Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Implantation af en carotis Cuff til udløsning af shear-stress Induced Åreforkalkning i Mus

doi: 10.3791/3308 Published: January 13, 2012

Summary

Den snærende manchet præsenteres i denne artikel er designet til at fremkalde åreforkalkning i murine fælles halspulsåren. På grund af den koniske form af dens indre lumen den implanterede manchetten genererer veldefinerede områder med lav, høj og oscillerende shear stress udløser udvikling af aterosklerotiske læsioner af forskellige inflammatoriske fænotyper.

Abstract

Det er almindeligt accepteret, at ændringer i vaskulær forskydningsspænding udløse udtryk for inflammatoriske gener i endotelceller og dermed fremkalde åreforkalkning (revideret i 1 og 2). Rolle shear stress er blevet grundigt undersøgt in vitro undersøge indflydelse af flow dynamik på dyrkede endotelceller 1,3,4 og in vivo i større dyr og mennesker 1,5,6,7,8. Men, meget reproducerbar små dyremodeller tillader systematisk undersøgelse af indflydelsen af ​​shear stress på plak udvikling er sjældne. For nylig introducerede Nam et al. 9 en musemodel, hvor ligatur af filialer af halspulsåren oprettes et område med lav og oscillerende flow. Selv om denne model medfører endotel dysfunktion og hurtig dannelse af aterosklerotiske læsioner i hyperlipidæmiske mus, kan det ikke udelukkes, at den observerede inflammatoriske reaktion er, i hvert fald delvist, en følge of endotel-og / eller fartøj skade på grund af ligatur.

For at undgå sådanne begrænsninger, har en forskydningsspænding ændre manchet blevet udviklet baseret på beregnede fluid dynamik, hvis kegleformede indre lumen blev udvalgt til at lave definerede områder med lav, høj og oscillerende shear stress inden for det fælles halspulsåren 10. Ved at anvende denne model i Apolipoprotein E (ApoE) knockout mus fodret med et højt kolesteroltal vestlige typen kost, vaskulære læsioner udvikle opstrøms og nedstrøms fra manchetten. Deres fænotype er korreleret med de regionale flow dynamik 11 som bekræftes af in vivo Magnetic Resonance Imaging (MRI) 12: Lav og laminar forskydningsspænding opstrøms af manchetten forårsager dannelsen af omfattende plaques af en mere sårbar fænotype, mens oscillerende forskydningsspænding nedstrøms manchetten inducerer stabil aterosklerotiske læsioner 11. I disse regioner med høj shear stress og høj laminar flow i manchet,typisk ikke aterosklerotiske plaques overholdes.

Konklusionen er, at den forskydningsspænding antireumatiske manchet procedure en pålidelig kirurgisk tilgang til at producere fænotypisk forskellige aterosklerotiske læsioner i ApoE-mangel mus.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Forberedelse af shear stress modifier (manchet)

  1. Den forskydningsspænding modifier består af to langsgående halvdele af en cylinder med en kegle formet lumen. Den halve skaller er lavet af termoplastisk polyetherketone produceret af en plastik støbning procedure. De støbte elementer er sendt ud, mens du stadig forbundet til løberen. Derfor den halve skaller er nødt til at være skåret af før brug. Hver støbt indeholder halvskåle i forskellige størrelser lige fra 150 μm - 300 m (lavest indre diameter på downstream ende).
  2. Manchetten præparat bør udføres under et kirurgisk mikroskop.
  3. Hold manchetten Half Shell med stump pincet og forsigtigt skære den ud fra de medvirkende ved hjælp af en skarp skalpel. Denne procedure vil føre til Half Shell prækursorer, der skal videreforarbejdes.
  4. Placer Half Shell forløber på en endnu ikke-glatte plade, ordne det med stump pincet og skær det præcist langs preformed snit for at remove den lukkede ende. Dette vil give de manchetten Half Shell klar til brug.
  5. Styr halvskåle under lup og forsigtigt fjerne eventuelle rester af skarpe kanter. Den koniske indre lumen er afgørende for at inducere forskellige kvaliteter af shear stress i, opstrøms og nedstrøms den implanterede manchetten. En rille på den ydre overflade af den halve skaller løber vinkelret på den indre lumen tjener som en rettesnor for den tråd, der til sidst stikker halvskåle sammen for at danne den funktionelle manchetten.
  6. Store manchetten halvskåle, klassificeres efter størrelse, i 70% ethanol.

