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Medicine

Implantação de um Cuff Carotid para Triggering Shear-estresse aterosclerose induzida em camundongos

doi: 10.3791/3308 Published: January 13, 2012

Summary

O manguito constricting apresentado neste artigo é projetado para induzir a aterosclerose na artéria carótida comum murino. Devido à forma cônica de sua luz interior do manguito implantado gera regiões bem definidas de baixa, alta tensão e de cisalhamento oscilatório desencadear o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas de diferentes fenótipos inflamatórios.

Abstract

É amplamente aceito que as alterações na tensão de cisalhamento vascular desencadear a expressão de genes inflamatórios em células endoteliais e, assim, induzir a aterosclerose (revisto em 1 e 2). O papel do estresse de cisalhamento tem sido extensivamente estudada in vitro investigando a influência da dinâmica do fluxo em cultura de células endoteliais 1,3,4 e in vivo em animais maiores e os seres humanos 1,5,6,7,8. No entanto, altamente reprodutível modelos animais de pequeno porte permitindo a investigação sistemática da influência da tensão de cisalhamento sobre o desenvolvimento da placa são raros. Recentemente, Nam et al. 9 introduziu um modelo de camundongo em que a ligadura de ramos da artéria carótida cria uma região de baixo fluxo e oscilatório. Embora este modelo faz com que a disfunção endotelial e rápida formação de lesões ateroscleróticas em camundongos hiperlipidêmicos, não se pode excluir que a resposta inflamatória observada é, pelo menos em parte, uma conseqüência of endotelial e / ou danos navio devido a ligadura.

A fim de evitar tais limitações, um manguito de cisalhamento modificando foi desenvolvido com base em dinâmica de fluidos calculado, cuja forma de cone lúmen interno foi escolhida para criar regiões definidas de baixa, alta tensão e de cisalhamento oscilatório dentro da artéria carótida comum 10. Ao aplicar este modelo em camundongos apolipoproteína E (ApoE) knockout alimentados com uma dieta elevada de colesterol do tipo ocidental, lesões vasculares desenvolver a montante ea jusante do manguito. Seu fenótipo é correlacionada com a dinâmica do fluxo regional 11 como confirmado por Ressonância Magnética in vivo (MRI) 12: tensão de cisalhamento baixa e laminar a montante do manguito provoca a formação de placas extensas de um fenótipo mais vulneráveis, enquanto a jusante de cisalhamento oscilatório de estresse o manguito induz lesões ateroscleróticas estável 11. Nas regiões de alta tensão de cisalhamento e fluxo laminar de alta dentro do manguito,normalmente não são observadas placas ateroscleróticas.

Em conclusão, o procedimento manguito cisalhamento modificando-se de uma abordagem cirúrgica confiável para produzir fenotipicamente diferentes lesões ateroscleróticas em camundongos deficientes em ApoE.

Protocol

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1. Preparando o modificador de tensão de cisalhamento (manguito)

  1. O modificador de tensão de cisalhamento consiste em duas metades longitudinal de um cilindro com um lúmen em forma de cone. As cascas são feitas de meia polyetherketone termoplásticas produzidas por um processo de fundição de plástico. Os elementos elenco são enviados ao mesmo tempo ligado ao corredor. Assim, as conchas meia tem que ser cortado antes do uso. Cada elenco contém cascas de metade dos diferentes tamanhos variando de 150 M - 300 mm (diâmetro interno menor no final a jusante).
  2. A preparação cuff deve ser realizada sob um microscópio cirúrgico.
  3. Segure o meia concha manguito com uma pinça sem corte e corte-a delicadamente do elenco usando um bisturi afiado. Este procedimento vai levar a metade precursores shell que têm de ser tratados posteriormente.
  4. Coloque o precursor meia concha sobre uma placa, mesmo não escorregadio; corrigi-lo com uma pinça sem corte e corte-a exatamente ao longo da incisão pré-formados, a fim de remove extremidade fechada. O resultado será o meia concha manguito pronto para uso.
  5. Controle as conchas meia sob o microscópio e remova cuidadosamente todas as bordas afiadas restantes. A luz interior cónico é essencial para induzir diferentes qualidades de tensão de cisalhamento dentro, a montante ea jusante do manguito implantado. Um sulco na superfície externa das conchas meia perpendicular ao lúmen interno serve como um orientador para a discussão que finalmente sticks as conchas meia para formar o manguito funcional.
  6. Armazenar as conchas meia manga, classificados de acordo com tamanho, em etanol 70%.

2. Implantar o manguito ao redor da artéria carótida direita

  1. Camundongos knockout ApoE deve ser em torno de 10 semanas de idade e com um peso de pelo menos 20 gramas. Se o desenvolvimento da placa deve ser investigada sob dieta rica em colesterol, começando como uma dieta tipo ocidental 4 semanas antes da implantação do manguito é recomendado.
  2. Todo o procedimento cirúrgico deveser realizada em pelo menos semi-estéril condições: Use um vestido cirúrgico, máscara e gorro e luvas estéreis. Esterilizar os instrumentos por 30 segundos num esterilizador instrumento talão e colocá-los em uma folha estéril opaco. Cuidado! Instrumentos têm para esfriar antes de usar!
  3. Posicione o mouse em uma câmara de indução da anestesia preenchido com 3% de isoflurano até que esteja completamente anestesiado. Verificar a profundidade da anestesia com resposta a pitada dedo do pé. Alternativamente, a anestesia pode ser realizada com injeção (ip) intraperitoneal de ketamina (80 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) ou anestésicos alternativo aprovado pela IACUC. Para injeção ip, mantenha o mouse na posição supina e injetar o anestésico no quadrante inferior esquerdo do abdômen.
  4. Posicione o mouse sobre uma placa aquecida cirúrgica, em decúbito dorsal. A fim de evitar os olhos de funcionamento a seco umedece-los com colírio (por exemplo, Bepanthen loção olhos e nariz). Espalhe a frente-e-patas traseiras e gravá-los para baixo à placa. Se realizar anestesia com isoflurano, o fluxo de gás narcótico (2% de isoflurano) tem de ser fornecida através de uma máscara de pequenos roedores.
  5. Remover os pêlos entre a mandíbula eo esterno por qualquer agente depilatório aplicação (por exemplo, Pilca Med) ou usando uma multa barbeador elétrico (por exemplo, Wella Contura). Barbear deve ser realizada com cautela para evitar irritar a pele. Se estiver usando um agente depilatório, dar-lhe 1-2 minutos para penetrar no cabelo, em seguida, esfregue suavemente até que todo o cabelo e agente depilatório seja removido.
  6. Ter pronto conchas cuff previamente preparado meia de tamanhos diferentes (dois de cada tamanho) e um pedaço 2,5 cm de comprimento do fio de seda 6-0 para a interconexão das conchas meia no local da oclusão carotídea.
  7. Desinfetar a área operacional com quantidade liberal de Betadine. Use afiada tesoura pequena para abrir a pele e da fáscia subjacente do pescoço por uma incisão medial 4-5mm a partir do topo do esterno (manúbrio).
  8. Expandir a abertura, shift da parótida direita lado e inserir um espalhador cirúrgico. Em seguida, sem rodeios dissecar se ao largo, à esquerda da traquéia (do ponto de vista cirurgiões), onde o músculo sternomastoideus direita cruza o músculo omo-hióideo direito, até que sejam capazes de identificar os carótida direita pulsante comum.
  9. Usando uma pinça muito fina ângulo ou curvas (por exemplo, Dumont # 5 / 45), dissecção da artéria carótida comum direita suavemente a remoção do tecido conectivo circundante. Separar os carótida do nervo vago - o objeto, branco stringy executando diretamente ao longo da carótida - que este passo é necessário para exposição completa do navio. Tenha cuidado para não prejudicar o nervo vago, nem um ramo da veia jugular interna esquerda, que também está em estreita relação com a carótida.
  10. , A fim de escolher o tamanho do manguito direito, compare o diâmetro da carótida exposta com o diâmetro interno do meia conchas manguito: O maior largura do lúmen punhos devem atender o diâmetro externo da carótida. Agora, cuidadosamente coloque a ponta da pinça sob a carótida, abra a pinça, fio o pedaço de fio de seda 6-0 sob a carótida e formar um loop. Entre o circuito e da carótida lugar uma meia concha manguito abaixo da carótida. O lado de maior estreitamento tem que ser a jusante.
  11. Coloque o shell segunda metade cuff dentro do laço na parte superior da carótida.
  12. Aperte levemente o ciclo de sutura com a pinça e sutura do nó de discussão. Ao fazer isso o funcionamento modificador de tensão de cisalhamento é formado. Para a montagem precisa do manguito é essencial que a sutura é executado exatamente dentro do sulco pré-formada na superfície externa do manguito.
  13. Mova o parótida direita de volta na sua posição original, aproximados e fechar a pele utilizando uma pequena quantidade de prolene 6-0 ou, alternativamente, você pode usar clips ferida.
  14. Injetar uma dose única de 5 mg / kg carprofeno (Rimadyl por exemplo) por via subcutânea para fornecer tratamento da dor profiláticas e lugaro mouse em uma câmara de aquecimento até que ele se recupera. Normalmente, isso leva 30-60 min quando se utiliza a anestesia Ketamina / Xilazina. Quando se utiliza anestesia por inalação de isoflurano o período de recuperação é substancialmente mais curtos (10-20 min).
  15. Em nossa experiência, animais recobram a atividade normal dentro átonas as primeiras 24 horas após o implante manguito com a intervenção a ser realizada por um cirurgião experiente. No entanto, se o animal parece estar angustiado até o primeiro dia pós-operatório, repetir o tratamento analgésico e consultar com o pessoal veterinário.

3. Explanting o manguito e as artérias carótidas

  1. Para análise histológica das artérias carótidas tem que ser colhida no final do período de observação. Antes de iniciar explante, o animal tem de ser morto de acordo com as diretrizes IACUC.
  2. Se os reservatórios meia manguito são destinadas a ser reutilizadas, remova cuidadosamente todos os fragmentos de tecido e da sutura de ligação dos elementos plásticos, dissecting das artérias carótidas, lave e guarde as cascas metade em solução de álcool 70%. Deve-se ter em mente que o manguito é incorporado em aderências do tecido conjuntivo após várias semanas de implantação e que é preciso dissecar o manguito com cuidado para não danificar as paredes dos vasos.
  3. Alternativamente, o manguito pode ser explantado e incorporados juntamente com a artéria carótida. O material plástico do manguito é resistente a soluções de fixação normal e solventes utilizados para inclusão em parafina. Além disso, as amostras de embutidos pode ser cortado usando um micrótomo normais equipados com lâminas normal.

4. Resultados representante

O manguito deve ser colocado sempre em torno de uma das duas artérias carótidas comuns de um animal (Fig. 1A, 1B) - o lado contralateral serve como um controle. Na imagem apresentando as duas conchas metade do manguito (Figura 1B) da forma cônica do lúmen interno é visível. Esta forma cônica é essencial para esbelecer as três regiões com dinâmicas de fluxo distintas. Padrões típicos de shear stress induzido pelo elenco calculados a partir de medições Doppler 11 e as velocidades de fluxo correspondente com base na velocidade de contraste de fase RM 12 são apresentados na Figura 2.

Quando o manguito é implantado em camundongos knockout ApoE alimentados com uma dieta tipo ocidental o fluxo alterado a dinâmica provocar tensão de cisalhamento deposição de placas ateroscleróticas induzida (Fig. 3): Upstream da cônica tensão de cisalhamento constrição baixo laminar leva ao desenvolvimento em massa de placas ateroscleróticas de um mais fenótipo vulneráveis, caracterizados por núcleos de lipídeos perto do lúmen central coberto apenas por uma fina capa fibrosa (Fig. 3A1). A luz interior cónico do manguito leva a um aumento na velocidade do fluxo. Quase não deposição de placas é observada nesta área. Imediatamente a jusante do local do gargalo a imediata ampliação dos resultados da artéria em uma área de vórtices e flo oscilatórioparâmetros w, o que provoca o desenvolvimento de placas menos alargada de um fenótipo mais estável (núcleos de lipídeos ou seja, menos que são localizadas mais perto da mídia).

Figura 1
Figura 1 O modificador de tensão de cisalhamento - montagem e colocação de (A) Desenho esquemático do manguito implantado:.. O manguito é colocado ao redor da artéria carótida comum direita (ACCD) - o lado contralateral (ACCV = artéria carótida comum esquerda) serve como controle . (B) In vivo MRI angiografia em um mouse: Na projeção de intensidade máxima de uma imagem tridimensional do tempo de vôo angio-RM a constrição cônica induzida pelo elenco (seta branca) é visível (para mais detalhes veja 12). (H = cabeça, F = pés, R = direita, L = esquerda). No canto superior direito uma visão macroscópica do lúmen interno ea superfície externa das conchas meia manguito é dado. Quando montada, duas conchas meia forma um cilindro cônico, que modificaa dinâmica de fluxo dentro do vaso de uma forma definida. Para garantir o ajuste direito, um sulco na superfície externa do manguito (seta amarela) serve como um orientador para a sutura de ligação.

Figura 2
Figura 2. Regiões da dinâmica de fluxo diferentes e tensão de cisalhamento. Implantação do manguito dinâmica do fluxo e estresse altera posteriormente cisalhamento na artéria carótida constricted de uma forma definida. Na ilustração esquemática superior as propriedades de fluxo diferentes são indicados e os valores locais aproximados para tensão de cisalhamento são dadas (com base em medições Doppler 11). Abaixo, velocidades de fluxo correspondente para um único animal medido por MRI upstream do manguito implantados são mostrados em um T1 transversal imagem de ressonância magnética do pescoço (contraste de fase de velocidade, para detalhes veja 12).


Figura 3. Shear stress induzido o desenvolvimento de placas em camundongos knockout ApoE. O canto superior esquerdo mostra a visão macroscópica no pescoço aberto e exposto artérias carótidas de ratos knockout ApoE sob dieta rica (tipo ocidental) de gordura 8 semanas após o implante de uma tensão de cisalhamento modificador ao redor da artéria carótida comum direita (ACCD). A região branca opaca do navio (*) a montante do manguito corresponde a um local de deposição de placas ateroscleróticas extensa. A seta amarela indica o segmento que combina as duas metades manguito. Em contraste, não há sinais de deposição de placas na artéria coronária esquerda comum (ACCV).
(A) - (C) Representante HE manchada seções transversais da artéria carótida comum direita de um mouse ApoE knockout sob dieta tipo ocidental 8 semanas após o implante do manguito. A ilustração esquemática dá os planos correspondentes (linhas pontilhadas) where os cortes foram localizados. (A) Upstream da aterosclerose manguito leva à deposição de placa maciça. Núcleos de lipídios de grande porte (setas vermelhas), que em parte estão localizados perto do lúmen central (detalhe A1) caracterizar o caráter vulnerável dessas placas. (B) No plano do gargalo manguito quase nenhum desenvolvimento placa é óbvio, enquanto que imediatamente a jusante do manguito (C) o fluxo oscilatório leva a moderada desenvolvimento de uma placa de um tipo mais estável (ou seja, núcleos de lipídeos menos ou nenhum). (C1, C2 = conchas metade do manguito, P = placas, asterisco navio = luz)

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Discussion

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A fim de minimizar a variação experimental é recomendado para trabalhar com animais de quase a mesma idade e com a história mesma dieta. Uma investigação publicada recentemente demonstra que o modificador de tensão de cisalhamento aplicada em camundongos tipo selvagem pode ser um bom modelo para a investigação de disfunção endotelial e no início de respostas inflamatória induzida pelo fluxo alterou a dinâmica 13. No entanto, para o inquérito da placa aterosclerótica desenvolvimento transgênicos modelos de ratos hiperlipidêmicos (por exemplo, o mouse ApoE knockout) são obrigatórios. Progressão e extensão da deposição de placas em cada modelo de rato depende do tipo de dieta utilizada. Em geral, o maior teor de colesterol / gordura da dieta, mais rápida a progressão da doença é.

Durante a implantação do manguito o cirurgião deve tentar minimizar os danos do tecido e da manipulação, por isso irá diminuir a resposta inflamatória devido a lesão. Minimizando lesão é especialmente importante quandoprocessos inflamatórios no curso da aterosclerose estão no foco do estudo. Para estimar o grau de inflamação pós-cirúrgica é altamente recomendado para implantar punhos não constritiva de controle em alguns animais. O manguito de controle deve ser um cilindro feito de mesmo material, mas com um contínuo, não constritiva diâmetro interior.

É também essencial para sempre colocar a braçadeira na mesma posição da artéria carótida e escolher sempre o mesmo lado, as velocidades de fluxo de outra forma não são reprodutíveis. O cirurgião tem que tomar muito cuidado com o ajuste certo do manguito ao combinar os dois shells meia manga, porque imprópria resultados caber em um não é facilmente formada cônica lúmen interno que por sua vez leva a parâmetros de fluxo imprevisível.

A grande vantagem do modificador tensão de cisalhamento é que ele cria três regiões bem definidas, com padrões característicos e reprodutível de velocidades de fluxo dentro do mesmo navio (Fig. 2, Tabela 1). Em um ambiente hiperlipidêmicos cada um desses padrões de fluxo de causar deposição de placas de um fenótipo característico (Fig. 2) semelhante a placas vulneráveis ​​e estáveis ​​em humanos.

Assim, o manguito carótida apresentados mouse é um valioso modelo in vivo para a investigação de tensão de cisalhamento fenótipos placa induzida (estáveis ​​e instáveis). Além disso, pode ser também um modelo animal ideal pequeno para o desenvolvimento de novos testes de imagem molecular, desenhado para identificar precocemente os sites da aterosclerose, mesmo antes de deposição de placas progrediu leva a estenose ou ruptura da placa, o evento inicial que deu origem a vida em risco de eventos cardiovasculares como a formação de trombos e infarto do miocárdio.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado em parte pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), o projeto GZ PI 771/1-1; SFB 656 "Imagem Cardiovascular Molecular", Münster, Alemanha (projetos C6, Z2, B3, e PM3); UE NoE "Diagnostic Imagem Molecular-DIMI "(WP 11.1 e 11.2). O estudo também foi financiado em parte pela British Heart Foundation, do Reino Unido.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shear stress modifier (polyetherketone) Promolding BV

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References

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Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).More

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