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Medicine

マウスでのせん断応力誘発アテローム性動脈硬化症をトリガするための頸動脈カフの注入

doi: 10.3791/3308 Published: January 13, 2012

Summary

この記事で紹介した収縮カフは、ネズミの総頸動脈のアテローム性動脈硬化症を誘発するように設計されています。その内腔の円錐形状に起因する移植されたカフは、種々の炎症性表現型のアテローム性動脈硬化病変の開発をトリガする、低、高と振動せん断応力の明確に定義された領域を生成します。

Abstract

これは、広く血管せん断応力の変化は、内皮細胞における炎症性遺伝子の発現を誘発し、それによって(12にレビュー)アテローム性動脈硬化症を誘発することが受け入れられている。せん断応力の役割は広く培養内皮細胞上の流れのダイナミクスの影響を1,3,4と大きく動物とヒト1,5,6,7,8 in vivo での調査をin vitroで研究されている。しかし、プラークの開発上のせん断応力の影響の体系的調査を可能にする、再現性の高い小動物モデルはまれです。最近、ナムら9は、頸動脈の枝の結紮が低いと振動流の領域が作成されるマウスモデルを導入しました。このモデルは、内皮機能障害と高脂血症マウスにおけるアテローム性動脈硬化病変の急速な形成を引き起こすが、それは少なくとも部分的には、観測された炎症反応があることを除外することができます、その結果OF内皮および/またはライゲーションに起因する血管損傷。

そのような制限を回避するためには、せん断応力修正カフはその円錐形の内腔総頸動脈10内に、低、高と振動せん断応力の定義された領域を作成するために選択された計算された流体力学、に基づいて開発されている。アポリポタンパク質E(アポE)のノックアウトマウスではこのモデルを適用することにより血管病変は、カフから上流と下流の開発、高コレステロール西洋型の飼料を与えた。それらの表現型は、 生体磁気共鳴イメージング(MRI)12によって確認地域流動ダイナミクス11で相関している:上流のカフのローと層せん断応力の振動せん断応力の下流のに対し、より脆弱な表現型の大規模なプラークの形成を引き起こすカフは、安定したアテローム性動脈硬化の病変11を誘導する 。高せん断応力とカフ内の高い層流のそれらの領域で、一般的にはアテローム性動脈硬化プラークが観察されない。

結論では、せん断応力 - 修正カフの手順は、アポE欠損マウスでは表現型別のアテローム性動脈硬化病変を生成するために信頼性の高い外科的アプローチです。

Protocol

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1。せん断応力の修飾子を準備(カフ)

  1. せん断応力の修飾子 円錐形の内腔を持つ円柱の2つの長手方向の半分で構成されています。ハーフシェルは、プラスチック製の鋳造の手順で生成された熱可塑性ポリエーテルケトンで作られています。まだランナーに接続している間にキャスト要素が送信されます。したがって、ハーフシェルは、使用する前に切断する必要があります。 300μmの(下流端で最低の内径) - 各キャストは150μmに至るまでさまざまなサイズの半分のシェルが含まれています。
  2. カフの準備は、手術用顕微鏡下で実行する必要があります。
  3. 鈍鉗子と袖口のハーフシェルを持ち、静かに鋭いメスを用いて鋳造から切断してください。この手順では、さらに処理する必要が二枚貝の殻の片方の前駆体につながる。
  4. さらに、非滑り板上にハーフシェルの前駆体を配置し、REMのために鈍鉗子で固定し、予め形成された切開に沿って正確にカットクローズドエンドのオベ。これを使用する準備がカフのハーフシェルを得られます。
  5. 顕微鏡下のハーフシェルを制御し、静かに残りのシャープなエッジを削除します。円錐形の内腔は、上流と下流の注入カフの内せん断応力の異なる資質を誘導するために不可欠です。内腔に垂直に実行されているhalfシェルの外表面に溝がようやく機能的なカフを形成するために一緒にハーフシェルを付くスレッドの指針としての役割を果たします。
  6. 70%エタノールで、サイズに応じて分類カフハーフシェルを、保管してください。