2. Implantere manchetten omkring højre halspulsåren

  1. ApoE knockout mus bør være omkring 10 ugers alderen, og ved en vægt på mindst 20 gram. Hvis plak udvikling bør undersøges under højt kolesterol kost, der starter sådan en vestlig type, kost 4 uger før manchetten implantation anbefales.
  2. Hele kirurgiske procedure børudføres under mindst semi-sterile forhold: Bær en kirurgisk kjole, maske og hætte og sterile handsker. Sterilisere instrumenterne i 30 sekunder i en perle instrument sterilisator og placere dem på et sterilt uigennemsigtigt folie. Pas på! Instrumenter har til at køle ned før brug!
  3. Placer musen i en anæstesi induktion kammer fyldt med 3% isofluran, indtil det er helt bedøvet. Kontroller dybden af ​​anæstesi med svar til tå knibe. Alternativt kan anæstesi udføres med intraperitoneal (ip) injektion af ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) eller suppleant anæstesi godkendt af IACUC. For IP-injektion, skal du holde musen i liggende stilling og injicere den bedøvelse i nederste venstre kvadrant af maven.
  4. Placer musen på et opvarmet kirurgisk plade, i liggende stilling. For at forhindre øjne løber tør væde dem med øjet salve (f.eks Bepanthen øjne og næse lotion). Spred for-og bagben-poter og tape dem ned til pladen. Hvis der udføres isofluran anæstesi, den narkotiske gasstrømmen (2% isofluran), der må leveres via en lille gnaver maske.
  5. Fjern hår mellem underkæben og brystbenet ved enten at anvende hårfjerningsmidler agent (f.eks Pilca Med) eller ved hjælp af en fin elektrisk shaver (f.eks Wella Contura). Barbering skal udføres med forsigtighed for at undgå at irritere huden. Hvis du bruger en hårfjerningsmidler agent, giv den 1-2 minutter for at trænge ind i håret, derefter forsigtigt gnide indtil alt hår og hårfjerningsmidler agent er fjernet.
  6. Er klar til tidligere udarbejdede cuff halvskåle af forskellig størrelse (to af hver størrelse) og en 2,5 cm lang stykke 6-0 silke sutur til sammenkobling af den halve skaller på det sted, carotis okklusion.
  7. Desinficer drift området med rigelige mængder Betadine. Brug skarp lille saks til at åbne huden og det underliggende fascia af halsen med en 4-5mm mediale snit startende fra toppen af brystbenet (manubrium).
  8. Udvid åbningen, shift højre ørespytkirtlen til side og indsætte en kirurgisk sprederen. Så uden omsvøb dissekere i den dybe, lige til venstre for luftrøret (fra kirurger view), hvor de rigtige sternomastoideus musklen krydser den rigtige omohyoid muskler, indtil du er i stand til at identificere de pulserende rigtige fælles carotis.
  9. Med meget fint vinklede eller buede pincet (f.eks Dumont # 5 / 45), dissekere de rigtige fælles halspulsåren ved forsigtigt at fjerne det omkringliggende bindevæv. Adskil carotis fra vagus nerve - den hvide, trævlet objekt løber direkte langs carotis - da dette skridt er nødvendigt helt at udsætte skibet. Vær omhyggelig med hverken at skade vagus nerve eller en gren af ​​den venstre interne halsfedt, hvilket også er i tæt tilknytning til carotis.
  10. For at vælge den rigtige størrelse manchet, sammenligne diameteren af ​​de eksponerede carotis med den indvendige diameter af manchetten halvskåle: Den største bredde manchetter lumen bør opfylde den ydre diameter af carotis. Nu, forsigtigt satte spidsen af ​​tang under carotis, skal du åbne pincet, tråd det stykke 6-0 silke sutur under carotis og danne en løkke. Mellem løkken og carotis sted én manchet Half Shell under carotis. Den side af største forsnævring skal downstream.
  11. Placer den anden cuff Half Shell i loop på toppen af ​​carotis.
  12. Stram forsigtigt suturen loop med suturering pincet og node tråden. Ved at gøre denne funktion forskydningsspænding modifier er dannet. For den præcise montering af manchetten er det vigtigt, at sutur kører præcis inden for formstøbte rillen på den ydre overflade af manchetten.
  13. Flyt højre ørespytkirtlen tilbage på sin oprindelige position, omtrentlige og luk huden enten ved hjælp af en lille mængde af 6-0 prolene sutur eller alternativt kan du bruge sår klip.
  14. Indsprøjtes en enkelt dosis på 5 mg / kg Carprofen (f.eks Rimadyl) subkutant til at give profylaktisk smertebehandling og stedmusen i en opvarmning kammeret, når den genindvinder. Normalt, det tager 30-60 min, når du bruger Ketamin / Xylazin anæstesi. Når du bruger isofluran inhalation anæstesi tilbagebetalingsperioden er væsentligt kortere (10-20 min).
  15. Det er vores erfaring, at genvinde dyr normalt tryksvage aktivitet inden for de første 24 timer efter manchet implantation med indgreb udføres af en erfaren kirurg. Men hvis dyret synes at være nødstedte selv en dag efter operationen, skal du gentage den smertestillende behandling og rådføre sig med dyrlæger.

