Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Имплантация сонной манжеты для запуска Shear-стресс, вызванный атеросклероза у мышей

doi: 10.3791/3308 Published: January 13, 2012

Summary

Стягивающий манжеты представлены в этой статье, призваны побудить атеросклероза у мышиных общей сонной артерии. Из-за конической формы ее внутренний просвет имплантированных манжета создает четко определенные регионы низкий, высокий и колебательных касательное напряжение срабатывания развития атеросклеротических поражений различных воспалительных фенотипов.

Abstract

Широко признается, что изменения в сосудистой напряжения сдвига вызвать экспрессию воспалительных генов в эндотелиальных клетках и тем самым вызывают атеросклероз (обзор в 1 и 2). Роль напряжения сдвига широко изучалась в пробирке исследования влияния динамики потоков на культуре эндотелиальных клеток 1,3,4 и в естественных условиях в более крупных животных и людей 1,5,6,7,8. Тем не менее, высокой воспроизводимостью небольших животных моделей позволяет систематическое исследование влияния напряжения сдвига на доску развития встречаются редко. В последнее время Нама и др. 9. Введен мышиной модели, в которых перевязка ветвей сонной артерии создает область низкого и колебательных потока. Хотя эта модель причин эндотелиальной дисфункции и быстрое образование атеросклеротических поражений в гиперлипидемией мышей, она не может быть исключено, что наблюдается воспалительная реакция, по крайней мере отчасти, следствием ое эндотелия и / или повреждения судна из-за труб.

Для того чтобы избежать таких ограничений, напряжение сдвига изменения манжета была разработана основе рассчитывается динамика жидкостей, чьи конический внутренний просвет был выбран для создания определенных областях низкого, высокого и колебательного напряжения сдвига в общей сонной артерии 10. Применяя эту модель в аполипопротеина Е (APOE) нокаутных мышей кормили высокий уровень холестерина в западной диеты типа, сосудистых поражений развивать вверх и вниз по течению от манжеты. Их фенотип коррелирует с региональной динамики потока 11, что подтверждается в естественных условиях магнитно-резонансная томография (МРТ) 12: Низкие и ламинарного напряжения сдвига вверх по течению от манжеты приводит к образованию обширных бляшек более уязвимыми фенотип, в то время как колебательная сдвига вниз по течению стресса манжеты вызывает стабильное атеросклеротическое поражение 11. В этих регионах с высоким напряжением сдвига и высокой ламинарного потока в манжете,обычно не атеросклеротические бляшки не наблюдается.

В заключение напряжения сдвига модифицирующие манжеты процедура надежный хирургический подход к подготовке фенотипически различных атеросклеротических поражений в ApoE-дефицитных мышей.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовка сдвига модификатор стресса (манжеты)

  1. Сдвига модификатор стресса состоит из двух продольных половин цилиндр с конической полости. Половина корпуса изготовлены из термопластичных polyetherketone производства пластиковых процедуры отливки. Литые элементы посылают в то же время связаны с бегуном. Таким образом, половина снарядов должны быть отрезаны перед использованием. Каждый литых содержит половину снарядов различных размеров в диапазоне от 150 мкм - 300 мкм (самый низкий внутренний диаметр в нижнем конце).
  2. Манжеты подготовка должна быть выполнена под хирургический микроскоп.
  3. Держите корпус манжеты пополам с тупым пинцетом и аккуратно отрезать ее от поданных с помощью острого скальпеля. Эта процедура приведет к створке раковины прекурсоров, которые должны быть дополнительно обработаны.
  4. Место предшественником на половинке раковины даже не скользкий пластины; исправить ее с тупым пинцетом и разрезать его точно по предварительно надрез, чтобы бэрОве закрытого конца. Это приведет к тому оболочку манжеты полуготовности для использования.
  5. Управление половину снарядов под микроскопом и аккуратно удалите оставшиеся острые края. Конические внутренний просвет имеет важное значение для стимулирования различных качеств напряжения сдвига внутри, до и после имплантированы манжеты. Паз на внешней поверхности половины снарядов, перпендикулярной внутренний просвет служит для руководящих нить, которая, наконец, палками половину снарядов вместе, чтобы сформировать функциональные манжеты.
  6. Магазин манжеты полукольца, классифицируются в соответствии с размером, в 70% этанола.

2. Имплантация манжету вокруг правой сонной артерии

  1. ApoE мышей нокаутом должна быть около 10-недельного возраста и в весе не менее 20 граммов. Если налет развития должны быть расследованы под высоким содержанием холестерина, начиная с таких западная диета типа 4 недели до манжеты имплантации рекомендуется.
  2. Вся хирургическая процедура должнапроводится под крайней мере полу-стерильных условиях: Носить халата хирурга, маска и шапка и стерильные перчатки. Стерилизовать инструментов в течение 30 секунд в бисер стерилизатор инструмента и разместить их на стерильной непрозрачных листов. Осторожно! Инструменты должны остыть перед использованием!
  3. Место мыши в камере анестезии индукции заполнены 3% изофлуран, пока он полностью под наркозом. Проверьте глубину анестезии с ответом до пят крайнем случае. Кроме того, анестезия может быть выполнена с внутрибрюшинного (ф) инъекции кетамина (80 мг / кг) и Ксилазин (10 мг / кг) или альтернативные анестетики утвержденным IACUC. Для IP-инъекции, удерживайте кнопку мыши на спине и ввести анестетик в левом нижнем квадранте живота.
  4. Место мыши на подогревом хирургические пластины, в положении лежа. В целях предотвращения глазах иссякает смочить их с глаз мазью (например, Bepanthen глаз и носа, лосьон). Распространение передних и задних лапах и лентой их к пластине. При выполнении изофлуран анестезии, наркотические потока газа (2% ИФ) должен подаваться через небольшую маску грызунов.
  5. Удаление волос между нижней челюстью и грудины либо применения для удаления волос агента (например Pilca Med) или с помощью тонкой электробритвы (например, Wella Contura). Бритье должно проводиться с осторожностью, чтобы не раздражать кожу. При использовании для удаления волос агента, дайте ему 1-2 минуты для проникновения волосы, после этого, мягко протереть, пока все волосы и удаления волос агент будет удален.
  6. Подготовьте заранее подготовленные манжеты half снарядов различных размеров (два из каждого размера) и 2,5 см длиной кусок 6-0 шелковых шва для соединения половина снарядов на месте сонных окклюзии.
  7. Лечить операционное поле с либеральными количество Бетадин. Используйте резкие маленькие ножницы, чтобы открыть кожи и основной фасции шеи 4-5мм медиальной разрез, начиная с верхней части грудины (рукояткой).
  8. Развернуть открытия, сhift правой околоушной слюнной железы в стороне и вставить хирургических разбрасыватель. Затем резко рассекать на глубину только что вышел из трахеи (с точки зрения хирургов), где право мышцы sternomastoideus кресты право omohyoid мышцы, пока вы не сможете определить пульсирующий правой общей сонной артерии.
  9. Использование очень тонких угловых или изогнутых щипцов (например, Дюмон # 5 / 45), рассекать правой общей сонной артерии, осторожно удаляя окружающую соединительную ткань. Отдельные сонной от блуждающего нерва - белый, тягучий объект работает прямо по сонной - как этот шаг необходим, чтобы полностью разоблачить судна. Будьте осторожны, ни вреда, ни блуждающего нерва ветви левой внутренней яремной вены, которая также находится в тесной связи с сонной артерии.
  10. Для того чтобы выбрать правильный размер манжеты, сравнить диаметр подвергается сонной с внутренним диаметром от манжеты полукольца: наибольшая ширина просвета манжеты должен соответствовать внешнему диаметру сонной артерии. Теперь, аккуратно положил кончик щипцов под сонных, открытых щипцов, нити кусок 6-0 шелковых шва под сонных и форму петли. Между петлю и сонных разместить один манжеты створке раковины под сонной артерии. Стороны крупнейших сужение должно быть ниже по течению.
  11. Место второго корпуса half манжеты внутри цикла в верхней части сонной артерии.
  12. Аккуратно затянуть шва цикле, используя наложение швов щипцов и узел потока. Делая это стресс функционирования сдвига модификатор формируется. Для точной подгонки манжеты важно, чтобы шов выполняется точно в предварительно канавку на наружной поверхности манжеты.
  13. Перемещение правой околоушной железы еще в исходное положение, приближенные и близкие кожи либо с помощью небольшого количества 6-0 проленовой шва или, как вариант, вы можете использовать раны клипов.
  14. Inject разовой дозе 5 мг / кг Carprofen (например, Римадил) подкожно обеспечить профилактическое лечение боли и местомышь в потеплении камере, пока не восстановится. Как правило, это занимает 30-60 мин при использовании кетамина / Ксилазин анестезии. При использовании изофлуран ингаляционной анестезии восстановительный период значительно короче (10-20 мин).
  15. По нашему опыту, животным восстановить нормальное безударных деятельности в течение первых 24 часов после имплантации с манжетой вмешательства выполняются опытным хирургом. Однако, если животное, как представляется, проблемных даже на один день после операции, повторить обезболивающее лечение и проконсультироваться с ветеринарным персоналом.

3. Культивирующий в искусственной среде манжеты и сонных артерий

  1. Для гистологического анализа сонной артерии должны быть собраны в конце периода наблюдения. Перед началом эксплантации, животное должно быть убито в соответствии с IACUC руководящих принципов.
  2. Если корпуса манжетой половина из них предназначена для повторного использования, тщательно удалить всю ткань фрагменты и соединения шов из пластиковых элементов, распересекающихся из сонных артерий, мыть и хранить половину снарядов в 70% спиртового раствора. При этом следует иметь в виду, что манжета встроенные в соединительную ткань спайки после нескольких недель имплантации и что нужно препарировать манжеты с осторожностью, чтобы не повредить стенки сосудов.
  3. Кроме того, манжета может быть эксплантированных и встроенные вместе с сонной артерии. Пластического материала, из манжеты устойчив к нормальных решений фиксации и растворители, используемые для парафина вложение. Кроме того, встроенные образцы могут быть сокращены с помощью обычной микротома оснащен нормальными лопастями.

4. Представитель Результаты

Манжеты должен быть размещен всегда вокруг одного из двух общих сонных артерий животного (рис. 1А, 1Б) - противоположной стороне выступает в качестве контроля. На изображении представляет две половины оболочки манжеты (рис. 1В) конической формы внутренний просвет видна. Это конической формы имеет важное значение для эс-tablishing трех регионах с различными динамики потока. Типичные модели сдвига стресс, вызванный литых рассчитывается по измерениям доплеровского 11 и соответствующей скорости потока на основе фазового контраста скорости МРТ 12 приведены на рисунке 2.

Когда манжета имплантируется в ApoE нокаутных мышей кормили западной диеты типа изменили динамику потока спровоцировать напряжение сдвига индуцированных атеросклеротические отложения налета (рис. 3): вверх по течению от конического сужения низким напряжением сдвига ламинарного приводит к массовому развитию атеросклеротических бляшек более уязвимых фенотип, характеризующийся липидного ядра близко к центральной полости покрыты только тонким шапка волокнистые (рис. 3A1). Конической внутренней полости манжет приводит к увеличению скорости течения. Почти нет доска осаждения наблюдается в этой области. Непосредственно ниже по течению от места узким местом немедленное расширение артерий приводит к области вихрей и колебательные Floш параметров, что приводит к менее протяженных доска развития более стабильных фенотип (то есть меньше липидного ядра, локализованных ближе к СМИ).

Рисунок 1
Рисунок 1 сдвига модификатор стресс - сборка и размещение () Схематическое изображение имплантирован манжеты:.. Манжета, расположенных вокруг правой общей сонной артерии (RCCA) - противоположной стороне (LCCA = левой общей сонной артерии) служит в качестве контроля . (B) В естественных условиях МРТ ангиографии мыши: В проекции максимальной интенсивности трехмерных время-пролетной МР-ангиография конической сужение индуцированных литые (белая стрелка) видна (подробнее см. 12). (Н = головы, F = ногами, R = правый, L = слева). В правом верхнем углу макроскопических вид на внутренний просвет и наружной поверхности манжеты полукольца дается. В собранном, два полукольца в форме конического цилиндра, который изменяетдинамики потоков внутри судна в установленном порядке. В целях обеспечения права нужным, паз на внешней поверхности манжеты (желтая стрелка) выступает в качестве руководящих для связи шва.

Рисунок 2
Рисунок 2. Регионы различной динамикой течения и напряжение сдвига. Имплантация манжеты изменяет динамику потока, а затем напряжение сдвига в сужения сонной артерии в определенном порядке. В верхнем рисунке схема различные свойства потока указаны и местных приближенные значения напряжения сдвига приведены (на основе измерений доплеровского 11). Ниже, соответствующие скорости потока для одного животного измеряли с помощью МРТ перед имплантированных манжеты показаны на Т1-взвешенных поперечного сечения МРТ-изображение шеи (фазового контраста скорость обработки изображений, подробнее см. 12).


Рисунок 3. Сдвига стресс доска развития в ApoE мышей нокаутом. Верхнем левом углу показывает макроскопический вид на шее и открыто подвергается сонной артерии мышей нокаутом ApoE под высоким содержанием жира (западного типа) диета 8 недель после имплантации напряжения сдвига Модификатор вокруг правой общей сонной артерии (RCCA). Непрозрачной белой областью судна (*) перед манжеты соответствует сайте обширные атеросклеротические отложения зубного налета. Желтая стрелка указывает нить, которая сочетает в себе две половины манжеты. В противоположность этому, Есть никаких признаков налета отложение в левой общей коронарной артерии (LCCA).
(А) - (C) Представитель Его витражи сечения правой общей сонной артерии ApoE мыши нокаутом в западной диеты типа 8 недель после имплантации манжеты. Схематическое изображение дает соответствующие плоскости (пунктирные линии) wherэлектронной разделы были расположены. () Вверх по течению манжеты атеросклероз приводит к массовое отложение зубного налета. Большой ядер липидов (красные стрелки), которые частично расположены в непосредственной близости к центральной полости (деталь А1) характеризуют уязвимых характер этих бляшек. (B) На плоскости манжеты узкие места почти нет доска развития очевидна, в то время как непосредственно на выходе из манжеты (C) колебательного потока приводит к умеренной доска развитию более устойчивого типа (то есть меньше или вообще не ядрами липидов). (C1, C2 = половина оболочек манжеты, P = бляшек, звездочка = просвет сосуда)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Чтобы свести к минимуму изменения экспериментальных рекомендуется работать с животными почти того же возраста и с тем же история диеты. Недавно опубликовала исследование показывает, что сдвиг модификатор напряжения, приложенного мышей дикого типа может быть хорошей моделью для исследования эндотелиальной дисфункции и в начале воспалительных реакций индуцированных изменены динамики потоков 13. Однако, для расследования атеросклеротической бляшки модели развития трансгенных гиперлипидемией мыши (например, ApoE мыши нокаутом) являются обязательными. Прогрессия и степени зубного налета отложений в каждой модели мыши зависит от типа диеты используются. В целом, чем выше уровень холестерина / жира содержание диеты, более быстрое прогрессирование болезни.

Во время имплантации манжеты хирурга должны стремиться к минимизации повреждения тканей и манипуляции, за это снизит воспалительные реакции из-за травмы. Сведение к минимуму травмы особенно важно, когдавоспалительные процессы в ходе атеросклероза находятся в фокусе исследования. Для того чтобы оценить степень послеоперационного воспаления, настоятельно рекомендуется, чтобы внедрить без констриктивный манжеты контроля в некоторых животных. Контроль манжеты должна быть цилиндр из того же материала, но с непрерывным, не констриктивный внутреннего диаметра.

Важно также, чтобы всегда место манжеты в то же положение сонной артерии и выбрать всегда ту же сторону, в противном случае скорость потока не воспроизводимые. Хирург должен взять большую заботу о праве приступе манжеты при объединении двух оболочек манжеты половину, потому что неправильно подходят приводит не легко образуются конические внутренний просвет, в свою очередь приводит к непредсказуемым параметров потока.

Большим преимуществом сдвига модификатор подчеркнуть, что он создает три четко определенных регионов с характеристикой и воспроизводимые модели скоростей потока в пределах того же судна (Fig. 2, таблица 1). В гиперлипидемией среде каждой из этих моделей потока причиной доска осаждения характерный фенотип (рис. 2), напоминающие уязвимых и стабильной бляшки в организме человека.

