Genome Redigerer med CompoZr Custom sink finger nukleaser (ZFNs)

Summary

Den CompoZr Custom sink-Finger nuklease (ZFN) Tjenesten gir presis genomet redigering i alle organisme eller celle linje til enhver locus defineres av brukeren. Denne artikkelen beskriver prosessen for design, produksjon, validering og implementering av CompoZr Custom ZFN Service.

Abstract

Genome redigering er en kraftfull teknikk som kan brukes til å belyse gen-funksjon og det genetiske grunnlaget for sykdommen. Tradisjonell genet redigering metoder som kjemisk-baserte mutagenese eller tilfeldig integrering av DNA-sekvenser overdrar vilkårlige genetiske endringer i en samlet ineffektiv måte og krever inkorporering av uønskede syntetiske sekvenser eller bruk av avvikende kultur tilstander, potensielt forvirrende biologisk studie. Som kontrast kan forbigående ZFN uttrykk i en celle lette presis, arvelige genet redigering i en svært effektiv måte uten behov for administrasjon av kjemikalier eller integrasjon av syntetiske transgener.

Sink finger nukleaser (ZFNs) er enzymer som binder og kutte distinkte sekvenser av dobbel-strandet DNA (dsDNA). En funksjonell CompoZr ZFN enhet består av to individuelle monomere proteiner som binder en DNA "halv-site" på ca 15-18 nukleotider (se figur 1). Når to ZFN monomers "hjem" til sine tilstøtende målwebområder de DNA-cleavage domener dimerize og lage en dobbel-tråd pause (DSB) i DNA. ¹ Innføring av ZFN-medierte DSBs i genomet legger grunnlaget for svært effektiv genom redigering. Imperfect reparasjon av DSBs i en celle via ikke-homologe end-bli (NHEJ) DNA reparasjon vei kan resultere i små innsettinger og slettinger (indels). Opprettelse av indels innenfor genet kodende sekvens av en celle kan resultere i frameshift og påfølgende funksjonell knockout av et gen locus ved høy effektivitet. ^2. Mens denne protokollen beskriver bruken av ZFNs å skape et gen knockout, integrering av transgener kan også utføres via homologi-rettet reparasjon på ZFN cut nettstedet.

Den CompoZr Custom ZFN Tjenesten representerer en systematisk, helhetlig og godt karakterisert tilnærming til målrettet genet redigering for det vitenskapelige samfunn med ZFN teknologi. Sigma forskere samarbeider tett med etterforskerne for å 1) perform due diligence analyse inkludert analyse av relevante genet struktur, biologi, og modell system i henhold til prosjektets mål, 2) anvende denne kunnskapen til å utvikle en sunn målrettingsstrategien, 3) deretter designe, bygge, og funksjonelt validere ZFNs for aktivitet i en relevant cellelinje. Etterforskeren får positiv kontroll genomisk DNA og primere, og klar til bruk ZFN Reagensene i både plasmid DNA og in-vitro transkribert mRNA-format. Disse reagensene kan da bli levert til forbigående uttrykk i undersøkers cellelinje eller celle type valg. Prøver er deretter testet for genet redigering ved lokaliseringen av interesse ved standard molekylærbiologiske teknikker som PCR amplifisering, enzymatisk fordøye, og elektroforese. Etter positivt signal for genet redigering er oppdaget i den innledende befolkningen, celler er encellede klonet og genotypede for identifisering av muterte kloner / alleler.

Protocol

1. Custom ZFN Design Process

1. For å påskynde ZFN designprosessen, bør en etterforsker gi:
• Informasjon om målet genet som genet navn, arter, og genet merknader / identifikasjonsnummer.
• En tydelig oppgitt over-all Hensikten med forsøket (f.eks Knockout eller Knockin)
• Eventuelle spesifikke faktorer av genet målet som inkluderer atypiske gen struktur, spesielt biologi innblandet i den genetiske locus, eller noen homologe regioner andre steder i genomet.
• Den spesifikke spekter av DNA sekvens for sink finger nukleaser å målrette.
2. Sigma bioinformatikk teamet gjennomfører i silico ZFN design for å utvikle innledende sink finger målwebområder.
3. Innledende ZFN målwebområder er gitt til en ZFN vitenskapelig teknisk konsulent. For mer teknisk kompliserte prosjekter, fungerer denne Sigma vitenskapsmann med etterforskerne for å utvikle prosjektet strategien.
4. Bioinformatikk gir de beste ZFN målwebområder til etterforsker for vurdering. Ved godkjenning av de potensielle ZFN målwebområder, blir denne informasjonen gitt til ZFN produksjonsteamet å starte ZFN produksjonsprosessen.

2. Custom ZFN Produksjon

1. Sigma arkiv av sink finger moduler brukes til å montere godkjente ZFN design.
2. Hver ZFN design er montert og sekvens verifisert på en høy gjennomstrømming kloning plattform.
3. Når produksjonen av alle ZFN design er fullført hver ZFN sendes til validering.

3. Validering av Custom ZFNs

1. ZFN prosjekter imenneske, mus, rotte eller CHO arter er validert i godt karakteriserte cellelinjer for hver enkelt art, er en gjær baserte analysen brukes til andre organismer eller celletyper.
2. ZFN konstruerer leveres i riktig cellelinje ved nucleofection og ZFNs uttrykkes.
3. DNA er høstet fra pool av ZFN transfekterte celler og regionen av interesse er PCR forsterket.
4. Den Cel-1-analysen er så gjennomført på PCR produktet. Gel elektroforese kjøres på Cel-1 analysen til validert ZFN aktivitet.
5. Den høyeste aktiviteten ZFN design som bekreftes av Cel-1 analysen blir deretter gitt til kunden. ZFNs leveres i mRNA og plasmid DNA sammen med PCR-primere for Cel-1-analysen og genomisk DNA som en positiv kontroll.

4. Levering av Validerte ZFNs ved Nucleofection

1. Seed cellene ved en tetthet av 2x10 ⁵ celler / ml dagen før nucleofection.
2. På dagen for nucleofection,ta ut Cell Linje Nucleofector Kit V og la varm til romtemperatur.
3. Tilsett supplement til Nucleofection Løsning V i henhold til produsentens protokollen.
4. Tell cellene. Cell tetthet bør være mellom 2,5-5x10 ⁵ celler / ml.
5. Fyll en seks-brønns plate med 2 ml medium i hver brønn og pre-varm i en CO ₂ inkubator ved 37 ° C i minst 20 minutter før nucleofection.
6. Sentrifuger 2x10 ⁶ celler per transfeksjon (8x10 ⁶ totalt) på 200xg i 5 minutter.
7. Vask cellene to ganger med 20 ml Hank Balanced Salt Solution (HBSS).
8. Forbered eksperimentelle rør: (se tabell i Custom ZFN teknisk bulletin)
9. Fjern seks-brønns plate som inneholder media fra trinn (6,5) fra inkubatoren.
10. Resuspender celler i 400 mL (100 mL / reaksjon) av Nucleofection Solution V.
11. En reaksjon gangen, tilsett 100 mL av celler til hver DNA eller mRNA-holdig tube. TransfER blandingen til en 2 mm electroporation kyvette nucleofect på en Nucleofector med det aktuelle programmet.
12. Umiddelbart etter nucleofection av hver prøve, bruk en overføringspipetten å legge ~ 500 mL av prewarmed medium fra seks-brønns plate i trinn (6,9) til kyvetten. Deretter forsiktig overføre celler fra kyvetten til den gjenværende prewarmed medium i 6-brønnen plate.
13. Fullfør alle reaksjoner og returnere 6-brønnen plate til CO ₂ inkubator ved 37 ° C.

5. Høsting Genomisk DNA etter levering av ZFNs

1. 6-brønnen plate - ikke høste alle de sammenslåtte cellene. Det er viktig å opprettholde kulturen for å få celler til én celle fortynning klone etter at du bekrefter at du har Cel-1 fordøyelsen produkter. Én til tre dager etter nucleofection samle cellene å forberede kromosomale DNA ved hjelp av GenElute pattedyr Genomisk DNA Miniprep Kit.

6. Cel-1 Assay

PCR forsterke genomisk DNA fra de ZFN transfekterte prøver og positiv kontroll genomisk DNA følger med settet, bruker de medfølgende primere. PCR reaksjonen er satt opp med følgende vilkår: (se tabell i Custom ZFN teknisk bulletin).

For å generere heteroduplexes fra PCR homoduplexes ta 10 mL av PCR reaksjonen fra hver ZFN behandlet prøve pluss kontroll og bruker følgende program på en thermocycler:
95 ° C, 10 minutter
95 ° C til 85 ° C, -2 ° C / andre
85 ° C til 25 ° C, -0,1 ° C / andre
4 ° C, på ubestemt tid

Legg en mL av enhancer og 1 mL av nuklease S (fra Transgenomic Catalog Number 706 025) til hver reaksjon og Inkuber ved 42 ° C i 20-40 minutter.

Kjør digestions på en 10% SIDE-TBE gel med riktige markører, som for eksempel DirectLoad WideRange DNA Ladder (Catalog Number D7058) (se resultater i Custom ZFN teknisk bulletin).

Påce positivt signal er påvist i ZFN behandlet populasjoner av cel-I analysen, fortsett til klonal isolasjon og karakterisering.

7. Klonal isolering og karakterisering

1. Encellet klone ZFN-behandlede prøver etter standard metoder, inkludert FACS og fortynning kloning.
2. La kloner å utvide tilstrekkelig, deretter delt noen andel av celler for genomisk DNA innhøsting, frysing tilbake resten som hopp materiale.
3. Forsterke genomisk DNA fra kloner hjelp av Cel-I primere og analysere fragment av Cel-I analysen (med og uten WT DNA tilsatt i), eller alternativt bruke denne fragment å gå direkte til genotyping.
4. Genotype kandidat kloner identifisert til å ha redigert alleler av den foretrukne metoden.

8. Representative Resultater

Et eksempel på hele CompoZr ZFN arbeidsflyt er presentert i figur 2. ZFNs leverestil cellene der de binder seg og holde seg riktig DNA sekvens som skaper en dobbel-strandet pause (DSB). Den naturlige reparasjonsprosessen, non-homolog ende bli (NHEJ), reparasjoner DSB. I noen tilfeller avvikende NHEJ resulterer i sletting, innsetting eller substitusjon av nukleotider. PCR amplifikasjon av høstes genomisk DNA resulterer i heteroduplex formasjon mellom villtype og modifiserte amplikonene etter denaturering / avspenning trinn i PCR reaksjonen. Tilsetting av Cel-1 enzymet resulterer i spalting av noen heteroduplex molekyler. Cel-1 resultater blir løst ved Sideanalyse å bekrefte ZFN cleavage. Figur 3 gir en skjematisk av Cel-1-analysen og de ​​forventede resultatene.

Representative Cel-1 resultater som er med i figur 4 og 5 Figur 4 inneholder resultater fra en meget aktiv par ZFNs (21%) i K562 celler;. Figur 5 inneholder resultater fra en mindre aktiv par (2,4%) av ZFNs iK562 celler. ZFN aktivitet bekreftes i begge tall ved tilstedeværelsen av to PCR fragmenter under foreldrenes PCR fragment.

Figur 1. Representasjon av bundet sink finger nukleaser. ZFNs er konstruert proteiner består av en sink finger DNA-bindende domene smeltet til spalting domenet til Foki restriksjonsendonuklease. Når bundet som en heterodimer, ZFNs lage en dobbel-strandet pause på en bruker spesifisert DNA sekvens.

Figur 2. Skjematisk av Custom ZFN Tjenesten Workflow. Grafisk fremstilling av arbeidsflyten for å generere en genetisk modifisert cellelinje hjelp CompoZr ZFNs.

Figur 3. Skjematisk av Cel-1-analysen og resultater. A) ZFN plasmid o r mRNA leveres til cellene. B) Uttrykt ZFNs bind og kutte sine mål sekvens skape en dobbel strandet pause (DSB) i en del av celler. C) Aberrant reparasjon av noen DSBs av ikke-homolog ende begynte resultatene i nukleotid innsetting eller sletting. D) Genomisk DNA er høstet fra transfekterte pool av celler og forsterket ved locus av interesse. EF) PCR produktet er denaturert og re-glødet skape heteroduplex formasjon mellom villtype og modifiserte amplikonene. G) Den Cel-1 mismatch endonuclease analyseresultatene i spalting av heteroduplex molekyler. H) Cel-1 enzymet fordøyer blir løst etter side. Den observerte forholdet mellom spalting produkt til parenteral band, bestemmes av ImageJ programvare, indikerer brøkdel kutt og effektivisering av ZFNs.

Figur 4. Cel-1 resultater fra 21% aktiv ZFNs ImageJ programvare er tilgjengelig på._blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Figur 5. Cel-1 resultater fra 2,4% aktive ZFNs ImageJ programvare er tilgjengelig på:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .

Discussion

Once ZFN-modifiserte cellene er isolert de har permanent og arvelig DNA modifikasjoner. Dette resulterer i evnen til å generere stabilt modifiserte cellelinjer eller avle dyr med ønskede genetiske modifikasjoner å drive forskning. CompoZr Custom ZFNs gi en robust metode for genomet redigering i en rekke celletyper. Publisering av vellykket genom redigering med ZFNs inkluderer, men er ikke begrenset til menneskelige cellelinjer, mus, rotte, sebrafisk, frosk, svin og CHO forskning modeller. ^{3,4,5,6,7,8,9} Evnen til å skape en dobbel-strandet pause på ønsket målområde i den angitte celletype er forsikret når de ZFNs er skikkelig leveres i en celle. Det er også mulig å utføre sekvensielle sink finger modifikasjoner til en celle for å ha mer enn en genetisk modifisering i en celle. ^Ti Muligheten til å velge et bestemt mål sekvens og bare endre det aktuelle locus er en primær årsak til evnen til å skape flere tilpasningerkationer.

Den CompoZr Custom ZFN sertifikat analyser blir generert med de samme reagensene gitt i settet og dermed sikre at alle komponenter i settet er blitt grundig validert for kunden suksess. Kritiske trinn i arbeidsflyten fra begynnelse til slutt er presentert nedenfor:

Cell kloning

Evnen til å isolere og utvide en gitt celle linje bør testes før du starter noen ZFN eksperimenter. Enkeltceller, bør isoleres og utvides for å sikre at en clonally-avledet befolkning er mulig. Noen cellelinjene er trassig i denne saken, og triks som berikelse for redigerte kloner, eller kultur med aircondition media kan bidra til å overvinne disse utfordringene.

Levering effektivitet

Optimalisering av levering effektivitet er et must før levering av ZFNs. Mange metoder kan brukes inkludert lipid-baserte transfeksjon, electroporation, og nucleofectipå. Den ideelle leveringsmetode består av en som gir den mest optimale blanding av levering effektivitet og celle overlevelse. Quantitating disse effektivitet kan estimeres ved å levere en GFP kontroll plasmid og quantitating ved visuell inspeksjon eller FACS 24-48hrs post-levering.

Cel-I analysen

Det er viktig at Cel-I analysen er utført parallelt med de riktige kontroller for å sikre at PCR, fordøyelsen, og elektroforese parametre ikke vil forstyrre tolkningen av ZFN eksperiment. Hver pakke inneholder kontroll genomisk DNA som brukes til å lage Cel-jeg bildet i sertifikatet for analysen. Forsterkning fra kontroll DNA med de medfølgende primere etterfulgt av Cel-I analysen vil tillate brukeren å sammenligne resultatene med det som er fastsatt i Certificate of Analysis (CofA) bilde, og isolere eventuelle ineffektivitet i dette aspektet av et eksperiment. En egnet negativ kontroll som en narr, eller GFP behandlet celleUtvalget bør også inkludert for å gi forklaring for eventuelle ikke-spesifikke cleavage produkter.

Kvalitativ / Kvantitativ analyse av encellede kloner

Etter ZFN behandling og enkelt celle kloning, kan populasjoner av celler skal skjermes for redigering ved lokaliseringen av interesse ved en rekke metoder. Cel-Jeg analysen kan gjennomføres på genomisk DNA fra kloner for å identifisere kandidater kloner for videre genotyping. Det er viktig å pigge WT PCR fragment i prøven amplikonene i forholdet 1:1 før du utfører Cel-jeg fordøye som homozygote muterte kloner vil inneholde homogene molekyler, og dermed formidle en negativ Cel-Jeg analyseresultat. En alternativ metode for screening disse kandidat kloner er å utforme en PCR-primer landing direkte på ZFN målområde. Brukes sammen med en av de kontroll primere, indikerer et negativt analyseresultat tap av WT sekvensen. En heterozygot klone inneholder minst ett WT allel vil yield PCR signal, men kan skilles fra fullt WT kloner ved å utføre PCR i sammenheng med SYBR qPCR.

Når kandidat kloner har blitt identifisert av metodene ovenfor, kan de bli genotypede av standard pyrosequencing, dyp sekvensering, eller andre sekvensering metoder. For alle sekvensering metoder, bør en fragment opprettet fra klonal genomisk DNA bli generert. For tradisjonelle pyrosequencing alleler kan bli separert av TA-kloning PCR produktet, og sekvensering de enkelte koloniene. For metoder som dypt sekvensering dette trinnet er ikke nødvendig.

Homologi Regissert Repair (HDR)

Denne protokollen gir metoden for ZFN mediert genet knockout via NHEJ. Integrering av transgener kan også utføres av innføring av en donor plasmid med homologi armer som flanke en ZFN kutt nettsted. ^11. I dette scenariet, det ZFN opprettet dobbel-strandet pause blir reparert av HDR istedenfor NHEJ. HDR rettet integration av transgener kan bekreftes ved hjelp av liknende metoder til de prosedyrene som er fastsatt i denne protokollen.

Feilsøking

Levering av ZFNs

ZFN levering og uttrykk-levering kan bli kontrollert for ved levering av en GFP eller andre slike plasmid for visualisering og / eller kvantifisering. Lav uttrykk på grunn av arrangøren inkompatibilitet med celletype av interesse kan overvinnes ved levering av ZFNs i mRNA-format. I tillegg kan kuldesjokk-metoden benyttes til å ytterligere øke effekten av ZFNs i cellene. ^12. Dersom mRNA blir brukt er det viktig at cellene blir vasket før levering for å sikre alle serum-deriverte Rnases har blitt fjernet. Det er også klokt å tine mRNA på is, og tilsett det til cellene i aller siste øyeblikk for å minimere sjansen for nedbrytning.

Cel-I analysen

Stiftelsen av Cel-I assay er konkret og god forsterkning av locus av interesse. Hvis ikke-spesifikke forsterkning produkter er observert bruke standard PCR feilsøkingsprosedyrer å øke spesifisiteten for eksempel optimalisering av mal beløp, primer konsentrasjon, og sykling parametere. Utføre SIDE analyse i motsetning til standard agarose-elektroforese som sistnevnte metoden ikke gir tilstrekkelig oppløsning og følsomhet. Cel-I fordøye forholdene kan også være optimalisert hvis ingen fordøyd produktet eller overdreven smearing er observert. Titrering av mengden av Cel-1 nuklease og / eller lengde av fordøyelsen tid kan titreres for å forbedre disse aspektene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease S (Cel-1 Enzyme)	Transgenomic	706025
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	03 300 242 001
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza Inc.	VCA-1003
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit	Sigma-Aldrich	NA0400