3. Eksplantation manchetten og carotis arterierne

  1. For histologisk analyse carotis arterier er nødt til at blive høstet i slutningen af ​​observationsperioden. Før du starter explantation, har dyret kan aflives i henhold til IACUC retningslinjer.
  2. Hvis manchetten halvskåle er beregnet til genbrug, omhyggeligt fjerne al væv fragmenter og det forbindende sutur fra plasten elementer, DISsecting fra carotis arterier, vask og gemme det halve skaller i 70% alkohol løsning. Man skal huske på, at manchetten er indlejret i bindevæv sammenvoksninger efter flere ugers implantation og at man er nødt til at dissekere manchetten med forsigtighed for ikke at skade skibet vægge.
  3. Alternativt kan manchet være eksplanteret og indlejret sammen med halspulsåren. Plastmaterialet af manchetten er resistent over for normale fiksering løsninger og opløsningsmidler, der anvendes til paraffin indstøbning. Også, kan det integrerede prøverne skæres med en almindelig microtome udstyret med normale vinger.

4. Repræsentative resultater

Manchetten skal placeres altid omkring en af ​​de to fælles carotis arterier af et dyr (Fig. 1A, 1B) - den kontralaterale side tjener som kontrol. På billedet præsenterer de to halve skaller af manchetten (Fig. 1B) den koniske form af den indre lumen er synlig. Denne koniske form er afgørende for establishing de tre regioner med forskellige flow dynamik. Typiske forskydningsspænding mønstre induceret af de afgivne beregnes ud fra Doppler målinger 11 og den tilsvarende strømningshastigheder baseret på et fasekontrast-velocity MR billeddannelse 12 er givet i Figur 2.

Når manchetten er implanteret i ApoE knockout mus fodret med en vestlig type, kost den ændrede flow dynamik provokere shear stress induceret aterosklerotiske plaque deposition (fig. 3): Før den koniske konstriktion lave laminar shear stress fører til massive udvikling af aterosklerotiske plaques af en mere sårbare fænotype, er kendetegnet ved lipid kerner tæt på den centrale lumen kun dækket af en tynd fibrøs kappe (fig. 3A1). Den koniske indre lumen af ​​manchetten fører til en stigning i flow hastighed. Næsten ingen plak deposition er observeret i dette område. Lige neden for det sted, hvor flaskehalsen den umiddelbare udvidelse af arterie resulterer i et område med hvirvler og oscillerende Flow parametre, der forårsager mindre udbredt plaque udviklingen af ​​et mere stabilt fænotype (dvs. mindre lipid kerner, der er lokaliseret mere tæt på medierne).

Figur 1
Figur 1 forskydningsspænding modifier - montage og placering (A) Skematisk tegning af den implanterede manchetten:.. Manchetten er placeret omkring den rette fælles halspulsåren (RCCA) - den kontralaterale side (LCCA = venstre fælles halspulsåren) tjener som kontrol . (B) In vivo MR-angiografi med en mus: I den maksimale intensitet projektion af en tre-dimensionel time-of-flight MR-angiografi den koniske konstriktion induceret af stemmer (hvid pil) er synlig (for detaljer se 12). (H = hoved, F = fødder, R = højre, L = venstre). I øverste højre hjørne et makroskopisk syn på den indre lumen, og den ydre overflade af manchetten halvskåle er givet. Når det samles, to halve skaller danner en konisk cylinder, som ændrerstrømmen dynamik inden skibet i en defineret måde. For at sikre den rigtige pasform, en rille på den ydre overflade af manchetten (gul pil) tjener som en rettesnor for sammenkædningen sutur.