2。右頸動脈の周囲カフを注入

  1. アポノックアウトマウスは、生​​後10週間くらいと、少なくとも20グラムの重さになるようにしてください。プラークの開発はそのような西洋型の食事療法を開始し、高コレステロールの食事療法で調査が必要な場合、4週間前にカフの注入が推奨されます。
  2. 全体の外科的処置すべき少なくとも半無菌条件下で行われる:手術衣、マスク、キャップおよび、滅菌手袋を着用してください。ビーズ機器滅菌器で30秒間器具を滅菌し、無菌の不透明なシートの上に置きます。気をつけろ!ナショナルインスツルメンツでは、使用前にクールダウンする必要があります!
  3. それは完全に麻酔されるまでイソフルラン3%満たされた麻酔導入チャンバーにマウスを置きます。つま先のピンチに反応して麻酔の深さを確認してください。また、麻酔は、ケタミン(80 mg / kg体重)及びキシラジン(10 mg / kg)の腹腔内(ip)注射またはIACUCによって承認された代替の麻酔薬で行うことができます。腹腔内注射の場合は、仰臥位でマウスをホールドし、腹部の左下腹部に麻酔薬を注射する。
  4. 仰臥位で、加熱された外科的プレートの上にマウスを置きます。眼軟膏(例:Bepanthen目と鼻ローション)とそれらを湿らせてドライ運転の目を防ぐために。船首と後肢足とプレ​​ートにテープそれらのダウンを広げる。イソフルラン麻酔、麻酔ガスの流れ(2%イソフルラン)を実行すると、小さな齧歯動物のマスクを介して供給する必要がある場合。
  5. どちらかの適用脱毛剤(例えばPilcaメッド)によって、または罰金、電気シェーバー(例:ウエラContura)を使用して、下顎と胸骨の間に髪を取り外します。シェービングは、刺激性の皮膚を避けるために慎重に実行する必要があります。すべての毛と脱毛剤が除去されるまで脱毛剤を使用している場合、それを髪に浸透するために1〜2分を与え、その後、軽くこする。
  6. さまざまなサイズ(各サイズの2つ)と相互接続するための6から0絹縫合糸の2.5 cmの長尺頸動脈閉塞の部位のハーフシェルの準備が事前に準備されたカフのハーフシェルを持っている。
  7. Betadineのリベラルな量で術野を消毒する。胸骨( 胸骨柄 )の上から4〜5ミリメートル内側切開で皮膚と首の基本的な筋膜を開くには鋭い小さなはさみを使用してください。
  8. オープニング、sを展開わき右耳下腺をhiftと外科スプレッダーを挿入します。その後、ぶっきらぼうにちょうどあなたが脈動右総頸動脈を識別できるようになるまで右sternomastoideus筋は、右の肩甲舌骨筋を横切る気管(外科医のビューから)、の左、深いに解剖。
  9. 非常に微細な傾斜または湾曲鉗子(例えばデュモン#5 / 45)を使用して、静かに周囲の結合組織を除去することにより右総頸動脈を解剖。頸動脈に沿って直接実行されている白、糸オブジェクト - - 迷走神経から頸動脈を分離し、このステップは完全に血管を露出させる必要があるとして。どちらも迷走神経も頸動脈に密接な関係にもある左の内頸静脈の枝を害するしないように注意してください。
  10. 右側のカフのサイズを選択するために、カフのハーフシェルの内径を持つ露出した頸動脈の直径を比較する:袖口の内腔の最大幅は、頸動脈の外径に適合する必要があります。 今、慎重に頸動脈の下6から0絹縫合糸の一部、鉗子を開いて、頸動脈の下糸を鉗子の先端を入れ、ループを形成する。頸動脈の下にループと頸動脈の場所oneカフのハーフシェル間。最大の狭小化の側面は、下流にする必要があります。
  11. 頸動脈の上にループ内の第カフのハーフシェルを置きます。
  12. そっと縫合鉗子とノードのスレッドを使用して、縫合糸のループを締めてください。これを行うことによって機能してせん断応力の修飾子が形成される。カフの正確なフィッティングのためにそれは、縫合糸は、カフの外面上にあらかじめ形成された溝内に正確に実行されていることが不可欠です。
  13. 代わりに、近似、元の位置に戻って右耳下腺を移動し、皮膚を閉じてどちらか6から0 proleneの縫合糸の少量を使用するかは、創傷クリップを使用することができます。
  14. 予防的な痛みの治療と場所を提供するために、皮下5 mg / kgのカルプロフェン(例:Rimadyl)の単回投与を注入するそれが回復するまで、温暖化チャンバ内のマウス。ケタミン/キシラジン麻酔を使用する場合は、通常、これは30〜60分かかります。イソフルラン吸入麻酔を使用する場合は、回復期間は(10〜20分)実質的に短いです。
  15. 我々の経験では、動物は経験豊富な外科医によって実行されている介入とカフ留置後の最初の24時間以内に正常なストレスのない活動を取り戻す。しかし、動物は、不良であっても一日後に手術となる鎮痛処置を繰り返すと獣医スタッフに相談して表示される場合。

