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Medicine

Impianto di un bracciale carotidea per innescare Shear-stress aterosclerosi indotta in topi

doi: 10.3791/3308 Published: January 13, 2012

Summary

Il bracciale costrizione presentate in questo articolo è stato progettato per indurre l'aterosclerosi nel topo arteria carotide comune. Grazie alla forma conica del suo lume interno del bracciale impiantato genera regioni ben definite della bassa, la tensione alta e oscillatorio taglio innescare lo sviluppo di lesioni aterosclerotiche dei diversi fenotipi infiammatori.

Abstract

E 'ampiamente accettato che le alterazioni vascolari in shear stress innescare l'espressione dei geni infiammatori nelle cellule endoteliali e, quindi, indurre l'aterosclerosi (recensione in 1 e 2). Il ruolo dello stress di taglio è stata ampiamente studiata in vitro indagare l'influenza della dinamica dei flussi su una coltura di cellule endoteliali 1,3,4 e in vivo in animali più grandi e gli esseri umani 1,5,6,7,8. Tuttavia, altamente riproducibile modelli animali di piccole permettendo un'indagine sistematica dell'influenza della sollecitazione di taglio sullo sviluppo della placca sono rari. Recentemente, Nam et al. 9 ha introdotto un modello di topo in cui la legatura dei rami dell'arteria carotide crea una regione di bassa portata e oscillatorio. Anche se questo modello le cause della disfunzione endoteliale e la rapida formazione di lesioni aterosclerotiche nei topi iperlipidemici, non si può escludere che la risposta infiammatoria è osservata, almeno in parte, una conseguenza of endoteliale e / o danni nave a causa di legatura.

Al fine di evitare tali limitazioni, un bracciale sforzo di taglio modificando è stato sviluppato sulla base della dinamica dei fluidi calcolato, la cui forma di cono lume interno è stata scelta per creare regioni definite a bassa, stress e oscillatorio di taglio all'interno dell'arteria carotide comune 10. Applicando questo modello in apolipoproteina E (ApoE) topi knockout nutriti con una dieta ricca di colesterolo di tipo occidentale, lesioni vascolari sviluppare a monte ea valle del bracciale. Il loro fenotipo è correlato con le dinamiche del flusso regionale 11 come conferma in vivo imaging a risonanza magnetica (MRI) 12: sforzo di taglio basso e laminare a monte della cuffia provoca la formazione di placche estesa di un fenotipo più vulnerabile, mentre a valle oscillatorio sforzo di taglio di il bracciale induce lesioni aterosclerotiche stabili 11. Nelle regioni di elevato stress di taglio e flusso laminare ad alta all'interno del bracciale,di solito non vengono osservati placche aterosclerotiche.

In conclusione, il taglio allo stress modificando procedura bracciale è un approccio chirurgico affidabile per la produzione di lesioni aterosclerotiche fenotipicamente diversi ApoE topi con deficit.

Protocol

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1. Preparare il modificatore di sollecitazione di taglio (bracciale)

  1. Il modificatore sforzo di taglio è composto da due metà longitudinale di un cilindro con un lume a forma di cono. I mezzi gusci sono realizzati in materiale termoplastico polyetherketone prodotta da un processo di fusione di plastica. Gli elementi di ghisa sono inviati, pur collegato al corridore. Quindi, i mezzi gusci devono essere tagliati prima dell'uso. Ogni utilizzo contiene semigusci di dimensioni diverse che vanno dai 150 micron - 300 micron (più basso diametro interno alla fine a valle).
  2. La preparazione della cuffia deve essere eseguita al microscopio chirurgico.
  3. Tenere la conchiglia della cuffia con una pinza schietto e delicatamente tagliati fuori dal cast, utilizzando un bisturi affilato. Questa procedura porterà alla metà precursori guscio che devono essere successivamente trattati.
  4. Posizionare il precursore conchiglia su una piastra anche i non scivoloso; fissarlo con una pinza smussato e tagliare esattamente lungo l'incisione preformato in modo da remOve l'estremità chiusa. Questo darà la conchiglia bracciale pronto per l'uso.
  5. Controllare il semigusci sotto il microscopio e rimuovere delicatamente eventuali bordi non taglienti. Il lume conica interna è essenziale per indurre diverse qualità di sforzo di taglio all'interno, a monte ea valle della cuffia impiantato. Una scanalatura sulla superficie esterna dei mezzi gusci perpendicolari al lume interno funge da guida per il filo che si attacca infine il semigusci insieme per formare il bracciale funzionale.
  6. Conservare i mezzi gusci bracciale, classificate in base alla dimensione, in etanolo al 70%.

2. Impiantare il bracciale intorno all'arteria carotide destra

  1. Topi knockout per ApoE dovrebbe essere circa 10 settimane di età e con un peso di almeno 20 grammi. Se lo sviluppo della placca deve essere studiata sotto dieta colesterolo alto, a partire da una dieta di tipo occidentale, 4 settimane prima dell'impianto bracciale è raccomandato.
  2. L'intera procedura chirurgica dovrebbeessere effettuata a titolo di almeno semi-sterile condizioni: indossare un camice chirurgico, maschera e berretto e guanti sterili. Sterilizzare gli strumenti per 30 secondi in uno sterilizzatore strumento tallone e disporle su un foglio sterile opaco. Attenzione! Strumenti devono raffreddare prima dell'uso!
  3. Posizionare il mouse in una camera piena di induzione dell'anestesia 3% isofluorano finché non è completamente anestetizzata. Verificare profondità dell'anestesia con risposta a pizzico piedi. In alternativa, l'anestesia può essere eseguita con intraperitoneale (ip) l'inserimento di ketamina (80 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) o anestetici alternativi approvato dal IACUC. Per l'iniezione ip, tenere il mouse in posizione supina e iniettare l'anestetico nel quadrante inferiore sinistro dell'addome.
  4. Posizionare il mouse su un piatto riscaldato chirurgico, in posizione supina. Al fine di prevenire gli occhi di funzionamento a secco inumidire con collirio (es. Bepanthen lozione occhi e naso). Diffondere il anteriori e posteriori zampe e nastro giù alla piastra. Se si esegue l'anestesia isoflurano, il flusso di gas narcotici (2% isoflurano) deve essere fornita attraverso una maschera di piccolo roditore.
  5. Togliere i capelli tra la mandibola e lo sterno da uno agente applicando depilatorie (ad esempio Pilca Med) o utilizzando una multa rasoio elettrico (ad esempio Wella Contura). Rasatura deve essere effettuata con cautela per evitare di irritare la pelle. Se si utilizza un agente di depilatori, dare 1-2 minuti per penetrare i capelli, in seguito, strofinare delicatamente fino a che tutti i capelli e agente depilatorie viene rimosso.
  6. Sono pronto precedentemente preparato conchiglie polsino metà di diverse dimensioni (due di ogni dimensione) e un 2,5 cm-lungo pezzo di 6-0 sutura di seta per l'interconnessione dei mezzi gusci nel sito di occlusione della carotide.
  7. Disinfettare il campo operatorio con la quantità liberale di Betadine. Usa affilato piccole forbici per aprire la pelle e la fascia alla base del collo da un 4-5mm incisione mediale a partire dalla parte superiore dello sterno (manubrio).
  8. Espandere l'apertura, shift la ghiandola parotide destra da parte e inserire un diffusore chirurgico. Poi, senza mezzi termini sezionare il largo, appena lasciato della trachea (dal punto di vista chirurghi), in cui il muscolo sternomastoideus destra attraversa il muscolo giusto omoioideo, finché non si è in grado di identificare il pulsante carotide comune destra.
  9. Utilizzando pinze ad angolo o curva molto fine (ad esempio Dumont # 5 / 45), sezionare l'arteria carotide comune destra delicatamente rimuovendo il tessuto connettivo circostante. Separare la carotide dal nervo vago - il bianco, oggetto filante eseguendo direttamente lungo la carotide - come questo passaggio è necessario per esporre completamente il recipiente. Fate attenzione a non danneggiare il nervo vago, né un ramo di sinistra della vena giugulare interna, che è anche in stretta connessione con la carotide.
  10. Per scegliere la taglia giusta bracciale, confrontare il diametro della carotide interna esposta con il diametro dei mezzi gusci bracciale: La più grande larghezza del lume polsini dovrebbe soddisfare il diametro esterno della carotide. Ora, con cura mettere la punta della pinza sotto la carotide, aprire la pinza, il pezzo di filo di sutura in seta 6-0 sotto la carotide e formare un anello. Tra il ciclo e la carotide mettere un mezzo guscio bracciale sotto la carotide. La parte del più grande restringimento deve essere a valle.
  11. Posizionare la seconda conchiglia bracciale all'interno del ciclo in cima alla carotide.
  12. Delicatamente stringere l'anello di sutura con pinze sutura e il nodo del filo. In questo modo il taglio modificatore funzionamento dello stress è formato. Per il montaggio preciso del bracciale è essenziale che la sutura è in esecuzione esattamente nel solco preformati sulla superficie esterna della cuffia.
  13. Spostare la ghiandola parotide destra torna nella sua posizione originale, approssimativa e chiudere la pelle usando una piccola quantità di sutura 6-0 prolene o, in alternativa, è possibile utilizzare clip ferita.
  14. Iniettare una singola dose di 5 mg / kg Carprofen (ad esempio Rimadyl) per via sottocutanea per fornire trattamento profilattico dolore e luogoil mouse in una camera di riscaldamento fino a quando non recupera. Normalmente, questo richiede 30-60 minuti quando si usa l'anestesia ketamina / xylazina. Quando si utilizza l'anestesia per inalazione isoflurano il periodo di recupero è sostanzialmente più breve (10-20 minuti).
  15. Nella nostra esperienza, gli animali riacquistare la normale attività atone entro le prime 24 ore dopo l'impianto della cuffia con l'intervento viene eseguito da un chirurgo esperto. Tuttavia, se l'animale sembra essere in difficoltà anche un giorno post-operatorio, ripetere il trattamento analgesico e consultarsi con il personale veterinario.

3. Espianto il bracciale e le arterie carotidi

  1. Per l'analisi istologica delle arterie carotidi devono essere raccolti al termine del periodo di osservazione. Prima di iniziare espianto, l'animale deve essere ucciso secondo le linee guida IACUC.
  2. Se il bracciale conchiglie metà sono destinate ad essere riutilizzate, rimuovere con cura tutti i frammenti di tessuto e la sutura di collegamento dagli elementi plastici, dissecting dalle arterie carotidi, lavare e conservare i mezzi gusci in soluzione alcolica 70%. Si deve tenere presente che il bracciale sia incorporato nel tessuto connettivo aderenze dopo diverse settimane di impianto e che si deve sezionare il bracciale con cautela per non danneggiare le pareti dei vasi.
  3. In alternativa, il bracciale può essere espiantati e integrato con l'arteria carotidea. Il materiale plastico della cuffia è resistente alle soluzioni di fissaggio normale e solventi utilizzati per paraffina. Inoltre, i campioni incorporato può essere tagliati con un microtomo normale dotato di lame normali.

4. Rappresentante Risultati

Il bracciale deve essere posizionato sempre in giro una delle due arterie carotidi comuni di un animale (Fig. 1A, 1B) - il lato controlaterale funge da controllo. Sull'immagine che presenta i due semigusci della cuffia (Fig. 1B), la forma conica del lume interno è visibile. Questa forma conica è essenziale per establishing le tre regioni con le dinamiche di flusso distinte. Tipico pattern sforzo di taglio indotto dal cast in base a misurazioni Doppler 11 e la velocità di flusso corrispondente in base a contrasto di fase della velocità RM 12 sono riportati nella Figura 2.

Quando il bracciale viene impiantato nei topi knockout ApoE alimentati con una dieta di tipo occidentale, il flusso alterato dinamiche provocare sollecitazioni di taglio indotto deposizione della placca aterosclerotica (Fig. 3): A monte della conica laminare a bassa tensione di taglio costrizione porta allo sviluppo massiccio di placche aterosclerotiche di una più fenotipo vulnerabili, caratterizzate da nuclei lipidi vicino al lume centrale coperta solo da un sottile cappuccio fibroso (Fig. 3A1). Il lume conica interna del bracciale porta ad un aumento della velocità di flusso. Quasi nessuna deposizione della placca si osserva in questo settore. Direttamente a valle del sito del collo di bottiglia l'immediato ampliamento dei risultati arteria in una zona di vortici e oscillatorio floparametri w, che causa lo sviluppo della placca meno estesa di un fenotipo più stabile (core lipidico vale a dire meno che sono localizzate più vicino alla media).

Figura 1
Figura 1 Il modificatore sforzo di taglio - il montaggio e il posizionamento (A) Schema del bracciale impiantato:.. Il bracciale è posizionato intorno al diritto carotide comune (RCCA) - il lato controlaterale (LCCA = sinistra arteria carotide comune) serve come controllo . (B) in vivo RMN angiografia in un mouse: Nella proiezione di massima intensità di un tempo tridimensionale di volo angiografia RM conica la costrizione indotta dal cast (freccia bianca) è visibile (per dettagli vedere 12). (H = testa, F = piedi, R = destra, L = sinistra). Nell'angolo in alto a destra una visione macroscopica del lume interno e la superficie esterna dei mezzi gusci bracciale è dato. Una volta assemblato, due mezzi gusci formare un cilindro conica che modificala dinamica dei flussi all'interno della nave in un modo definito. Per garantire la giusta misura, un solco sulla superficie esterna della cuffia (freccia gialla) funge da guida per la sutura di collegamento.

Figura 2
Figura 2. Regioni di dinamiche diverse portate e sforzo di taglio. Impianto delle dinamiche bracciale flusso altera e lo stress in seguito al taglio nella arteria carotide ristretto in maniera definita. Nell'illustrazione schema superiore le proprietà di flusso differenti sono indicati i valori locali e approssimativi per sforzo di taglio sono date (sulla base di misurazioni Doppler 11). Di seguito, velocità di flusso corrispondente per un singolo animale misurata con la risonanza magnetica a monte della cuffia impiantati vengono visualizzate in una T1 pesate trasversali MRI-immagine del collo (di imaging a contrasto di fase della velocità, per maggiori dettagli vedi 12).


Figura 3. Sforzo di taglio indotto lo sviluppo della placca in topi knockout per ApoE. Nell'angolo in alto a sinistra mostra la vista macroscopico sul collo aperto ed esposto arterie carotidee di topo knockout ApoE con alto contenuto di grassi (di tipo occidentale) dieta 8 settimane dopo l'impianto di un sforzo di taglio modificatore di tutto il diritto carotide comune (RCCA). La regione bianco opaco della nave (*) a monte della cuffia corrisponde a un sito di ampia deposizione della placca aterosclerotica. La freccia gialla indica il filo che unisce le due metà della cuffia. Al contrario, non ci sono segni di deposizione della placca a sinistra dell'arteria coronaria comune (LCCA).
(A) - (C) Rappresentante HE colorate sezioni del diritto arteria carotide comune di un topo knockout ApoE sotto dieta di tipo occidentale 8 settimane dopo l'impianto della cuffia. La figura schematica dà i piani corrispondenti (linee tratteggiate) where le sezioni sono situate. (A) a monte della aterosclerosi bracciale porta alla deposizione della placca di massa. Core lipidico di grandi dimensioni (frecce rosse), che in parte si trovano vicino al lume centrale (particolare A1) caratterizzano il carattere vulnerabile di queste placche. (B) sul piano del collo di bottiglia bracciale quasi nessuno sviluppo della placca è ovvio, mentre direttamente a valle della cuffia (C) il flusso oscillatorio porta a placche moderato sviluppo di un tipo più stabile (cioè nuclei di lipidi meno o no). (C1, C2 = semigusci della cuffia, P = placche, asterisco = nave lumen)

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Discussion

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Al fine di minimizzare variazione di sperimentazione si consiglia di lavorare con gli animali di quasi la stessa età e con la storia stessa dieta. Un'indagine recentemente pubblicato dimostra che il modificatore sforzo di taglio applicato nei topi tipo selvatico potrebbe essere un buon modello per lo studio della disfunzione endoteliale e l'inizio risposte infiammatorie indotta dal flusso alterato le dinamiche 13. Tuttavia, per l'inchiesta della placca aterosclerotica modelli iperlipidemici sviluppo di topi transgenici (per esempio il topo knockout ApoE) sono obbligatori. La progressione e l'entità della deposizione della placca in ogni modello di topo dipendono dal tipo di alimentazione utilizzata. In generale, il contenuto più alto è il colesterolo / grassi della dieta, la più rapida la progressione della malattia.

Durante l'impianto della cuffia il chirurgo dovrebbe cercare di minimizzare i danni ai tessuti e la manipolazione, per questo si abbasserà la risposta infiammatoria causa di un infortunio. Minimizzare lesione è particolarmente importante quandoprocessi infiammatori in corso di aterosclerosi sono al centro dello studio. Per stimare il grado di infiammazione post-chirurgica è altamente consigliato di impiantare non costrittivo polsini di controllo in alcuni animali. Il bracciale di controllo deve essere un cilindro fatto dello stesso materiale, ma con un continuo, non costrittiva diametro interno.

E 'anche essenziale per posizionare il bracciale sempre nella stessa posizione della carotide e di scegliere sempre la stessa faccia, altrimenti velocità di flusso non sono riproducibili. Il chirurgo deve prendere cura della giusta misura della cuffia quando si combinano i due semigusci della cuffia, perché i risultati in forma impropria in un formato non facilmente lume conica interna che a sua volta porta a parametri di flusso imprevedibile.

Un grande vantaggio del modificatore shear stress è che crea tre regioni ben definite con i modelli caratteristici e riproducibili di velocità di flusso all'interno della stessa nave (Fig. 2, tabella 1). In un ambiente iperlipidemici ciascuno di questi schemi di flusso causa deposizione della placca di un fenotipo caratteristico (Fig. 2) simile a placche vulnerabili e stabili negli esseri umani.

Così, il bracciale presenta carotide mouse è un prezioso modello in vivo per lo studio dei fenotipi sforzo di taglio indotto placca (stabile e instabile). Inoltre, potrebbe essere anche un modello ideale di piccoli animali per lo sviluppo di nuove sonde di imaging molecolare, progettato per identificare i siti di aterosclerosi precoce anche prima deposizione della placca progredito porta a stenosi o rottura della placca, l'evento iniziale che ha dato luogo a pericolo di vita eventi cardiovascolari come la formazione del trombo e infarto del miocardio.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto in parte dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), progetto GZ PI 771/1-1; SFB 656 "Cardiovascular Imaging Molecolare", Münster, Germania (progetti C6, Z2, B3 e PM3); UE NoE "Diagnostica Imaging Molecolare-DIMI "(WP 11.1 e 11.2). Lo studio è stato finanziato in parte dalla British Heart Foundation, Regno Unito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shear stress modifier (polyetherketone) Promolding BV

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References

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Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).More

Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).

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