Figur 2
Figur 2. Regioner forskellige flow dynamik og shear stress. Implantation af manchetten ændrer flow dynamik og efterfølgende shear stress i trange halspulsåren i en defineret måde. I den øverste Skematisk illustration af de forskellige flydeegenskaber er angivet og den lokale omtrentlige værdier for shear stress er givet (baseret på Doppler målinger 11). Nedenfor er tilsvarende flow hastigheder for et enkelt dyr målt ved MRI opstrøms den implanterede manchet vises i en T1-vægtede tværsnits-MRI-billede af halsen (fasekontrast-hastighed imaging, for detaljer se 12).


Figur 3. Forskydningsspænding induceret plak udvikling i ApoE knockout mus. Den øverste venstre hjørne viser den makroskopiske syn på den åbne hals og udsatte halspulsårer af en ApoE knockout mus under højt fedtindhold (vestlig type) kost 8 uger efter implantation af en forskydningsspænding modifier omkring de rigtige fælles halspulsåren (RCCA). Den uigennemsigtige hvide område af skibet (*) opstrøms af manchetten svarer til et websted af omfattende aterosklerotiske plaque deposition. Den gule pil viser den tråd, der kombinerer de to manchetten halvdele. I modsætning hertil er der ingen tegn på plak deposition i venstre fælles koronararterie (LCCA).
(A) - (C) repræsentant HE farvede tværsnit af retten fælles halspulsåren af ​​en ApoE knockout mus under vestlige typen kost 8 uger efter implantation af manchetten. Den skematiske illustration giver tilsvarende fly (stiplede linjer), uafhængig af hvor retholtene afsnittene var placeret. (A) opstrøms manchetten åreforkalkning fører til massive plak deposition. Stor lipid kerner (røde pile), som til dels ligger tæt på den centrale lumen (detalje A1) karakterisere sårbare karakter af disse plaques. (B) På flyet af manchetten flaskehals næsten ingen plaque udvikling er indlysende, hvorimod direkte neden for manchetten (C) oscillerende strømning fører til moderat plaque udviklingen af ​​en mere stabil type (dvs. mindre eller ingen lipid kerner). (C1, C2 = halvskåle af manchetten, P = plaques, stjerne = fartøj lumen)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For at minimere eksperimentelle variation anbefales det at arbejde med dyr af næsten samme alder og med samme diæt historie. En nylig offentliggjort undersøgelse viser, at shear stress modifier anvendes i vildtype mus kan være en god model til undersøgelse af endotel dysfunktion og begyndelsen af inflammatoriske reaktioner fremkaldt af ændrede flow dynamik 13. Men for den undersøgelse af aterosklerotiske plaque udvikling transgene hyperlipidæmiske musemodeller (f.eks ApoE knockout mus) er påkrævet. Progression og omfanget af plak deposition i hver enkelt musemodel afhænger af den anvendte type kost. Generelt, jo højere kolesterol / fedtindholdet i kosten til en hurtigere progression af sygdommen er.

Under manchet implantation kirurgen bør forsøge at minimere vævsskader og manipulation, for det vil sænke inflammatoriske reaktioner på grund af skade. Minimering af skader er især vigtigt, nårinflammatoriske processer i løbet af åreforkalkning er i fokus for undersøgelsen. For at vurdere graden af ​​post-operative inflammation er det stærkt anbefales at implantere ikke-konstriktiv kontrol manchetter hos nogle dyr. Kontrollen Manchetten skal være en cylinder lavet af samme materiale, men med en kontinuerlig, ikke-restriktiv indvendige diameter.

Det er også vigtigt altid at placere manchetten på den samme position halspulsåren og til at vælge altid den samme side, ellers flow hastigheder er ikke reproducerbare. Kirurgen er nødt til at passe godt på den rigtige pasform af manchetten, når man kombinerer de to manchetten halvskåle, da forkert passer resulterer i en ikke let dannes koniske indre lumen hvilket igen fører til uforudsigelige flow parametre.

En stor fordel ved forskydningsspænding modifier er, at den skaber tre veldefinerede områder med karakteristiske og reproducerbare mønstre af flow hastigheder inden for samme fartøj (Fig. 2, tabel 1). I et hyperlipidæmiske miljø hver af disse flow mønstre årsag plak aflejring af en karakteristisk fænotype (Fig. 2) ligner sårbare og stabile plaques hos mennesker.

