Genoma Edição com CompoZr personalizados Nucleases dedo de zinco (ZFNs)

Summary

O CompoZr personalizado Zinc-Finger Nuclease de Serviços (ZFN) permite edição genoma preciso em qualquer organismo ou linha de células em qualquer lugar geométrico definido pelo utilizador. Este artigo descreve o processo para a concepção, fabricação, validação e implementação do Serviço CompoZr ZFN personalizada.

Abstract

Genoma de edição é uma poderosa técnica que pode ser usado para elucidar a função do gene e da base genética da doença. Gene tradicional edição de métodos como a mutagênese química baseada ou integração aleatória de seqüências de DNA conferir as mudanças indiscriminadas genéticos de uma forma geral ineficiente e exigem a incorporação de indesejáveis ​​sequências sintéticas ou utilização de condições de cultura aberrantes, potencialmente confuso estudo biológico. Por contraste, a expressão transiente em ZFN uma célula pode facilitar preciso, hereditárias edição gene de uma maneira altamente eficiente, sem a necessidade de administração de produtos químicos ou integração de transgenes sintéticos.

Nucleases dedo de zinco (ZFNs) são enzimas que se ligam e cortar sequências distintas de ADN de cadeia dupla (dsDNA). Um funcional CompoZr unidade ZFN consiste em duas individuais proteínas monoméricas que se ligam um DNA "metade" local-de, aproximadamente, 15-18 nucleótidos (ver Figura 1). Quando dois ZFN monomers "casa" para os seus sítios-alvo adjacentes os domínios de clivagem do DNA-dimerizam e criar uma quebra de fita dupla (DSB) no DNA. ¹ Introdução de ZFN mediadas DSBs no genoma estabelece uma base para a edição de genoma altamente eficiente. Reparação imperfeita de LAP em uma célula através da não-homóloga final de adesão via de reparação (NHEJ) de ADN pode resultar em pequenas inserções e deleções (indels). Criação de indels dentro da sequência do gene de codificação de uma célula pode resultar em frameshift e knockout funcional subsequente de um locus do gene de alta eficiência. ² Embora este protocolo descreve o uso de ZFNs para criar um gene knockout, a integração de transgenes podem também ser conduzida através homologia dirigido reparo no local do corte ZFN.

O CompoZr personalizado ZFN serviço representa uma abordagem sistemática, abrangente e bem caracterizada a edição gene alvo para a comunidade científica com a tecnologia ZFN. Cientistas Sigma trabalhar em estreita colaboração com os investigadores a 1) perfoanálise rm diligência devida, incluindo a análise da estrutura dos genes relevantes, biologia, e um sistema de modelo de acordo com as metas do projeto, 2) aplicar esse conhecimento para desenvolver uma boa estratégia de segmentação, 3), em seguida, projetam, constroem e funcionalmente validar ZFNs para a atividade em um relevante linha celular. O investigador recebe ADN genómico de controlo positivo e os iniciadores, e pronto-a-usar reagentes ZFN fornecidos em ambos DNA de plasmídeo e in vitro formato mRNA transcrito. Estes reagentes podem então ser entregue para expressão transiente em linha do investigador célula ou tipo de célula de escolha. As amostras são então testados para a edição no locus do gene de interesse por técnicas padrão de biologia molecular, incluindo amplificação por PCR, digestão enzimática, e electroforese. Depois de sinal positivo para a edição de gene é detectado na população inicial, as células são de uma única célula clonado e genotipados para a identificação de clones mutantes / alelos.

Protocol

1. Processo de Design personalizado ZFN

1. Para agilizar o processo de design ZFN, um investigador deve fornecer:
• Informação sobre o gene alvo, tais como o nome do gene, a espécie, e número de genes de anotação / identificação.
• Um declarou claramente sobre-tudo objetivo do experimento (por exemplo, Knockout, ou Knockin)
• Quaisquer factores específicos do gene alvo que incluem estrutura do gene atípico, biologia especial implicada no locus genético, ou quaisquer regiões homólogas em outras partes do genoma.
• O intervalo específico de seqüência de DNA para o dedo de zinco nucleases atingir.
2. A Sigma equipe de bioinformática conduz in silico projeto ZFN desenvolver iniciais de zinco sítios-alvo do dedo.
3. Sítios-alvo iniciais ZFN são fornecidos com um consultor científico ZFN técnica. Para projetos mais complexos tecnicamente, este cientista Sigma trabalha com os investigadores a desenvolver a estratégia do projecto.
4. Bioinformática fornece os sites de destino top ZFN ao investigador para revisão. Após a aprovação dos locais alvo potenciais ZFN, essa informação é fornecida para a equipe de produção ZFN para iniciar o processo de fabricação ZFN.

2. Produção ZFN personalizado

1. O arquivo Sigma de módulos de dedo de zinco é usado para montar os projetos aprovados ZFN.
2. Cada projeto ZFN é montado e seqüência verificada em uma plataforma alta taxa de clonagem.
3. Uma vez que a produção de todos os projetos ZFN é completar todos os ZFN é enviado para validação.

3. Validação de ZFNs personalizados

1. Projetos em ZFNespécie humana, ratinho, rato ou CHO são validados em linhas de células bem caracterizadas para cada espécie, um ensaio baseado em levedura é usado para outros organismos ou tipos de células.
2. Construções ZFN são entregues para a linha celular apropriada por nucleofection e os ZFNs são expressos.
3. O DNA é colhido a partir do pool de células transfectadas ZFN e da região de interesse é amplificado por PCR.
4. O Cel-1 ensaio é então conduzida sobre o produto de PCR. Eletroforese em gel é executado no-1 Cel ensaio para atividade ZFN validado.
5. A concepção mais elevada ZFN actividade como confirmado pelo ensaio Cel-1 é então fornecida ao cliente. ZFNs são entregues em ARNm e ADN de plasmídeo, juntamente com iniciadores de PCR para o ensaio Cel-1 e DNA genómico como um controlo positivo.

4. Entrega de ZFNs validados pelo Nucleofection

1. Semente as células a uma densidade de 2x10 células / ml ⁵ o dias antes nucleofection.
2. No dia da nucleofection,tirar Linhagem Celular Nucleofector Kit V e deixe aquecer à temperatura ambiente.
3. Adicionar o suplemento ao Nucleofection Solução V de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Contar as células. Densidade de células deve ser entre 2,5-5x10 ⁵ células / ml.
5. Encher uma placa de 6 poços com 2 ml de meio em cada poço e pré-aquecido em um _incubador de CO2 a 37 ° C durante pelo menos 20 minutos antes da nucleofection.
6. Centrifugar 2x10 células por transfecção ⁶ (total 8x10 ⁶⁾ em 200xg durante 5 minutos.
7. Lave as células duas vezes com 20 ml de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS).
8. Prepare os tubos experimentais: (ver tabela em Custom boletim técnico ZFN)
9. Remova a placa de 6 poços contendo meio a partir do passo (6,5) da incubadora.
10. Ressuspender as células em 400 uL (100 uL / ​​reacção) de solução de Nucleofection V.
11. Uma reacção a uma hora, adicionar 100 uL de células para cada DNA ou mRNA contendo-tubo. Transfer a mistura para uma cuvete de electroporação 2 milímetros e nucleofect sobre uma Nucleofector com o programa apropriado.
12. Imediatamente após nucleofection de cada amostra, utilizar uma pipeta de transferência para adicionar ~ uL de meio de 500 pré-aquecido a partir da placa de 6 poços no passo (6,9) para a cuvete. Em seguida, transferir cuidadosamente a partir de células da cuvete para o meio restante pré-aquecido na placa de 6 poços.
13. Terminar todas as reacções e retornar a placa de 6 poços para a _incubadora de CO2 a 37 ° C.

5. Colheita DNA genômico após a entrega do ZFNs

1. 6-bem placa - não colher todas as células em pool. É importante manter a cultura, a fim de ter células para clone de célula única diluição depois de confirmar que você tem produtos Cel-1 de digestão. Uma a três dias após a nucleofection recolher as células para preparar DNA cromossómico usando o GenElute Mammalian DNA genómico Kit Miniprep.

6. Cel-1 Ensaio

PCR amplificar o ADN genómico a partir das amostras ZFN transfectadas eo DNA genómico positivo de controlo fornecidos no kit, utilizando os iniciadores fornecidos. A reação de PCR está configurado com as seguintes condições: (ver tabela em Custom boletim técnico ZFN).

Para gerar heteroduplexes dos homoduplexes PCR tomar 10 ul de reacção de PCR a partir de cada amostra tratada ZFN mais o controle e utilizar o seguinte programa no termociclador:
95 ° C, 10 minutos
95 ° C a 85 ° C, -2 ° C / segundo
85 ° C a 25 ° C, -0,1 ° C / segundo
4 ° C, indefinidamente

Adicionar 1 ml de enhancer e 1 uL de Nuclease S (a partir de Número de Catálogo Transgenomic 706.025) a cada reacção e incubar a 42 ° C durante 20-40 minutos.

Executar as digestões em um 10% gel TBE-PAGE com marcadores apropriados, tais como DirectLoad Ladder DNA WideRange (Número de catálogo D7058) (ver resultados em boletim técnico personalizado ZFN).

Emce sinal positivo foi detectado em ZFN tratados com populações por cel-I ensaio, proceder ao isolamento e caracterização de clones.

7. Isolamento e Caracterização Clonal

1. De uma única célula de clones das amostras ZFN-tratadas por métodos padrão, incluindo FACS e clonagem de diluição.
2. Permita que os clones para expandir o suficiente, então, dividir alguma proporção de células para a colheita do DNA genômico, o congelamento de volta o restante como material depositado.
3. Amplificar o ADN genómico a partir dos clones utilizando os primers Cel-I e analisar o fragmento amplificado por Cel-I de ensaio (com e sem ADN WT enriquecida em), ou alternativamente utilizar este fragmento amplificado para seguir directamente para a genotipagem.
4. Clones candidatos Genótipo identificados como tendo alelos editado por o método preferido.

8. Os resultados representativos

Um exemplo de todo o CompoZr ZFN fluxo de trabalho é apresentado na Figura 2. ZFNs são entreguespara as células onde eles se ligam e clivar a sequência de ADN adequada que cria uma quebra de cadeia dupla (DSB). O processo de reparação natural, não-homóloga acabam unindo (NHEJ), os reparos do DSB. Em alguns casos resultados aberrantes NHEJ em inserção, deleção ou substituição de nucleótidos. A amplificação por PCR de ADN genómico colhidas resultados na formação de heteroduplex entre tipo selvagem e amplicões modificados após a desnaturação / etapa de recozimento da reacção de PCR. Além dos resultados Cel-1 enzima na clivagem de quaisquer moléculas de heteroduplex. Cel-1 resultados são resolvidos por análise de PAGE para confirmar a clivagem ZFN. A Figura 3 fornece um diagrama esquemático do ensaio Cel-1 e os resultados esperados.

Representativos Cel-1 resultados estão contidos nas Figuras 4 e 5 A Figura 4 contém os resultados de um par muito activa de ZFNs (21%) em células K562;. Figura 5 contém resultados de um par menos activo (2,4%) de ZFNs emCélulas K562. Actividade ZFN é confirmada em ambas as figuras pela presença de dois fragmentos de PCR abaixo do fragmento de PCR parental.

Figura 1. ZFNs representação de nucleases de dedo de zinco ligados. São concebidos proteínas compostas de um dedo de zinco de ligação do ADN do domínio fundido com o domínio de clivagem da endonuclease de restrição FokI. Quando ligado como um heterodímero, ZFNs criar uma quebra de cadeia dupla em uma seqüência de DNA do usuário especificado.

Figura 2. Esquema do fluxo de trabalho personalizado Serviço ZFN. Representação gráfica do fluxo de trabalho para gerar uma linhagem de células geneticamente modificadas utilizando ZFNs CompoZr.

Figura 3. Esquemática do ensaio Cel-1 e os resultados. A) ZFN o plasmídeo mRNA r é entregue a células. B) Expressa ligam ZFNs e cortar sua seqüência alvo a criação de uma ruptura de fita dupla (DSB) em uma porção de células. C) reparação aberrante de alguns DSBs por não-homóloga acabar juntando resultados na inserção de nucleotídeo ou eliminação. D) O ADN genómico é colhido a partir do pool de células transfectadas e amplificado no locus de interesse. EF) produto de PCR é desnaturado e re-recozida a criação de formação heteroduplex entre tipo selvagem e amplicões modificados. G) Os Cel-1 de desadaptação resultados de endonucleases de ensaio na clivagem de moléculas de heteroduplex. H) Cel-1 enzima digere são resolvidos por PAGE. A proporção observada de produto de clivagem a banda parentérica, determinada por ImageJ software, indica a fracção de corte e da eficiência das ZFNs.

Figura 4. Cel-1 resultados de 21% ZFNs ativos software ImageJ está disponível em.:_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Figura 5. Cel-1 resulta de 2,4% ZFNs ativos software ImageJ está disponível em:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .

Discussion

Uma vez que ZFN modificados células são isoladas têm permanente e hereditárias modificações no DNA. Isso resulta na capacidade de gerar linhagens de células estavelmente modificados ou de animais da raça com modificações genéticas desejadas para realizar a investigação. ZFNs CompoZr personalizadas proporcionam um método robusto para genoma edição em uma grande variedade de tipos de células. Publicação de genoma bem sucedida edição com ZFNs inclui mas não está limitado às linhas de células humanas, ratinho, rato, peixe-zebra, rã, suínos e modelos de pesquisa CHO. ^{3,4,5,6,7,8,9} A capacidade de criar um ruptura de fita dupla no local alvo desejado no tipo de célula especificado é assegurada quando os ZFNs são adequadamente entregue em uma célula. É também possível realizar modificações dedo sequenciais de zinco para uma célula a fim de ter mais do que uma modificação genética dentro de uma célula. ¹⁰ A capacidade para seleccionar uma sequência alvo específica e modificar apenas que o locus em particular é uma causa primária para a capacidade de criar múltipla modificátions.

O CompoZr personalizado certificado ZFN de análise é gerado com os reagentes próprios fornecidos no kit assegurando assim que todos os componentes do kit, foram exaustivamente validado para o sucesso do cliente. As etapas críticas do fluxo de trabalho do começo ao fim são apresentados a seguir:

Clonagem de células

A capacidade de isolar e expandir uma linha de células dada devem ser testados antes de iniciar quaisquer experiências ZFN. Células individuais devem ser isoladas e expandidas para garantir que uma população clonal derivada é possível. Algumas linhas de células são recalcitrantes nesta matéria, e os truques como o enriquecimento de clones editados ou cultura com a mídia condicionado pode ajudar a superar esses desafios.

Eficiência na entrega

Otimização da eficiência na entrega é uma obrigação antes da entrega das ZFNs. Muitos métodos podem ser utilizados, incluindo lípido baseado transfecção, electroporação, e nucleofectipor diante. O método de entrega ideal consiste de um que proporciona a mistura mais óptima de eficiência de entrega e sobrevivência celular. Quantificar as eficiências podem ser estimados através da apresentação de um controle GFP plasmídeo e quantificação através de inspeção visual ou FACS 24-48hrs pós-parto.

Cel-I ensaio

É imperativo que Cel-I ensaio é realizado em paralelo com os controlos apropriados para assegurar que os parâmetros de PCR, digestão, e electroforese não irá interferir com a interpretação da experiência ZFN. Cada kit inclui DNA genómico de controlo que é utilizado para criar a imagem Cel-I no certificado de análise. Amplificação do DNA controle com os primers fornecidos seguido por Cel-I ensaio permitirá ao usuário comparar os resultados com o previsto no Certificado de Análise (COFA), imagem e isolar todas as ineficiências potenciais neste aspecto de uma experiência. Um controle negativo adequado, como um simulacro, ou GFP tratados celularamostra deve também ser incluída para permitir a elucidação de quaisquer produtos não específicos de clivagem.

Qualitativa / quantitativa análise de clones de célula única

Após tratamento e ZFN clonagem única célula, as populações de células podem ser rastreados para a edição no locus de interesse, um número de métodos. Cel-I ensaio pode ser conduzido sobre o DNA genómico a partir de clones com a finalidade de identificar clones candidatos para genotipagem adicional. É importante a espiga amplicon PCR WT nas amplicões amostra com uma proporção de 1:1 antes da realização do Cel-I digerir como homozigotas clones mutantes irá conter moléculas homogéneas e, assim, transmitir um resultado Cel-I ensaio negativo. Um método alternativo para o rastreio destes clones candidatos consiste em conceber uma aterragem iniciador de PCR directamente no local alvo ZFN. Utilizado em conjunto com um dos iniciadores de controlo, um resultado de ensaio negativo indica perda da sequência de WT. Um clone heterozigótica contendo pelo menos um alelo WT irá yield PCR sinal, mas podem ser segregados a partir de clones completamente WT efectuando a PCR no contexto da SYBR qPCR.

Uma vez que os clones candidatos foram identificados através dos métodos acima, eles podem ser genotipados por pyrosequencing padrão, a sequenciação de profundidade, ou outros métodos de sequenciação. Para todos os métodos de sequenciação, um fragmento amplificado criado a partir do ADN genómico clonal deve ser gerada. Para alelos pyrosequencing tradicionais podem ser segregados por TA-clonagem do produto de PCR, e sequenciação das colónias individuais. Para os métodos de sequenciação, tais como profunda este passo não é necessário.

Reparação homologia Dirigido (HDR)

Este protocolo fornece o método para ZFN nocaute de genes mediada via NHEJ. Integração dos transgenes também pode ser realizado através da introdução de um doador plasmídeo com braços de homologia que ladeiam um site corte ZFN ^11. Neste cenário, o ZFN criado double-stranded break é reparado por HDR em vez de NHEJ. HDR dirigido iINTEGRAÇÃO de transgenes podem ser confirmados utilizando métodos semelhantes aos procedimentos estabelecidos ao longo deste protocolo.

Solução de problemas

Entrega de ZFNs

Entrega ZFN e expressão de entrega-pode ser controlada pelo fornecimento de uma GFP ou outro tal plasmídeo para visualização e / ou quantificação. Baixa expressão devido à incompatibilidade promotor com o tipo de célula de interesse pode ser superado pela entrega de ZFNs em formato de mRNA. Adicionalmente, o método do choque térmico pode ser utilizado para aumentar ainda mais a eficácia da ZFNs nas células. ¹² Se mRNA é usado, é imperativo que as células são lavadas antes da entrega para assegurar que todas as RNases de soro derivadas de ter sido removido. Também é prudente para descongelar o mRNA em gelo, e adicionar o que para as células no último momento para minimizar qualquer possibilidade de degradação.

Cel-I ensaio

A fundação da assa Cel-Iy é a amplificação específica e ampla do locus de interesse. Se os produtos não-específicas de amplificação são observados usar os procedimentos padrão de PCR solução de problemas para aumentar a especificidade, tais como a otimização da quantidade de modelos, a concentração dos iniciadores, e ciclismo parâmetros. Realizar a análise PAGE em oposição a electroforese em agarose padrão como o último método não proporciona resolução adequada e sensibilidade. Condições Cel-I digerir também pode ser otimizado se não houver produto digerido ou manchas excessivo é observado. Titulação da quantidade de Cel-1 nuclease e / ou duração de tempo de digestão pode ser titulada para melhorar estes aspectos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease S (Cel-1 Enzyme)	Transgenomic	706025
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	03 300 242 001
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza Inc.	VCA-1003
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit	Sigma-Aldrich	NA0400