3。カフと頸動脈をExplanting

  1. 組織学的分析のために頸動脈は観察期間の終わりに収穫する必要があります。植を開始する前に、動物はIACUCガイドラインにしたがって殺されなければならない。
  2. カフのハーフシェルを再利用するために意図されている場合、慎重にDIS、プラスチックの要素からすべての組織片と接続する縫合糸を除去頸動脈からsecting、洗浄し、70%のアルコール溶液でハーフシェルを格納する。一つは、カフが注入の数週間後、1つが血管壁を害することのないために注意してカフを解明するために持つ結合組織の癒着に埋め込まれていることを念頭に置く必要があります。
  3. また、カフは、外植し、頸動脈と一緒に埋め込むことができます。カフのプラスチック材料は、パラフィン包埋のために使用される通常の固定液と溶剤に対して耐性があります。また、埋め込まれたサンプルは通常のブレードを装備した通常のミクロトームを使用してカットすることができます。

4。代表的な結果

カフには、動物の二つ総頸動脈(図1A、1B)の周りを常に配置する必要がある - 反対側には、コントロールとして機能します。カフ(図1B)の2枚のハーフシェルを提示する画像に内腔の円錐形が表示されます。この円錐形は、esのために不可欠です。異なるフローのダイナミクスを持つ3つの領域をtablishing。ドップラー測定値11と位相コントラスト速度MR画像12に基づいて対応する流速から算出したキャストにより誘発される典型的なせん断応力パターンを図2に示す。

カフがアポノックアウトマウスに移植されると西洋型の食事は与えた変更されたフローダイナミクス誘発せん断応力誘起される動脈硬化性プラークの沈着(図3):アップストリーム円錐形のくびれが低い層のせん断応力のは、より多くのアテローム性動脈硬化プラークの大規模な開発につながる近くに中央の内腔に脂質コアを特徴と脆弱な表現型は、薄い線維性キャップ(図3A1)によってのみ覆われて。カフの円錐形の内腔は、流速の増加につながります。ほとんどはプラークの沈着は、この領域では観察されない。直接下流にボトルネックのサイトの渦と振動FLOの領域における動脈の結果の広がり即時より安定した表現型(メディアへの、より近くにローカライズされている、すなわち少ない脂質コア)の以下の拡張されたプラークの開発の原因となるwのパラメータを、。

図1
。。図1せん断応力の修飾子-アセンブリと配置 ()注入カフの模式図:カフが右総頸動脈(RCCA)の周囲に配置されている-反対側は(LCCA =左総頸動脈)のコントロールとして機能します。 (B)マウスのin vivo MRI血管造影で:三次元飛行時間型MR血管造影の最大値投影ではキャスト(白矢印)により誘導される円錐形の収縮は、(詳細は12を参照のために)表示されます。 (H =ヘッド、F =フィート、R =右、L =左)。右上隅の内腔と袖口のハーフシェルの外表面に巨視的なビューが与えられます。組み立てられると、2枚のハーフシェルは変更される円錐形の筒を形成する定義された方法で容器内の流れのダイナミクス。右の適合を保障するために、カフ(黄色の矢印)の外側表面上の溝は、リンクの縫合のためのガイディングとなります。

図2
図2。異なる流れのダイナミクスとせん断応力の領域。定義された方法でくびれて頸動脈のカフを変化させるフローダイナミクス、その後せん断応力の注入。上部の概略図では別の流動特性が示されているとせん断応力のローカル近似値は、(ドップラー計測11に基づいて)与えられている。以下に、注入されたカフの上流にMRIにより測定された単一の動物に対応する流速は、首のT1強調断面MRI像( 位相コントラスト速度イメージング 、詳細については、12を参照)に示されています。


