Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Génome édition avec des nucléases personnalisés CompoZr doigt de zinc (ZFNs)

doi: 10.3791/3304 Published: June 14, 2012

Summary

Le CompoZr personnalisé à doigt de zinc nucléase (ZFN) permet la fonction d'édition génome précis dans un organisme ou lignée cellulaire à tout lieu défini par l'utilisateur. Cet article décrit le processus pour la conception, la fabrication, la validation et la mise en œuvre du Service CompoZr personnalisé ZFN.

Abstract

Génome édition est une technique puissante qui peut être utilisé pour élucider la fonction des gènes et de la base génétique de la maladie. Gène traditionnel édition méthodes telles que la chimie basée sur la mutagenèse aléatoire ou l'intégration de séquences d'ADN confère changements aveugles génétiques d'une manière globalement inefficace et nécessite l'incorporation de séquences synthétiques ou indésirables d'utiliser des conditions de culture aberrants, peut prêter à confusion étude biologique. En revanche, l'expression transitoire ZFN dans une cellule peut faciliter précise, héréditaires édition du gène d'une manière très efficace sans la nécessité pour l'administration de produits chimiques ou d'intégration de transgènes synthétiques.

Nucléases à doigt de zinc (ZFNs) sont des enzymes qui se lient et couper des séquences distinctes de l'ADN double brin (ADNdb). Une fonctionnelle CompoZr ZFN unité se compose de deux protéines individuelles monomères qui lient l'ADN "demi-site» d'environ 15-18 nucléotides (voir Figure 1). Lorsque deux ZFN monoMers "maison" à leurs sites cibles adjacents les domaines d'ADN clivage dimériser et de créer une cassure double brin (CDB) dans l'ADN. 1 Introduction de ZFN médiation CDB dans le génome établit une fondation pour l'édition du génome très efficace. Réparation imparfaite de CDB dans une cellule par le biais du non-homologue de fin d'assemblage (NHEJ) voie réparation de l'ADN peut entraîner de petites insertions et suppressions (indels). Création d'indels dans la séquence du gène codant d'une cellule peut se traduire par décalage du cadre et suite à élimination directe fonctionnelle d'un locus du gène à haut rendement. 2 Bien que ce protocole décrit l'utilisation de ZFNs pour créer une inactivation du gène, l'intégration des transgènes peuvent également être effectuées par l'intermédiaire homologie dirigée réparation sur le site de coupe ZFN.

Le CompoZr personnalisé ZFN service représente une approche systématique, globale et bien caractérisé à l'édition gène ciblé pour la communauté scientifique avec la technologie ZFN. Scientifiques Sigma travailler en étroite collaboration avec les enquêteurs à 1) perform analyse de diligence raisonnable, y compris l'analyse de la structure des gènes pertinents, la biologie, et un système de modèle conformément aux objectifs du projet, 2) appliquer cette connaissance pour développer une bonne stratégie de ciblage, 3), puis la conception, la construction, et fonctionnellement valider ZFNs pour l'activité d'une manière pertinente lignée cellulaire. L'enquêteur reçoit positif ADN génomique de contrôle et des amorces, et prêt-à-utiliser les réactifs ZFN fournis à la fois dans l'ADN plasmidique et le format in-vitro l'ARNm transcrit. Ces réactifs peuvent ensuite être livrés pour l'expression transitoire dans une lignée cellulaire de l'enquêteur ou le type de cellule de choix. Les échantillons sont ensuite testés pour l'édition au niveau du locus du gène d'intérêt par des techniques classiques de biologie moléculaire, y compris l'amplification par PCR, digestion enzymatique, et l'électrophorèse. Après signal positif pour le montage du gène est détectée dans la population initiale, les cellules sont des cellules clonées seule et génotypés pour l'identification de clones mutants ou allèles.

Protocol

1. Processus de conception personnalisée ZFN

  1. Pour accélérer le processus de conception ZFN, un enquêteur doit fournir:
    • Informations sur le gène cible telles que le nom du gène, espèce, et le gène de l'annotation / numéro d'identification.
    • Une clairement indiqué sur-tout l'objectif de l'expérience (par exemple, ou Knockout Knockin)
    • Tous les facteurs spécifiques de la cible du gène qui comprennent structure génique atypique, la biologie particulière impliqué dans le locus génétique, ou des régions homologues dans le reste du génome.
    • La plage spécifique de séquence d'ADN pour le doigt de zinc pour cibler nucléases.
  2. L'équipe de Sigma bioinformatique mène in silico ZFN conception pour développer des sites initiaux à doigts de zinc cibles.
  3. Les premiers sites cibles ZFN sont fournis à un consultant technique et scientifique ZFN. Pour les projets plus complexes techniquement, ce scientifique Sigma travaille avec les enquêteurs de mettre au point la stratégie du projet.
  4. Bioinformatique fournit les meilleurs sites cibles ZFN à l'enquêteur aux fins d'examen. Lors de l'approbation des sites potentiels cibles ZFN, cette information est fournie à l'équipe de production ZFN pour commencer le processus de fabrication ZFN.

2. Personnalisé de production ZFN

  1. L'archive Sigma de modules à doigt de zinc est utilisé pour assembler les modèles ZFN approuvés.
  2. Chaque modèle est assemblé et ZFN séquence vérifiée sur une plate-forme de clonage à haut débit.
  3. Une fois la production de tous les modèles ZFN est terminée, tous les ZFN est envoyé à la validation.

3. Validation des ZFNs personnalisés

  1. Des projets dans ZFNespèce humaine, la souris, de rat ou de CHO sont validés dans des lignées cellulaires bien caractérisées pour chaque espèce, un dosage à base de levure est utilisé pour d'autres organismes ou des types cellulaires.
  2. Constructions ZFN sont livrés dans la lignée cellulaire appropriée par nucléofection et les ZFNs sont exprimés.
  3. ADN est récolté à partir du pool de cellules transfectées ZFN et la région d'intérêt est amplifié par PCR.
  4. Le Cel-1 test est ensuite effectué sur le produit de PCR. L'électrophorèse sur gel est exécuté sur le Cel-1 dosage de l'activité ZFN validé.
  5. La conception plus forte activité ZFN tel que confirmé par le dosage Cel-1 est ensuite fourni au client. ZFNs sont livrés en ARNm et l'ADN plasmidique ainsi amorces de PCR pour l'essai Cel-1 et l'ADN génomique comme témoin positif.

4. La livraison des ZFNs validés par nucléofection

  1. Graine les cellules à une densité de 2x10 5 cellules par ml de la veille nucléofection.
  2. Le jour de nucléofection,sortez portable Ligne Nucleofector Kit V et laisser tiédir à température ambiante.
  3. Ajouter le supplément à la solution nucléofection V selon le protocole du fabricant.
  4. Compter les cellules. Densité de cellules doit être compris entre 2,5-5x10 5 cellules par ml.
  5. Remplir une plaque à 6 puits avec 2 ml de milieu dans chaque puits et pré-chaud dans un incubateur à CO 2 à 37 ° C pendant au moins 20 minutes avant nucléofection.
  6. Centrifuger 2x10 6 cellules par transfection (8x10 6 au total) au 200xg pendant 5 minutes.
  7. Laver les cellules deux fois avec 20 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
  8. Préparer des tubes expérimentaux: (voir tableau en Custom ZFN bulletin technique)
  9. Retirer la plaque à 6 puits contenant les médias de l'étape (6.5) de l'incubateur.
  10. Remettre en suspension les cellules dans 400 pi (100 pi / réaction) de la solution nucléofection V.
  11. Un réactionnel à la fois, ajouter 100 pl de cellules à chaque ADN ou ARNm contenant du tube. Transfer le mélange à une électroporation 2 mm cuvette et sur une nucleofect Nucleofector avec le programme approprié.
  12. Immédiatement après nucléofection de chaque échantillon, utiliser une pipette de transfert pour ajouter ~ 500 pi de milieu préchauffé de la plaque à 6 puits à l'étape (6,9) dans la cuvette. Puis, transférez les cellules de la cuvette au milieu restant préchauffé dans la plaque à 6 puits.
  13. Terminer toutes les réactions et retourner la plaque à 6 puits à l'incubateur à CO 2 à 37 ° C.

5. La récolte d'ADN génomique après la livraison de ZFNs

  1. Des plaques 6 puits - ne pas récolter la totalité des cellules mises en commun. Il est important de maintenir la culture dans le but d'avoir des cellules à clone cellulaire de dilution simple une fois que vous confirmez que vous avez produits Cel-1 de digestion. Un à trois jours après nucléofection recueillir les cellules pour préparer l'ADN chromosomique utilisant le GenElute l'ADN génomique des mammifères Miniprep Kit.

6. Cel-1 Test

  • Amplifier par PCR de l'ADN génomique à partir des échantillons ZFN transfectées et l'ADN génomique de contrôle positif fourni dans le kit, en utilisant les amorces fournies. La réaction de PCR est mis en place avec les conditions suivantes: (voir tableau en Custom ZFN bulletin technique).
  • Pour générer des hétéroduplex homoduplexes PCR prendre 10 ul de la réaction PCR à partir de chaque échantillon ZFN traités ainsi que le contrôle et utiliser le programme suivant sur un thermocycleur:
    95 ° C, 10 minutes
    95 ° C à 85 ° C, -2 ° C / seconde
    85 ° C à 25 ° C, -0,1 ° C / seconde
    4 ° C, indéfiniment
  • Ajouter 1 ul de enhancer et 1 ul de nucléase S (à partir de 706 025 Numéro de catalogue Transgenomic) à chaque réaction et incuber à 42 ° C pendant 20-40 minutes.
  • Exécuter les digestions sur un 10% PAGE-TBE gel avec des marqueurs appropriés, tels que l'ADN Ladder DirectLoad WideRange (D7058 Numéro de catalogue) (voir les résultats dans le bulletin technique personnalisé ZFN).
  • SurCE signal positif a été détecté dans ZFN-traités par les populations cel-je test, procéder à l'isolement et la caractérisation des clones.
  • 7. Isolement et caractérisation de clones

    1. Une seule cellule clone les échantillons ZFN-traités par des méthodes standards, y compris FACS et le clonage de dilution.
    2. Autoriser les clones se développer suffisamment, puis fractionnez une certaine proportion de cellules pour la récolte d'ADN génomique, le gel de retour le reste en tant que matériau en banque.
    3. Amplifier l'ADN génomique des clones en utilisant les amorces Cel-I et d'analyser l'amplicon par Cel-je test (avec et sans ADN WT atteint un sommet en), ou encore utiliser cet amplicon de procéder directement au génotypage.
    4. Clones candidats génotype identifié comme ayant des allèles édité par la méthode préférée.

    8. Les résultats représentatifs

    Un exemple de l'ensemble du flux de travail CompoZr ZFN est présenté dans la Figure 2. ZFNs sont livréspour les cellules où ils se lient et coupent la séquence d'ADN appropriée qui crée une cassure double brin (DSB). Le processus naturel de réparation, non homologue (NHEJ extrémité de jonction), les réparations de l'ORD. Dans certains résultats aberrants dans les instances NHEJ suppression, insertion ou substitution de nucléotides. Amplification par PCR de la récolte des résultats d'ADN génomique dans la formation des hétéroduplex entre le type sauvage et les amplicons modifiés après la dénaturation / étape de recuit de la réaction de PCR. Ajout des résultats enzymatiques Cel-1 dans le clivage de toutes les molécules hétéroduplex. Cel-1 résultats sont résolus par l'analyse PAGE pour confirmer le clivage ZFN. La figure 3 présente un schéma de l'essai Cel-1 et les résultats escomptés.

    Représentant de CEL-1 résultats sont contenus dans les figures 4 et 5 la figure 4 contient les résultats d'une paire très actif de ZFNs (21%) dans les cellules K562;. Figure 5 contient les résultats d'une paire moins actif (2,4%) de ZFNs dansLes cellules K562. Activité ZFN est confirmée dans les deux chiffres par la présence de fragments de PCR deux sous le fragment parentale PCR.

    Figure 1
    Figure 1. ZFNs Représentation des nucléases à doigt de zinc liés. Sont conçus protéines composées d'un doigt de zinc domaine liant l'ADN fusionné au domaine de clivage de l'endonucléase de restriction FokI. Lorsqu'il est lié comme un hétérodimère, ZFNs créer une cassure double brin à une séquence d'ADN d'utilisateur spécifié.

    Figure 2
    Figure 2. Schéma du workflow ZFN service personnalisé. Représentation graphique du workflow pour générer une lignée de cellules génétiquement modifiées à l'aide ZFNs CompoZr.

    Figure 3
    Figure 3. Schéma de l'essai Cel-1 et les résultats. A) ZFN plasmide o ARNm r est délivré à cellules. B) Exprimé bind ZFNs et couper leur séquence cible la création d'une pause double brin (DSB) dans une partie des cellules. C) la réparation aberrante de certains conseils scolaires de district par des non-homologue fin de rejoindre des résultats à l'insertion ou la suppression de nucléotides. D) l'ADN génomique est récolté à partir du pool de cellules transfectées et amplifié au niveau du locus d'intérêt. EF) produit de PCR est dénaturé et re-création de recuit formation d'hétéroduplex entre le type sauvage et les amplicons modifiés. G) Les résultats Cel-1 inadéquation endonucléase de dosage dans le clivage de molécules hétéroduplex. H) Cel-1 enzyme digère sont résolus par PAGE. Le ratio observé de produit de clivage à la bande parentérale, déterminée par logiciel ImageJ, indique la coupe de fraction et de l'efficacité des ZFNs.

    Figure 4
    Figure 4. Cel-1 résulte de 21% ZFNs actifs logiciels ImageJ est disponible à l'adresse:._blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

    Figure 5
    Figure 5. Cel-1 résulte de 2,4% ZFNs actifs logiciels ImageJ est disponible à l'adresse:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .

    Discussion

    Une fois ZFN modifiés cellules sont isolés, ils ont permanente et héréditaire modifications de l'ADN. Il en résulte la possibilité de générer des lignées cellulaires de façon stable ou animaux modifiés race avec des modifications génétiques souhaitées pour effectuer des recherches. CompoZr ZFNs personnalisés offrent une méthode robuste pour génome d'édition dans une grande variété de types cellulaires. Publication du génome succès d'édition avec ZFNs comprend mais ne se limite pas à des lignées cellulaires humaines, de souris, rat, poisson-zèbre, grenouille, porcine et des modèles de recherche CHO. 3,4,5,6,7,8,9 La possibilité de créer un double brin rupture au site cible désirée dans le type cellulaire déterminé est assurée lorsque les ZFNs sont correctement délivrés dans une cellule. Il est également possible d'effectuer séquentielles modifications à doigts de zinc à une cellule afin d'avoir plus d'une modification génétique dans une cellule 10. La possibilité de sélectionner une séquence cible spécifique et ne modifient que locus particulier est une principale cause de la possibilité de créer plusieurs modifides cations.

    Le CompoZr personnalisé ZFN certificat d'analyse est générée avec les réactifs très fournies dans le kit assurant ainsi que tous les composants du kit ont été soigneusement validé pour la réussite des clients. Les étapes critiques du flux de production du début à la fin sont présentées ci-dessous:

    Clonage cellulaire

    La capacité à isoler et à développer une lignée cellulaire donnée doivent être testés avant de commencer toutes les expériences ZFN. Les cellules individuelles doivent être isolés et élargi afin de s'assurer que la population clonale dérivée est possible. Certaines lignées cellulaires sont récalcitrantes à ce sujet, et des astuces telles que l'enrichissement des clones édités, ou de la culture avec les médias climatisées peuvent aider à surmonter ces défis.

    L'efficacité de livraison

    Optimisation de l'efficacité de livraison est un must avant la livraison des ZFNs. De nombreuses méthodes peuvent être utilisées, y compris à base de lipides transfection, l'électroporation, et nucleofectile. La méthode de livraison idéal se compose d'un mélange qui offre la plus optimale de l'efficacité de livraison et la survie cellulaire. Quantification de ces gains d'efficacité peuvent être estimées par la prestation d'un contrôle GFP du plasmide et la quantification par inspection visuelle ou FACS 24-48h après l'accouchement.

    Cel-je test

    Il est impératif que Cel-je dosage est effectué en parallèle avec les contrôles appropriés pour s'assurer que les paramètres de la PCR, la digestion, et l'électrophorèse ne pas interférer avec l'interprétation de l'expérience ZFN. Chaque kit comprend l'ADN génomique de contrôle qui est utilisé pour créer l'image Cel-I dans le certificat d'analyse. Amplification de l'ADN de contrôle avec les amorces fournies suivies par Cel-je test permettra à l'utilisateur de comparer les résultats avec celles fournies dans le certificat d'analyse (CA) d'image, et d'isoler les inefficacités potentielles dans cet aspect de l'expérience. Un contrôle approprié négative comme une maquette, ou GFP traités celluleéchantillon doit également être inclus pour permettre l'élucidation de tous les produits de clivage non-spécifiques.

    Qualitative / quantitative d'analyse de la seule clones de cellules

    Après le traitement et le clonage ZFN seule cellule, les populations de cellules peuvent être criblés pour l'édition au niveau du locus d'intérêt par un certain nombre de méthodes. Cel-I dosage peut être effectuée sur l'ADN génomique à partir de clones dans le but d'identifier les clones candidats pour le génotypage en outre. Il est important de pic WT amplicon de PCR dans les amplicons échantillon à un rapport de 1:1 avant d'effectuer la Cel-je digère comme homozygotes clones mutants sera contiennent des molécules homogènes, et donc donner un effet négatif Cel-I dosage résultat. Une méthode alternative pour le criblage de ces clones candidats est de concevoir un atterrissage d'amorce de PCR directement sur le site cible ZFN. Utilisée en conjonction avec l'une des amorces de contrôle, un résultat négatif signifie dosage perte de la séquence WT. Un clone hétérozygote contenant au moins un allèle WT va Yield signal PCR, mais peuvent être séparés à partir de clones WT pleinement en effectuant la PCR dans le cadre de SYBR qPCR.

    Une fois les clones candidats ont été identifiés par les méthodes ci-dessus, ils peuvent être génotypés par pyroséquençage standard, le séquençage de profondeur, ou d'autres méthodes de séquençage. Pour toutes les méthodes de séquençage, un amplicon créé à partir de l'ADN génomique des clones doit être généré. Pour allèles pyroséquençage traditionnels peuvent être séparés par TA-clonage du produit PCR et le séquençage des colonies individuelles. Pour des méthodes telles que le séquençage en profondeur cette étape n'est pas nécessaire.

    Réparation homologie Réalisé (HDR)

    Ce protocole prévoit la méthode de knock-out de gène médié par l'intermédiaire ZFN NHEJ. L'intégration des transgènes peuvent également être réalisée par introduction d'un plasmide donneur avec bras d'homologie qui flanquent un site de coupe ZFN 11. Dans ce scénario, le ZFN créé double brin pause est réparé par HDR au lieu de NHEJ. HDR j'ai réaliséntégration des transgènes peuvent être confirmés en utilisant des méthodes similaires aux procédures prévues dans ce protocole.

    Dépannage

    La livraison des ZFNs

    Livraison ZFN et d'expression de livraison peut être contrôlée par la livraison d'un GFP ou autre plasmide pour la visualisation et / ou la quantification. Faible niveau d'expression pour cause d'incompatibilité avec le promoteur type de cellule d'intérêt peuvent être surmontés par la livraison de ZFNs au format ARNm. En outre, la méthode choc dû au froid peut être utilisé pour augmenter encore l'efficacité de ZFNs dans les cellules. 12 Si l'ARNm est utilisé, il est impératif que les cellules sont lavées avant la livraison pour s'assurer que tous Rnases sérum dérivés ont été supprimés. Il est également prudent de dégeler l'ARNm sur la glace, et ajouter le il aux cellules à la dernière minute afin de minimiser tout risque de dégradation.

    Cel-je test

    La fondation de l'assa-Cel Iy est égal à une amplification spécifique et un grand du locus d'intérêt. Si les produits d'amplification non spécifiques sont observées utiliser la PCR standard les procédures de dépannage pour accroître la spécificité tels que l'optimisation de la quantité de modèle, la concentration d'amorce, et le cyclisme paramètres. Effectuer une analyse PAGE, par opposition à d'agarose électrophorèse standard comme cette dernière méthode ne fournit pas la résolution et de sensibilité. Cel-I conditions de digestion peuvent également être optimisés si aucun produit digéré ou de traînées excessive est observée. Le titrage de la quantité de Cel-1 nucléase et / ou la durée de la digestion peuvent être titrés afin d'améliorer ces aspects.

    Disclosures

    Les chercheurs peuvent fournir des ZFN cellules ou animaux modifiés à des collaborateurs dans le cadre du Contrat de Licence de recherche standard. Dans cette circonstance Sigma demande qu'un accord de transfert de matériel est mis en place entre Sigma, le client ZFN et leur collaborateur. Le permis de recherche peut être consulté à: http://www.sigma.com/zfn .

    Si il ya un potentiel pour une application commerciale en utilisant des cellules modifiées ZFN Sigma demande alors qu'une licence commerciale est mis en place.

    La production et l'accès gratuit à cet article est sponsorisé par la société Sigma, Inc

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Nuclease S (Cel-1 Enzyme) Transgenomic 706025
    Expand High Fidelity PCR System Roche Group 03 300 242 001
    Cell Line Nucleofector Kit V Lonza Inc. VCA-1003
    GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit Sigma-Aldrich NA0400

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Kim, Y. G. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).
    2. Urnov, F. D. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
    3. Moehle, E. A. Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).
    4. Meyer, M. Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022 (2010).
    5. Geurts, A. M. Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
    6. Meng, X. Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).
    7. Young, J. J. Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Forthcoming (2011).
    8. Wanatabe, M. Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).
    9. Santiago, Y. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
    10. Lui, P. Q. Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases. Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).
    11. Moehle, E. A. Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).
    12. Doyon, Y. Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption. Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).
    Génome édition avec des nucléases personnalisés CompoZr doigt de zinc (ZFNs)
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hansen, K., Coussens, M. J., Sago, J., Subramanian, S., Gjoka, M., Briner, D. Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs). J. Vis. Exp. (64), e3304, doi:10.3791/3304 (2012).More

    Hansen, K., Coussens, M. J., Sago, J., Subramanian, S., Gjoka, M., Briner, D. Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs). J. Vis. Exp. (64), e3304, doi:10.3791/3304 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter