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Medicine

植入小鼠触发剪应力致动脉粥样硬化的颈袖

doi: 10.3791/3308 Published: January 13, 2012

Summary

本文介绍的收缩袖口的设计,以诱导小鼠左颈总动脉粥样硬化。由于其内腔的圆锥形植入袖口产生良好定义的低,高和振荡剪切引发动脉粥样硬化病变的不同炎症表型的发展压力的地区。

Abstract

它已被广泛接受,血管剪应力的改变引发的内皮细胞的炎性基因表达,从而诱发动脉粥样硬化(1和​​2审查)。剪切力的作用已被广泛研究,在体外血流动力学1,3,4对体外培养的内皮细胞的影响进行调查,并在较大 动物和人类1,5,6,7,8的体内。然而,高度重复性的小动物模型,使斑块发展的剪应力的影响进行系统的调查是罕见的。近日,南等9中引入的一个小鼠模型中,结扎颈内动脉的分支创建一个低和振荡流的地区。尽管这种模式导致血管内皮功能障碍和高脂血症小鼠动脉粥样硬化病变的迅速形成,它不能被排除,所观察到的炎症反应是,至少有一部分,因此Øf内皮细胞和/或因结扎血管损伤。

为了避免这种局限性,剪应力修改袖口已经开发基于计算流体动力学,其锥体形内腔被选为低,高和振荡剪切应力定义的区域内常见的颈动脉10。通过应用这个模型中载脂蛋白E(APOE)基因敲除小鼠喂食高胆固醇,西方型饮食,血管病变发展的上游和下游,从袖口。其表型相关, 证实在体内磁共振成像(MRI)12区域流动的动态 11:低和层剪应力的袖口上游原因形成的一个更容易的表型广泛的斑块,而振荡剪切应力下游袖口诱导稳定动脉粥样硬化病变11。在这些地区的高剪切应力和高层流内的袖口,通常没有观察到动脉粥样硬化斑块。

总之,剪应力修改袖口过程是一个可靠的生产ApoE基因缺陷小鼠的表型不同的动脉粥样硬化病变的手术方式。

Protocol

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1。准备剪应力修饰符(袖口)

  1. 剪应力修饰符 由两个纵向半圆柱与一个锥形腔。半壳是塑料铸造过程中产生的热塑性聚醚。投元素发送出去,同时仍然连接到亚军。因此,使用前不得不削减一半炮弹。每个投包含范围从150微米 - 300微米(下游终端的最低内径)的一半大小不同的炮弹。
  2. 袖口准备应在手术显微镜下进行。
  3. 保持钝钳袖口半壳,轻轻地削减自投使用锋利的手术刀。此过程会导致半壳前体,要进一步处理。
  4. 广场甚至防滑板的半壳易制毒化学;修复钝钳和切割,沿预制切口正是在以REMOVE封闭结束。这将产生准备使用的袖口半壳。
  5. 控制在显微镜下半壳,轻轻地清除任何剩余的锋利的边缘。锥形内腔诱导内剪应力的不同素质是必不可少的,上游和下游植入袖口。一个垂直内腔的半壳的外表面上的凹槽,作为一个线程终于坚持半弹在一起,形成功能袖的指导。
  6. 存储袖口半壳,按大小分类,70%的乙醇,。

2。植入右颈总动脉周围的袖口

  1. ApoE基因敲除小鼠10周龄左右,至少20克的重量。如果斑块的发展应进行调查,高胆固醇饮食下,这样一个西方型饮食开始前4周的袖口植入建议。
  2. 整个手术过程应至少半无菌条件下下进行:穿手术衣,口罩,并盖和无菌手套。珠仪器灭菌消毒30秒,仪器和他们放在一个无菌的不透明表。当心!仪器冷却,然后再使用!
  3. 鼠标放置在一个充满了3%异氟醚麻醉诱导室,直到它完全麻醉。验证响应脚趾捏的麻醉深度。另外,麻醉可进行腹腔注射(IP),氯胺酮(80毫克/公斤)和甲苯噻嗪(10毫克/千克)或由IACUC批准的替代麻醉药。腹腔注射,保持仰卧姿势鼠标和腹部左下象限注入麻醉剂。
  4. 广场上加热外科板鼠标,在仰卧位。为了防止运行干燥滋润眼软膏(如Bepanthen眼睛和鼻子洗剂)的眼睛。传播脱颖而出和后腿的爪子和磁带盘。如果执行异氟醚麻醉,麻醉气体流量(2%异氟醚),通过提供一个小型的啮齿动物面具。
  5. 卸下下颚骨之间的胸骨,要么用脱毛剂(如Pilca MED)或用细电动剃须刀(如威娜CONTURA)的头发。剃须要谨慎,以避免刺激皮肤。如果使用脱毛剂,给它穿透头发1-2分钟,随后,轻轻一擦,直到所有的头发和脱毛剂被删除。
  6. 有准备不同大小(每个大小两个)和一个2.5厘米长的一块用于连接6-0丝线缝合在颈动脉闭塞部位的半壳的先前准备的袖口半壳。
  7. 消毒优碘自由主义的经营领域。用锋利的小剪刀,打开一个4 - 5mm的内侧切口, 胸骨 (柄)从顶部开始的皮肤和颈部的基本筋膜。
  8. 扩大对外开放,SHIFT右腮腺一边,插入手术吊具。然后直截了当地剖析深,到刚刚气管(从外科医生看来),其中右边的sternomastoideus肌肉穿过右肩胛舌骨肌离开,直到你能够识别脉动的右颈。
  9. 使用非常细的角度或弯钳(如杜蒙#5 / 45),解剖右颈总动脉,轻轻地去除周围结缔组织。迷走神经分离颈动脉 - 白色,纤维状的对象,直接沿颈 - 这一步是必要的,完全暴露船只。要小心,既不伤害的迷走神经,也不左侧颈内静脉,这也是紧密连接颈的一个分支。
  10. 为了选择合适的袖带尺寸,比较的暴露颈动脉内径与袖口半壳直径:袖口流明的最大宽度应满足的颈动脉的外径。 现在,小心翼翼地把镊子尖的颈下,打开钳,线程片6-0丝线缝合颈下,形成一个循环。颈下方之间的循环和颈的地方之一袖口半壳。最大的缩小,一边是下游。
  11. 第二袖半壳放置在顶部的颈环。
  12. 轻轻拧紧缝合循环使用缝合钳和节点线程。这样做的运作剪应力修饰符组成。对于精确拟合的袖口,它是必不可少的,缝合预制沟槽内的袖口外表面完全运行。
  13. 在原来的位置,近似将右腮腺和关闭的皮肤,可以使用6-0普理灵缝线的少量或者,你可以使用伤口剪辑。
  14. 皮下注入单剂量5毫克/公斤卡洛芬(例如Rimadyl)提供预防性治疗疼痛和地方鼠标变暖室,直到它恢复。通常,这需要30-60分钟,使用氯胺酮/甲苯​​噻嗪麻醉时。当使用异氟醚吸入麻醉恢复期大幅缩短(10-20分钟)。
  15. 根据我们的经验,动物重获袖口植入后24小时内正常重读活动的,由有经验的外科医生进行干预。但是,如果动物似乎是心疼甚至一天手术后,重复的镇痛治疗和咨询的兽医人员。

3。 Explanting袖口和颈动脉

  1. 组织学分析,颈动脉,在观察期结束收获。在出发explantation之前,动物被杀害,根据IACUC指引。
  2. 如果打算再用袖口半壳,小心地取出所有组织碎片和连接缝合,从塑料的元素,DIS颈动脉secting,清洗和存储在70%的酒精溶液的一半炮弹。应该牢记,袖口是嵌入植入后的几个星期和解剖谨慎袖口为了不伤害血管壁结缔组织粘连。
  3. 另外,袖口可explanted与颈动脉和嵌入式。塑料材质的袖口是耐正常固定的解决方案和用于石蜡包埋的溶剂。此外,嵌入式样品可以减少使用普通切片机配备了正常叶片。

4。代表性的成果

袖带要始终放在两个常见的颈动脉的动物(图1A,1B)周围 - 对侧作为对照。在图像袖口(图1B)提出的两个半壳圆锥形内腔是可见的。这是至关重要的圆锥形为EStablishing具有鲜明的血流动力学的三个地区。多普勒测量11和相应的流速计算相衬速度磁共振成像 12投典型的剪切应力诱导模式图2。

当袖带植入ApoE基因敲除小鼠喂食西方型饮食的改变流量动态挑起剪切应力引起动脉粥样硬化斑块的沉积(图3):上游的锥形收缩低的层流剪应力导致动脉粥样硬化斑块的更大规模的发展脆弱的表型,特点是脂质核心的中央管腔只涵盖由薄的纤维帽(图3A1)。锥形内腔的袖口,导致流速增加。几乎没有斑块沉积是在这方面的观察。直接下游面积涡和振荡FLO立即动脉结果扩大的瓶颈的网站w参数,从而导致延长了一个更稳定的表型(即少脂是本地化更接近媒体的核心),斑块的发展。

图1
图1剪应力修饰符- (一) 大会和安置示意图植入袖口:袖口放在周围的右颈总动脉(RCCA) -对侧(LCCA =左颈总动脉)作为控制。 (二)在小鼠体内MRI血管造影:在最大强度投影立体飞行MR血管造影的锥形收缩诱发投(白色箭头)是可见的(详细信息见12)。 (H =头,脚,R =右,L =左)。在右上角的一个宏观的角度对内腔和袖口半壳的外表面。组装时,两个半壳形成一个圆锥形的圆筒,该修改血流动力学内的船只在一个确定的方式。要确保正确的契合,袖口(黄色箭头)的外表面的凹槽作为连接缝合指导。

图2
图2不同的血流动力学和剪应力的地区。植入袖口改变流动态和随后剪应力在颈内动脉收缩在一个定义的方式。在上面的示意图的表示不同的流动特性和当地剪应力的近似值(基于多普勒测量11 )。下面,相应的流速为一个单一的动物植入袖口上游的MRI测量颈部横断面一个T1加权磁共振图像(相衬速度成像, 详见 12)所示。


剪切应力诱导ApoE基因敲除小鼠斑块的发展。左上角显示打开的脖子上的宏观性和高脂肪(西部型)饮食暴露在ApoE基因敲除小鼠颈动脉植入8周后剪应力图3 。周围的右颈总动脉(RCCA)修饰符。白色不透明的船只(*)的袖口上游地区对应到一个广泛的动脉粥样硬化斑块的沉积网站。黄色箭头表示的线程,它结合了两个半袖口。相比之下,有没有斑块沉积的迹象,在左冠状动脉(LCCA)。
(一) - (c)代表HE染色的ApoE基因敲除受西方型饮食8周后,植入的袖口鼠​​标的右颈动脉横截面。示意图给出相应的飞机(虚线)wherE的路段位于。 (一)上游的袖口动脉粥样硬化导致大量斑块沉积。大脂质核心(红色箭头),其中部分是靠近中央流明(详细A1)表征这些斑块脆弱性。 (二)在袖口的瓶颈平面几乎没有斑块的发展是显而易见的,而直接下游的袖口(三)振荡流导致中度斑块一个更稳定的类型(即少用或不用脂质核心)的发展。 (C1,C2 =半壳的袖口,P =斑块,星号=血管腔)

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Discussion

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为了尽量减少实验误差,建议用几乎相同的年龄动物具有相​​同的饮食历史。最近发表的一份调查表明,剪应力调节剂,适用于野生型小鼠可能是一个很好的模式和改变血流动力学13诱导的内皮功能障碍的早期炎症反应的调查。然而,对于动脉粥样硬化斑块的发展转基因高脂血症小鼠模型的查询(如ApoE基因敲除小鼠)。每个小鼠模型的进展和斑块沉积的程度取决于使用饮食类型。在一般情况下,较高的胆固醇/脂肪含量的饮食,疾病的进展更迅速。

在袖口植入术者应尽量减少组织损伤和操纵,这将降低由于损伤的炎症反应。最大限度地减少伤害时尤为重要炎症过程在动脉粥样硬化的过程是研究的重点。为了估计手术后的炎症程度,这是强烈建议,在一些动物植入非紧缩控制袖口。控制袖口应该是相同的材料制成的圆柱体,而是一个连续的,非紧缩内径。

同样重要的是,始终放置在同一位置的颈动脉袖口和总是选择同方,否则流速不会重现。外科医生,采取正确的袖口适合护理相结合时,两个袖口半壳的,因为在一个容易形成不圆锥形,这反过来又导致不可预知的流量参数内腔不当的拟合结果。

剪应力修饰符的一个巨大优势是,它创造与流速的特点和可重复性的模式,在同一船只以及三个定义的区域(FIG. 2,表1)。这些流动模式在高脂环境造成斑块沉积特征表型(图2)类似人类的脆弱和稳定斑块。

因此,鼠标颈袖是一种宝贵的的体内模型剪应力诱导斑块的表型(稳定和不稳定)的调查。此外,它也可能是一个理想的动物模型,为发展新的分子成像探针设计的早期识别动脉粥样硬化的网站,甚至在进展斑块沉积导致狭窄或斑块破裂,最初的事件,引起生命威胁心血管事件像血栓形成和心肌梗死。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

这项研究是支持的,一部分由德意志研究联合会(DFG)的,项目广州PI 771/1-1; SFB 656“心血管分子成像”,德国明斯特(项目C6,Z2,B3,和PM3);欧盟NOE“诊断分子成像迪米“(可湿性粉剂11.1和11.2)。这项研究还资助部分由英国心脏基金会,英国。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shear stress modifier (polyetherketone) Promolding BV

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References

  1. Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  2. Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab. Invest. 85, 9-23 (2005).
  3. Ali, F., Zakkar, M., Karu, K., Lidington, E. A., Hamdulay, S. S., Boyle, J. J., Zloh, M., Bauer, A., Haskard, D. O., Evans, P. C., Mason, J. C. Induction of the cytoprotective enzyme heme oxygenase-1 by statins is enhanced in vascular endothelium exposed to laminar shear stress and impaired by disturbed flow. J. Biol. Chem. 284, 18882-18892 (2009).
  4. Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293, C1824-C1833 (2007).
  5. Zheng, J., Abendschein, D. R., Okamoto, R. J., Yang, D., McCommis, K. S., Misselwitz, B., Gropler, R. J., Tang, D. MRI-based biomechanical imaging: initial study on early plaque progression and vessel remodeling. Magn. Reson. Imaging. 27, 1309-1318 (2009).
  6. Stone, P. H., Coskun, A. U., Kinlay, S., Clark, M. E., Sonka, M., Wahle, A., Ilegbusi, O. J., Yeghiazarians, Y., Popma, J. J., Orav, J., Kuntz, R. E., Feldman, C. L. Effect of endothelial shear stress on the progression of coronary artery disease, vascular remodeling, and in-stent restenosis in humans: in vivo 6-month follow-up study. Circulation. 108, 438-444 (2003).
  7. Pedersen, E. M., Oyre, S., Agerbaek, M., Kristensen, I. B., Ringgaard, S., Boesiger, P., Paaske, W. P. Distribution of early atherosclerotic lesions in the human abdominal aorta correlates with wall shear stresses measured in vivo. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 18, 328-333 (1999).
  8. Buchanan, J. R., Kleinstreuer, C., Truskey, G. A., Lei, M. Relation between non-uniform hemodynamics and sites of altered permeability and lesion growth at the rabbit aorto-celiac junction. Atherosclerosis. 143, 27-40 (1999).
  9. Nam, D., Ni, C. W., Rezvan, A., Suo, J., Budzyn, K., Llanos, A., Harrison, D., Giddens, D., Jo, H. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 1535-1543 (2009).
  10. Cheng, C., van Haperen, R., de Waard, M., van Damme, L. C., Tempel, D., Hanemaaijer, L., van Cappellen, G. W., Bos, J., Slager, C. J., Duncker, D. J., van der Steen, A. F., de Crom, R., Krams, R. Shear stress affects the intracellular distribution of eNOS: direct demonstration by a novel in vivo technique. Blood. 106, 3691-3698 (2005).
  11. Cheng, C., Tempel, D., van Haperen, R., van der Baan, A., Grosveld, F., Daemen, M. J., Krams, R., de Crom, R. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 113, 2744-2753 (2006).
  12. van Bochove, G. S., Straathof, R., Krams, R., Nicolay, K., Strijkers, G. J. MRI-determined carotid artery flow velocities and wall shear stress in a mouse model of vulnerable and stable atherosclerotic plaque. MAGMA. 23, 77-84 (2010).
  13. Cuhlmann, S., Van der Heiden, K., Saliba, D., Tremoleda, J. L., Khalil, M., Zakkar, M., Chaudhury, H., Luong, L. A., Mason, J. C., Udalova, I., Gsell, W., Jones, H., Haskard, D. O., Krams, R., Evans, P. C. Disturbed Blood Flow Induces RelA Expression via c-Jun N-Terminal Kinase 1: A Novel Mode of NF-{kappa}B Regulation That Promotes Arterial Inflammation. Circ. Res. 108, Forthcoming (2011).
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Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).More

Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).

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