図3。せん断応力は、アポEノックアウトマウスではプラークの開発を誘導した。左上隅に開いた首に巨視的なビューを示し、8週間せん断応力の注入後に高脂肪(西洋型)食事でアポノックアウトマウスの頸動脈を露出した右総頸動脈(RCCA)の周り修飾子。カフの上流容器(*)の不透明な白色の領域は広範な動脈硬化性プラークの沈着部位に対応しています。黄色の矢印は、2つのカフの半分を組み合わせたスレッドを示します。対照的に、左の一般的な冠状動脈(LCCA)におけるプラーク沈着の兆候はありません。
(A) - (C)代表HEは、8週間カフの移植後の西洋型の食生活の下でアポノックアウトマウスの右総頸動脈の断面を染色。概略図は、対応する平面を示しています(点線)WHEREセクションが位置していた。 (A)カフアテローム性動脈硬化症のアップストリームは、大規模なプラークの沈着につながります。部分的に近い中央の内腔に配置されている大規模な脂質コアは、(赤矢印)、(細部A1)これらのプラークの脆弱なキャラクターを特徴づける。カフの直接下流(C)振動流がより安定型(すなわち少ない、またはまったく脂質コア)のプラークの開発を緩和につながるのに対し、(B)カフのボトルネックの面ではほぼないプラークの開発は、明らかではありません。 (C1、C2カフの=ハーフシェル、P =プラーク、アスタリスク=血管内腔)

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Discussion

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実験的なばらつきを最小限にするために、それはほぼ同じ年齢の動物で、同じ食事の歴史を持つ動作することをお勧めします。最近発表された調査は、野生型マウスに適用されるせん断応力の修飾子が変更された流動ダイナミクス13によって誘導される内皮機能不全と早期の炎症反応の調査のための良いモデルになる可能性があることを示しています。しかし、動脈硬化性プラークの開発トランスジェニック高脂血症のマウスモデルのお問い合わせは(アポEノックアウトマウスなど)が必要です。それぞれのマウスモデルにおける進行やプラークの沈着の程度は、使用される食事のタイプによって異なります。一般的には、コレステロール/食事の脂肪含量が高いほど、疾患のより急速な進行です。

カフの注入中に外科医はこれが怪我のために炎症反応を低下させる予定のため、組織の損傷と操作を最小限に抑える必要があります。時損傷を最小限に抑えることは特に重要です。アテローム性動脈硬化症の経過における炎症プロセスは、研究の焦点になります。手術後の炎症の程度を推定するために、それは非常にいくつかの動物での非収縮性の制御の袖口を移植することをお勧めします。コントロールのカフは、しかし、連続、非収縮内径で、同一の材料からなる円筒でなければなりません。

また、常に頚動脈の同じ位置にカフを配置すると、常に同じ側を選択することが重要である、そうでなければ流速が再現可能ではありません。外科医は、2つのカフのハーフシェルを組み合わせる際にカフの右側フィットの偉大な世話をする必要があります、ために順番に予測不可能な流れのパラメータにつながるではない容易に形成された円錐形の内腔での不適切なフィット結果。

せん断応力の修飾子の大きな利点は、(Fiのそれが同一の容器内の流速の特性と再現性のパターンで三よく定義された領域を作成することですG. 2、表1)。高脂血症の環境では、これらのフローパターンの各々は、ヒトにおける脆弱と安定プラークに似た特徴的な表現型(図2)のプラークの沈着を引き起こす。

したがって、提示さマウスの頸動脈のカフは、せん断応力誘導プラークの表現型(stableとunstable)の調査のためのin vivoモデル貴重なものです。さらに、それはまた、生命を脅かす心血管イベントを生じさせる初期のイベント進行プラークの沈着が狭窄やプラーク破裂に至る前であっても早期のアテローム性動脈硬化症の部位を同定するために設計された新しい分子イメージングプローブの開発のための理想的な小動物モデル、、かもしれない血栓形成と心筋梗塞のような。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もない。

Acknowledgments

この研究は、プロジェクトGZ PI 771/1-1、ドイツ学術振興協会(DFG)によって部分的にサポートされていました。SFB 656"心臓血管分子イメージング、"ミュンスター、ドイツ(プロジェクトC6、Z2、B3、およびPM3)、EUノエ"診断分子イメージング- DIMI"(WP 11.1および11.2)。研究はまた、英国心臓財団、英国の一部で賄われていた。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shear stress modifier (polyetherketone) Promolding BV

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References

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Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).More

Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).

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