Таким образом, представленные манжеты мыши сонной является ценным в естественных условиях модель для исследования напряжения сдвига индуцированных доска фенотипов (устойчивые и неустойчивые). Кроме того, это может быть также идеальной маленькая модель животного для разработки новых молекулярных зондов изображения, предназначенные для раннего выявления участков атеросклероза еще до прогрессировала доска осаждения приводит к стеноз или разрыв бляшки, начальные события, вызвавшего опасное для жизни сердечно-сосудистых событий как тромбообразования и инфаркта миокарда.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано частично Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), проект Г. З. П. И. 771/1-1; SFB 656 "Сердечно-сосудистые молекулярной визуализации", Мюнстер, Германия (проекты C6, Z2, B3, и PM3); ЕС NoE «Диагностические Молекулярная Imaging-Дими »(WP 11.1 и 11.2). Исследование было также частично финансируется British Heart Foundation, Великобритания.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shear stress modifier (polyetherketone) Promolding BV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  2. Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab. Invest. 85, 9-23 (2005).
  3. Ali, F., Zakkar, M., Karu, K., Lidington, E. A., Hamdulay, S. S., Boyle, J. J., Zloh, M., Bauer, A., Haskard, D. O., Evans, P. C., Mason, J. C. Induction of the cytoprotective enzyme heme oxygenase-1 by statins is enhanced in vascular endothelium exposed to laminar shear stress and impaired by disturbed flow. J. Biol. Chem. 284, 18882-18892 (2009).
  4. Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293, C1824-C1833 (2007).
  5. Zheng, J., Abendschein, D. R., Okamoto, R. J., Yang, D., McCommis, K. S., Misselwitz, B., Gropler, R. J., Tang, D. MRI-based biomechanical imaging: initial study on early plaque progression and vessel remodeling. Magn. Reson. Imaging. 27, 1309-1318 (2009).
  6. Stone, P. H., Coskun, A. U., Kinlay, S., Clark, M. E., Sonka, M., Wahle, A., Ilegbusi, O. J., Yeghiazarians, Y., Popma, J. J., Orav, J., Kuntz, R. E., Feldman, C. L. Effect of endothelial shear stress on the progression of coronary artery disease, vascular remodeling, and in-stent restenosis in humans: in vivo 6-month follow-up study. Circulation. 108, 438-444 (2003).
  7. Pedersen, E. M., Oyre, S., Agerbaek, M., Kristensen, I. B., Ringgaard, S., Boesiger, P., Paaske, W. P. Distribution of early atherosclerotic lesions in the human abdominal aorta correlates with wall shear stresses measured in vivo. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 18, 328-333 (1999).
  8. Buchanan, J. R., Kleinstreuer, C., Truskey, G. A., Lei, M. Relation between non-uniform hemodynamics and sites of altered permeability and lesion growth at the rabbit aorto-celiac junction. Atherosclerosis. 143, 27-40 (1999).
  9. Nam, D., Ni, C. W., Rezvan, A., Suo, J., Budzyn, K., Llanos, A., Harrison, D., Giddens, D., Jo, H. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 1535-1543 (2009).
  10. Cheng, C., van Haperen, R., de Waard, M., van Damme, L. C., Tempel, D., Hanemaaijer, L., van Cappellen, G. W., Bos, J., Slager, C. J., Duncker, D. J., van der Steen, A. F., de Crom, R., Krams, R. Shear stress affects the intracellular distribution of eNOS: direct demonstration by a novel in vivo technique. Blood. 106, 3691-3698 (2005).
  11. Cheng, C., Tempel, D., van Haperen, R., van der Baan, A., Grosveld, F., Daemen, M. J., Krams, R., de Crom, R. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 113, 2744-2753 (2006).
  12. van Bochove, G. S., Straathof, R., Krams, R., Nicolay, K., Strijkers, G. J. MRI-determined carotid artery flow velocities and wall shear stress in a mouse model of vulnerable and stable atherosclerotic plaque. MAGMA. 23, 77-84 (2010).
  13. Cuhlmann, S., Van der Heiden, K., Saliba, D., Tremoleda, J. L., Khalil, M., Zakkar, M., Chaudhury, H., Luong, L. A., Mason, J. C., Udalova, I., Gsell, W., Jones, H., Haskard, D. O., Krams, R., Evans, P. C. Disturbed Blood Flow Induces RelA Expression via c-Jun N-Terminal Kinase 1: A Novel Mode of NF-{kappa}B Regulation That Promotes Arterial Inflammation. Circ. Res. 108, Forthcoming (2011).
Имплантация сонной манжеты для запуска Shear-стресс, вызванный атеросклероза у мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).More

Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter