Summary
Le brassard de constriction présentés dans cet article est conçu pour induire l'athérosclérose dans l'artère carotide commune murin. Grâce à la forme conique de sa lumière intérieure de la coiffe des implantée génère régions bien définies de la basse, la contrainte de cisaillement élevées et oscillatoires déclenchant le développement des lésions athérosclérotiques des différents phénotypes inflammatoires.
Abstract
Il est largement admis que les altérations de la contrainte de cisaillement vasculaires déclencher l'expression de gènes inflammatoires dans les cellules endothéliales et induire ainsi l'athérosclérose (revue en 1 et 2). Le rôle de la contrainte de cisaillement a été largement étudiées in vitro d'étudier l'influence de la dynamique de l'écoulement sur les cellules endothéliales en culture 1,3,4 et in vivo dans les grands animaux et les humains 1,5,6,7,8. Cependant, hautement reproductible de petits modèles animaux permettant l'investigation systématique de l'influence des contraintes de cisaillement sur le développement des plaques sont rares. Récemment, Nam et al. 9 introduit un modèle de souris dans lequel la ligature des branches de l'artère carotide crée une région de faible débit et oscillatoire. Bien que ce modèle entraîne une dysfonction endothéliale et la formation rapide de lésions athéroscléreuses chez les souris hyperlipidémiques, il ne peut pas être exclu que la réponse inflammatoire est observée, du moins en partie, une conséquence of endothéliales et / ou des dommages aux vaisseaux due à la ligature.
Afin d'éviter de telles limitations, un brassard de la contrainte de cisaillement modification a été développé basé sur la dynamique des fluides calculés, en forme de cône dont la lumière interne a été choisi pour créer des régions définies du bas, des contraintes de cisaillement élevées et oscillatoires au sein de l'artère carotide commune 10. En appliquant ce modèle chez la souris knockout apolipoprotéine E (apoE) nourris avec un régime riche en cholestérol de type occidental, les lésions vasculaires développer en amont et en aval du brassard. Leur phénotype est corrélé à la dynamique des flux régionaux 11 comme le confirme in vivo en imagerie par résonance magnétique (IRM) 12: contrainte de cisaillement faible et laminaire en amont de la coiffe des causes de la formation de plaques étendues d'un phénotype plus vulnérables, alors que oscillatoires aval de la contrainte de cisaillement le brassard induit des lésions athérosclérotiques stables 11. Dans ces régions de la contrainte de cisaillement élevé et à flux laminaire élevé au sein de la coiffe,généralement pas de plaques d'athérosclérose sont observées.
En conclusion, la procédure de la coiffe des contraintes de cisaillement modificateur est une approche fiable pour produire chirurgicale phénotypiquement différentes lésions athérosclérotiques dans les souris déficientes en ApoE.
Protocol
1. Préparer le modificateur contrainte de cisaillement (manchette)
- Le modificateur de la contrainte de cisaillement se compose de deux moitiés longitudinales d'un cylindre avec une lumière en forme de cône. Les demi-coques sont faites de polyéthercétone thermoplastique produit par un procédé de coulée en plastique. Les éléments de fonte sont envoyés tout relié à la roue. Ainsi, les demi-coquilles doivent être coupés avant l'utilisation. Chaque fonte contient des demi-coquilles de différentes tailles allant de 150 um - 300 um (diamètre intérieur plus bas à la fin de l'aval).
- La préparation brassard doit être réalisée sous un microscope chirurgical.
- Tenez la demi-coquille coiffe avec une pince émoussée et doucement le couper de la fonte en utilisant un scalpel tranchant. Cette procédure conduira à la moitié des précurseurs shell qui doivent être traitées ultérieurement.
- Placez le précurseur demi-coquille sur une plaque de même les non-glissantes, de la fixer avec une pince émoussée et le couper exactement le long de l'incision préformée pour remOve l'extrémité fermée. Cela donnera la demi-coquille coiffe prêt à l'emploi.
- Contrôle de la demi-coquilles sous le microscope et retirez délicatement les bords restent vifs. La lumière interne conique est essentielle pour induire différentes qualités de la contrainte de cisaillement à l'intérieur, en amont et en aval de la coiffe implanté. Une rainure sur la surface extérieure des demi-coquilles perpendiculaire à la lumière interne sert de guide pour le fil qui colle enfin les demi-coquilles pour former le brassard fonctionnel.
- Stocker les demi-coquilles manchette, classées selon leur taille, dans de l'éthanol à 70%.
2. Implanter le brassard autour de l'artère carotide droite
- Souris knockout ApoE devrait être autour de 10 semaines d'âge et à un poids d'au moins 20 grammes. Si le développement des plaques doit être étudié sous régime riche en cholestérol, en commençant par exemple un régime de type occidental 4 semaines avant l'implantation brassard est recommandée.
- L'ensemble de la procédure chirurgicale doitêtre effectuée au moins sous conditions semi-stériles: Porter une blouse chirurgicale, masque et chapeau et gants stériles. Stériliser les instruments pendant 30 secondes dans un stérilisateur à billes instruments et les placer sur une feuille stérile opaque. Méfiez-vous! Des instruments ont pour refroidir avant de l'utiliser!
- Placez la souris dans une chambre d'induction anesthésique remplie avec 3% d'isoflurane jusqu'à ce qu'il soit complètement anesthésiés. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie avec la réponse à pincement de l'orteil. Sinon, une anesthésie peut être réalisée avec intrapéritonéale (IP) d'injection de kétamine (80 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) ou autre anesthésiques approuvés par le IACUC. Pour une injection ip, maintenez la souris en position couchée et injecter l'anesthésique dans le quadrant inférieur gauche de l'abdomen.
- Placez la souris sur une plaque chauffée chirurgicale, en position couchée. Afin d'éviter les yeux de la marche à sec les humidifier avec collyre (par exemple, Bepanthen yeux et du nez lotion). Fais l'avant-et pattes arrière et les bandes en bas de la plaque. Si vous effectuez l'isoflurane, le débit de gaz narcotiques (2% d'isoflurane) doit être alimenté via un masque de petit rongeur.
- Enlever les poils entre la mandibule et le sternum soit par l'agent appliquant dépilatoires (par exemple Pilca Med) ou en utilisant une amende rasoirs électriques (par exemple, Wella Contura). Rasage doit être effectuée avec prudence afin d'éviter d'irriter la peau. Si vous utilisez un agent dépilatoire, donner 1-2 min pour pénétrer les cheveux, par la suite, frottez doucement jusqu'à ce que tous les cheveux et agent dépilatoire est supprimé.
- Avez prêts préalablement préparé demi-coquilles coiffe de différentes tailles (deux de chaque taille) et un 2,5 cm de long morceau de 6-0 suture de soie pour interconnecter les demi-coquilles sur le site de l'occlusion carotidienne.
- Désinfecter le champ opératoire avec une quantité libérale de Betadine. Utilisez de petits ciseaux pointus pour ouvrir la peau et le fascia sous-jacent de la nuque par une incision médiane 4-5mm à partir du haut du sternum (manubrium).
- Développer l'ouverture, shift l'glande parotide droite de côté et insérez un épandeur chirurgicale. Puis décortiquer carrément dans l'abîme, juste à gauche de la trachée (du point de vue des chirurgiens), où le muscle sternomastoideus droite traverse le muscle droit omohyoïdien, jusqu'à ce que vous êtes capable d'identifier la pulsation carotidienne droit commun.
- L'utilisation très fine pince coudée ou courbée (par exemple, Dumont # 5 / 45), disséquer le artère carotide commune droite en enlevant doucement le tissu conjonctif environnant. Séparez les carotides du nerf vague - le blanc, objet filandreuse exécuter directement le long de la carotide - que cette étape est nécessaire pour complètement exposer le navire. Soyez prudent, ni de nuire le nerf vague, ni une branche de la veine jugulaire interne gauche, qui est également en relation étroite à la carotide.
- Afin de choisir la taille qu'il vous faut, comparer le diamètre de la carotide exposée avec le diamètre intérieur des demi-coquilles brassard: La plus grande largeur de la lumière devrait répondre aux poignets, le diamètre extérieur de la carotide. Maintenant, soigneusement mis le bout de la pince sous la carotide, ouvrez la pince, fil de la pièce de 6-0 suture de soie sous la carotide et former une boucle. Entre la boucle et le lieu de la carotide une demi-coquille coiffe sous la carotide. Le côté du plus grand resserrement doit être en aval.
- Placez la coquille coiffe seconde moitié dans la boucle sur le dessus de la carotide.
- Serrer doucement la boucle de suture à l'aide des pinces suture et le nœud du fil. En faisant cela, le modificateur de stress fonctionnement de cisaillement est formé. Pour l'ajustement précis de la coiffe, il est essentiel que la suture est en marche exactement dans la rainure préformée sur la surface externe de la coiffe.
- Déplacez le glande parotide droite de retour à sa position initiale, approximative et proche de la peau soit en utilisant une petite quantité de 6-0 suture Prolène ou, alternativement, vous pouvez utiliser des clips plaie.
- Injecter une dose unique de 5 mg / kg carprofène (par exemple Rimadyl) sous-cutanée à fournir un traitement prophylactique des douleurs et le lieula souris dans une chambre de réchauffement jusqu'à ce qu'il récupère. Normalement, cela prend 30-60 minutes lors de l'utilisation d'anesthésie kétamine / xylazine. Lorsque vous utilisez l'isoflurane anesthésie par inhalation de la période de récupération est sensiblement plus courte (10-20 min).
- Dans notre expérience, les animaux retrouver une activité normale atones dans les 24 premières heures après l'implantation brassard avec l'intervention étant effectuée par un chirurgien expérimenté. Toutefois, si l'animal semble être en difficulté même un jour post-opératoire, répéter le traitement antalgique et consulter le personnel vétérinaire.
3. Explantation de la manchette et les artères carotides
- Pour l'analyse histologique des artères carotides doivent être récoltés à la fin de la période d'observation. Avant de commencer l'explantation, l'animal doit être tué selon les directives du IACUC.
- Si les demi-coquilles brassard sont destinées à être réutilisées, retirez soigneusement tous les fragments de tissus et de la suture connectant à partir des éléments en plastique, DISsecting des artères carotides, laver et stocker les demi-coquilles dans une solution d'alcool à 70%. Il convient de garder à l'esprit que le brassard est ancrée dans le tissu conjonctif adhérences après plusieurs semaines d'implantation et que l'on a de disséquer le brassard avec prudence afin de ne pas nuire à la paroi des vaisseaux.
- Alternativement, le brassard peut être explantés et intégrés en collaboration avec l'artère carotide. La matière plastique de la coiffe est résistant à des solutions de fixation normale et les solvants utilisés pour l'enrobage de paraffine. En outre, les échantillons embarqués peuvent être coupés à l'aide d'un microtome normale équipée de lames normales.
4. Les résultats représentatifs
Le brassard doit être placé toujours autour de l'une des deux artères carotides communes d'un animal (fig. 1A, 1B) - du côté controlatéral sert de contrôle. Sur l'image présentant les deux demi-coquilles de la coiffe (Fig. 1B) la forme conique de la lumière interne est visible. Cette forme conique est essentiel pour establishing les trois régions où la dynamique des flux distincts. Typiques motifs contrainte de cisaillement induite par la fonte calculée à partir de mesures Doppler 11 et les vitesses d'écoulement correspondant basé sur la vitesse à contraste de phase IRM 12 sont donnés dans la Figure 2.
Lorsque le brassard est implanté dans des souris knockout ApoE nourris avec un régime de type occidental de la modification du débit dynamique de provoquer un stress de cisaillement induite dépôt plaque d'athérome (Fig. 3): En amont de la constriction faible contrainte de cisaillement laminaire coniques conduit à un développement massif des plaques d'athérosclérose d'une plus phénotype vulnérables, caractérisées par des noyaux de lipides proche de la lumière centrale couverte que par une chape fibreuse mince (Fig. 3A1). La lumière intérieure conique du poignet conduit à une augmentation de la vitesse d'écoulement. Presque pas de dépôt de plaque est observée dans ce domaine. Directement en aval du site du goulot d'étranglement de l'élargissement immédiat des résultats artère dans une zone de tourbillons et oscillatoire floparamètres w, ce qui provoque le développement des plaques moins étendu d'un phénotype plus stable (noyaux à savoir lipides, qui sont moins localisées plus près aux médias).
Figure 1 Le modificateur contrainte de cisaillement - d'assemblage et de placement (A) Représentation schématique de la coiffe implanté:.. Le brassard est placé autour de l'artère carotide commune droite (CRAC) - du côté controlatéral (LCCA = artère carotide commune gauche) sert de contrôle . (B) In vivo l'angio-IRM dans une souris: Dans la projection d'intensité maximale d'un en trois dimensions du temps de vol angiographie MR de la constriction induite par la forme conique exprimés (flèche blanche) est visible (pour plus de détails voir 12). (H = la tête, F = pieds, R = droite, L = gauche). Dans le coin supérieur droit d'une vue macroscopique sur la lumière intérieure et la surface extérieure des demi-coquilles brassard est donné. Une fois assemblé, deux demi-coquilles former un cylindre conique qui modifiela dynamique d'écoulement dans la cuve d'une manière définie. Pour assurer le bon ajustement, une rainure sur la surface externe de la coiffe (flèche jaune) sert de guide pour la suture reliant.
Figure 2. Régions de la dynamique des flux différents et des contraintes de cisaillement. Implantation de la dynamique de la coiffe le flux et le stress altère la suite de cisaillement dans l'artère carotide dans constriction d'une manière définie. Dans la représentation schématique supérieure les propriétés d'écoulement différentes sont indiquées et les valeurs locales approximatif pour des contraintes de cisaillement sont donnés (basé sur les mesures Doppler 11). Ci-dessous, les vitesses d'écoulement correspondantes pour un seul animal mesurée par IRM en amont de la coiffe des implantés sont présentés dans un pondérées en T1 transversale IRM image de la nuque (imagerie par contraste de phase de vitesse, pour plus de détails voir 12).
Figure 3. La contrainte de cisaillement induit le développement des plaques chez les souris KO ApoE. Le coin supérieur gauche montre la vue macroscopique sur le cou ouvert et exposé les artères carotides d'une souris KO ApoE sous haute teneur en graisses (type occidental) alimentation 8 semaines après l'implantation d'une contrainte de cisaillement modificateur autour de l'artère carotide commune droite (CRAC). La région blanc opaque sur le navire (*) en amont de la coiffe correspond à un site de dépôt de la plaque d'athérosclérose étendue. La flèche jaune indique le thread qui combine les deux moitiés du brassard. En revanche, il n'ya aucun signe de dépôt de plaque dans l'artère coronaire gauche commune (ACCV).
(A) - (C) représentant Il a taché les sections de l'artère carotide commune droite d'une souris KO ApoE sous régime de type occidental 8 semaines après l'implantation de la manchette. La représentation schématique donne les avions correspondants (lignes pointillées) Where les sections ont été localisés. (A) en amont de l'athérosclérose coiffe conduit au dépôt de plaque massive. Noyaux lipidiques Grande (flèches rouges), qui sont en partie situé à proximité de la lumière centrale (détail A1) de caractériser le caractère vulnérable de ces plaques. (B) Au plan de la coiffe le goulot d'étranglement presque pas le développement des plaques est évident, alors que directement en aval de la coiffe (C) écoulement oscillatoire conduit à modérer le développement des plaques d'un type plus stable (c'est à dire des noyaux lipidiques moins ou pas). (C1, C2 = demi-coquilles de la coiffe, P = plaques, astérisque = navire de lumière)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Afin de minimiser les variations expérimentales, il est recommandé de travailler avec les animaux de près le même âge et avec l'histoire même régime alimentaire. Une enquête publiée récemment démontre que le modificateur contrainte de cisaillement appliquée chez les souris de type sauvage pourrait être un bon modèle pour l'enquête de la dysfonction endothéliale et au début des réactions inflammatoires induites par la modification du débit dynamique de 13. Cependant, pour l'enquête sur la plaque d'athérosclérose modèles transgéniques hyperlipidémiques de développement de la souris (par exemple les souris knock-out ApoE) sont obligatoires. Progression et étendue des dépôts de plaque dans chaque modèle de souris dépendent du type d'alimentation utilisé. En général, la teneur élevée en cholestérol / graisses de l'alimentation, le plus rapide de la progression de la maladie est.
Pendant l'implantation coiffe le chirurgien devrait tenter de minimiser les dommages des tissus et la manipulation, pour cela permettra de diminuer les réactions inflammatoires en raison d'une blessure. Minimiser blessure est particulièrement important lorsqueprocessus inflammatoires dans le cours de l'athérosclérose sont au centre de l'étude. Afin d'estimer le degré de l'inflammation post-opératoire, il est fortement recommandé d'implanter poignets de contrôle non-contraignant, dans certains animaux. Le brassard de contrôle devrait être un cylindre constitué du même matériau, mais avec une constante, non constrictive diamètre intérieur.
Il est également essentiel de toujours placer le brassard à la même position de l'artère carotide et de choisir toujours le même côté, les vitesses d'écoulement contraire ne sont pas reproductibles. Le chirurgien doit prendre grand soin de la bonne de la coiffe en combinant les deux demi-coquilles manchette, parce mauvais résultats concordent dans une forme conique, ne sont pas facilement lumière intérieure qui à son tour conduit à des paramètres de flux imprévisibles.
Un grand avantage du modificateur contrainte de cisaillement est qu'il crée trois régions bien définies avec des motifs caractéristiques et reproductible des vitesses d'écoulement dans le même bateau (Fig. 2, tableau 1). Dans un environnement hyperlipidémiques chacun de ces modèles d'écoulement provoquer un dépôt de plaque d'un phénotype caractéristique (Fig. 2) ressemblant à des plaques vulnérables et stable chez les humains.