Således præsenterede musen carotis manchet er en værdifuld in vivo model for undersøgelse af shear stress induceret plak fænotyper (stabil og ustabil). Desuden kan det også være en ideel lille dyr model for udvikling af nye molekylær billeddannelse sonder, der er designet til tidlige identificere websteder af åreforkalkning selv før skred plak deposition fører til stenose eller plaque ruptur, den første begivenhed, der giver anledning til livstruende kardiovaskulære hændelser som trombedannelse og myokardieinfarkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet delvist af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projekt GZ PI 771/1-1; SFB 656 "Cardiovascular Molecular Imaging," Münster, Tyskland (projekter C6, Z2, B3, og PM3), EU ekspertisenet "Diagnostisk Molecular Imaging-dimi "(WP 11.1 og 11.2). Undersøgelsen blev også finansieret en del af British Heart Foundation, England.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shear stress modifier (polyetherketone) Promolding BV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  2. Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab. Invest. 85, 9-23 (2005).
  3. Ali, F., Zakkar, M., Karu, K., Lidington, E. A., Hamdulay, S. S., Boyle, J. J., Zloh, M., Bauer, A., Haskard, D. O., Evans, P. C., Mason, J. C. Induction of the cytoprotective enzyme heme oxygenase-1 by statins is enhanced in vascular endothelium exposed to laminar shear stress and impaired by disturbed flow. J. Biol. Chem. 284, 18882-18892 (2009).
  4. Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293, C1824-C1833 (2007).
  5. Zheng, J., Abendschein, D. R., Okamoto, R. J., Yang, D., McCommis, K. S., Misselwitz, B., Gropler, R. J., Tang, D. MRI-based biomechanical imaging: initial study on early plaque progression and vessel remodeling. Magn. Reson. Imaging. 27, 1309-1318 (2009).
  6. Stone, P. H., Coskun, A. U., Kinlay, S., Clark, M. E., Sonka, M., Wahle, A., Ilegbusi, O. J., Yeghiazarians, Y., Popma, J. J., Orav, J., Kuntz, R. E., Feldman, C. L. Effect of endothelial shear stress on the progression of coronary artery disease, vascular remodeling, and in-stent restenosis in humans: in vivo 6-month follow-up study. Circulation. 108, 438-444 (2003).
  7. Pedersen, E. M., Oyre, S., Agerbaek, M., Kristensen, I. B., Ringgaard, S., Boesiger, P., Paaske, W. P. Distribution of early atherosclerotic lesions in the human abdominal aorta correlates with wall shear stresses measured in vivo. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 18, 328-333 (1999).
  8. Buchanan, J. R., Kleinstreuer, C., Truskey, G. A., Lei, M. Relation between non-uniform hemodynamics and sites of altered permeability and lesion growth at the rabbit aorto-celiac junction. Atherosclerosis. 143, 27-40 (1999).
  9. Nam, D., Ni, C. W., Rezvan, A., Suo, J., Budzyn, K., Llanos, A., Harrison, D., Giddens, D., Jo, H. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 1535-1543 (2009).
  10. Cheng, C., van Haperen, R., de Waard, M., van Damme, L. C., Tempel, D., Hanemaaijer, L., van Cappellen, G. W., Bos, J., Slager, C. J., Duncker, D. J., van der Steen, A. F., de Crom, R., Krams, R. Shear stress affects the intracellular distribution of eNOS: direct demonstration by a novel in vivo technique. Blood. 106, 3691-3698 (2005).
  11. Cheng, C., Tempel, D., van Haperen, R., van der Baan, A., Grosveld, F., Daemen, M. J., Krams, R., de Crom, R. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 113, 2744-2753 (2006).
  12. van Bochove, G. S., Straathof, R., Krams, R., Nicolay, K., Strijkers, G. J. MRI-determined carotid artery flow velocities and wall shear stress in a mouse model of vulnerable and stable atherosclerotic plaque. MAGMA. 23, 77-84 (2010).
  13. Cuhlmann, S., Van der Heiden, K., Saliba, D., Tremoleda, J. L., Khalil, M., Zakkar, M., Chaudhury, H., Luong, L. A., Mason, J. C., Udalova, I., Gsell, W., Jones, H., Haskard, D. O., Krams, R., Evans, P. C. Disturbed Blood Flow Induces RelA Expression via c-Jun N-Terminal Kinase 1: A Novel Mode of NF-{kappa}B Regulation That Promotes Arterial Inflammation. Circ. Res. 108, Forthcoming (2011).
Implantation af en carotis Cuff til udløsning af shear-stress Induced Åreforkalkning i Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).More

Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter