levering en expressie-levering kan worden gecontroleerd door levering van een GFP of andere dergelijke plasmide voor visualisatie en / of kwantificering. Lage expressie door promoter onverenigbaarheid met het celtype van belang kunnen worden overwonnen door aflevering van ZFNs in mRNA formaat. Bovendien kan de koude schokmethode worden gebruikt om verdere verhoging van de effectiviteit van ZFNs in cellen. MRNA ¹² Als wordt gebruikt is het noodzakelijk dat cellen voor gewassen te leveren zodat alle serum-afgeleid RNAses zijn verwijderd. Ook is het goed de mRNA op ijs ontdooien en de toe te voegen aan de cellen op het laatste moment een kans op aantasting minimaliseren.

Cel-I bepaling

De oprichting van de Cel-I ASSAy is specifiek en voldoende versterking van het locus van belang. Als niet-specifieke amplificatie producten worden waargenomen gebruik maken van standaard PCR het oplossen van problemen om de specificiteit zoals de optimalisering van template bedrag, primer concentratie, en fietsen parameters te verhogen. Voer PAGE analyse tegenover standaard agarose electroforese deze methode niet voldoende resolutie en de gevoeligheid. Cel-I digest voorwaarden kan ook worden geoptimaliseerd als er geen verteerd product of overmatig smeren wordt waargenomen. Titratie van de hoeveelheid Cel-1 nuclease en / of lengte van de spijsvertering tijd kan worden getitreerd om deze aspecten te verbeteren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease S (Cel-1 Enzyme)	Transgenomic	706025
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	03 300 242 001
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza Inc.	VCA-1003
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit	Sigma-Aldrich	NA0400