Ainsi, le brassard de souris présenté carotide est un précieux modèle in vivo pour l'étude des contraintes de cisaillement induites phénotypes la plaque (stables et instables). Par ailleurs, il pourrait être également un modèle animal idéal pour les petits le développement de nouveaux traceurs d'imagerie moléculaire, conçu pour identifier des sites au début de l'athérosclérose avant même le dépôt de plaque progressé conduit à une sténose ou une rupture de plaque, l'événement initial donnant lieu à des événements graves cardio-vasculaires comme la formation de thrombus et d'infarctus du myocarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été financée en partie par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), le projet PI GZ 771/1-1; SFB 656 "Imagerie moléculaire cardiovasculaire», Münster, Allemagne (projets C6, Z2, B3 et PM3); UE NoE «Diagnostic Molecular Imaging-DIMI "(WP 11.1 et 11.2). L'étude a également été financé en partie par la British Heart Foundation, Royaume-Uni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shear stress modifier (polyetherketone) |  Promolding BV |
References
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab. Invest. 85, 9-23 (2005).
- Ali, F., Zakkar, M., Karu, K., Lidington, E. A., Hamdulay, S. S., Boyle, J. J., Zloh, M., Bauer, A., Haskard, D. O., Evans, P. C., Mason, J. C. Induction of the cytoprotective enzyme heme oxygenase-1 by statins is enhanced in vascular endothelium exposed to laminar shear stress and impaired by disturbed flow. J. Biol. Chem. 284, 18882-18892 (2009).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293, C1824-C1833 (2007).
- Zheng, J., Abendschein, D. R., Okamoto, R. J., Yang, D., McCommis, K. S., Misselwitz, B., Gropler, R. J., Tang, D. MRI-based biomechanical imaging: initial study on early plaque progression and vessel remodeling. Magn. Reson. Imaging. 27, 1309-1318 (2009).
- Stone, P. H., Coskun, A. U., Kinlay, S., Clark, M. E., Sonka, M., Wahle, A., Ilegbusi, O. J., Yeghiazarians, Y., Popma, J. J., Orav, J., Kuntz, R. E., Feldman, C. L. Effect of endothelial shear stress on the progression of coronary artery disease, vascular remodeling, and in-stent restenosis in humans: in vivo 6-month follow-up study. Circulation. 108, 438-444 (2003).
- Pedersen, E. M., Oyre, S., Agerbaek, M., Kristensen, I. B., Ringgaard, S., Boesiger, P., Paaske, W. P. Distribution of early atherosclerotic lesions in the human abdominal aorta correlates with wall shear stresses measured in vivo. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 18, 328-333 (1999).
- Buchanan, J. R., Kleinstreuer, C., Truskey, G. A., Lei, M. Relation between non-uniform hemodynamics and sites of altered permeability and lesion growth at the rabbit aorto-celiac junction. Atherosclerosis. 143, 27-40 (1999).
- Nam, D., Ni, C. W., Rezvan, A., Suo, J., Budzyn, K., Llanos, A., Harrison, D., Giddens, D., Jo, H. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 1535-1543 (2009).
- Cheng, C., van Haperen, R., de Waard, M., van Damme, L. C., Tempel, D., Hanemaaijer, L., van Cappellen, G. W., Bos, J., Slager, C. J., Duncker, D. J., van der Steen, A. F., de Crom, R., Krams, R. Shear stress affects the intracellular distribution of eNOS: direct demonstration by a novel in vivo technique. Blood. 106, 3691-3698 (2005).
- Cheng, C., Tempel, D., van Haperen, R., van der Baan, A., Grosveld, F., Daemen, M. J., Krams, R., de Crom, R. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 113, 2744-2753 (2006).
- van Bochove, G. S., Straathof, R., Krams, R., Nicolay, K., Strijkers, G. J. MRI-determined carotid artery flow velocities and wall shear stress in a mouse model of vulnerable and stable atherosclerotic plaque. MAGMA. 23, 77-84 (2010).
- Cuhlmann, S., Van der Heiden, K., Saliba, D., Tremoleda, J. L., Khalil, M., Zakkar, M., Chaudhury, H., Luong, L. A., Mason, J. C., Udalova, I., Gsell, W., Jones, H., Haskard, D. O., Krams, R., Evans, P. C. Disturbed Blood Flow Induces RelA Expression via c-Jun N-Terminal Kinase 1: A Novel Mode of NF-{kappa}B Regulation That Promotes Arterial Inflammation. Circ. Res. 108, Forthcoming (2011).
