Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Implantation av en Carotid Manschett för att utlösa Sear-stress åderförkalkning hos möss

doi: 10.3791/3308 Published: January 13, 2012

Summary

Den bromsande manschetten presenteras i denna artikel är avsedd att framkalla åderförkalkning i murina gemensamma halspulsådern. Tack vare den koniska formen på dess inre lumen den implanterade manschetten genererar väl definierade regioner med låg, hög och oscillerande skjuvspänning utlöser utvecklingen av aterosklerotiska lesioner av olika inflammatoriska fenotyper.

Abstract

Det är allmänt accepterat att förändringar i vaskulär skjuvspänning utlösa ett uttryck av inflammatoriska gener i endotelceller och därigenom framkalla åderförkalkning (över 1 och 2). Roll skjuvspänningen har studerats in vitro undersöka påverkan av flödesdynamik på odlade endotelceller 1,3,4 och in vivo i större djur och människor 1,5,6,7,8. Men, mycket reproducerbar små djurmodeller ger systematisk undersökning av påverkan av skjuvspänningen på plack utvecklingen är sällsynta. Nyligen introducerade Nam et al. 9 en musmodell där ligation av filialer till halspulsådern skapar en region med låg-och oscillerande flöde. Även om denna modell medför endoteldysfunktion och snabb bildning av aterosklerotiska lesioner i hyperlipidemic möss, kan det inte uteslutas att den observerade inflammatoriska svaret är, åtminstone delvis, en konsekvens of endotelceller och / eller fartyg skador på grund av ligatur.

För att undvika sådana begränsningar har en skjuvspänning ändra manschetten tagits fram baserat på beräknade fluiddynamik, vars konformad inre lumen valdes för att skapa definierade regioner med låg, hög och oscillerande skjuvspänning inom den gemensamma halspulsådern 10. Genom att tillämpa denna modell i apolipoprotein E (ApoE) knockout möss som fick högt kolesterol västerländsk typ kost, vaskulära lesioner utvecklas uppströms och nedströms från manschetten. Deras fenotyp är korrelerad med den regionala flödesdynamik 11 som bekräftas av in vivo-magnetisk resonanstomografi (MRT) 12: Låg och laminär skjuvspänning uppströms manschetten ger upphov till bildning av omfattande plack i en mer utsatt fenotypen, medan oscillerande skjuvspänning nedströms manschetten inducerar stabila aterosklerotiska lesioner 11. I de regioner av hög shear stress och höga laminärt flöde i manschetten,vanligtvis inga aterosklerotiska plack observeras.

Sammanfattningsvis är skjuvspänningen-ändra manschetten förfarande en pålitlig kirurgisk metod för att producera fenotypiskt olika aterosklerotiska lesioner i ApoE-brist möss.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Förbereda skjuvspänningen modifierare (manschett)

  1. Den skjuvspänningen modifieraren består av två längsgående halvor av en cylinder med en konformad lumen. Den halv skal är tillverkade av termoplast polyetherketone produceras av en plast gjutning förfarande. De gjutna delarna skickas ut samtidigt som fortfarande är ansluten till löpare. Därför halva skal måste skäras av innan användning. Varje kastade innehåller halv skal i olika storlekar från 150 ìm - 300 um (lägsta inre diameter på nedströms).
  2. Manschetten preparatet bör ske under en kirurgisk mikroskop.
  3. Håll skalet manschetten halv med trubbig pincett och försiktigt skära bort det från rollistan med hjälp av en vass skalpell. Detta förfarande kommer att leda till halv skal prekursorer som måste bearbetas ytterligare.
  4. Placera föregångare halv skalet på en ännu icke-hal-plattan, fixa det med trubbig pincett och skär den exakt längs förformade snitt för att remove den slutna änden. Detta kommer att ge skalet manschetten halv klar för användning.
  5. Styr halv skalen under mikroskop och ta försiktigt bort eventuellt kvarvarande vassa kanter. Den koniska inre lumen är en förutsättning för att framkalla olika kvaliteter av skjuvspänning inom, uppströms och nedströms den implanterade manschetten. Ett spår på utsidan av den halva skal köra vinkelrätt mot inre lumen fungerar som en ledstjärna för den tråd som slutligen sticker hälften skal samman för att bilda den funktionella manschetten.
  6. Förvara manschetten halv skal, klassificerade efter storlek, i 70% etanol.

2. Implantation manschetten runt höger halspulsådern

  1. ApoE knockoutmöss bör vara cirka 10 veckors ålder och med en vikt av minst 20 gram. Om plack utveckling bör undersökas under högt kolesterol diet, som börjar en sådan västerländsk typ kost 4 veckor innan manschetten implanteras rekommenderas.
  2. Hela kirurgiska ingrepp börske under minst semi-sterila förhållanden: Använd en operationsrock, mask och mössa och sterila handskar. Sterilisera instrumenten för 30 sekunder i en sträng instrument autoklav och placera dem på ett sterilt ogenomskinlig duk. Se upp! Instrument har svalna innan användning!
  3. Placera musen i en anestesi induktion kammare fylld med 3% isofluran tills den är helt sövd. Verifiera djup anestesi med svar på tå nypa. Alternativt kan anestesi utföras med intraperitoneal (ip) injektion av ketamin (80 mg / kg) och Xylazine (10 mg / kg) eller alternativ bedövningsmedel godkänts av IACUC. För ip injektion, håll musen i liggande ställning och injicera bedövningsmedel i den vänstra nedre kvadranten av buken.
  4. Placera musen på en uppvärmd kirurgisk platta, i liggande ställning. För att förhindra ögon torkar fukta dem med ögat salva (t ex Bepanthen ögon och näsa lotion). Sprid fram-och bakben, tassar och tejpa ner dem till plattan. Om du utför isoflurananestesi, den narkotiska gasflödet (2% isofluran) måste levereras via en liten gnagare mask.
  5. Ta bort hår mellan underkäke och bröstbenet genom att antingen tillämpa hårborttagningsprodukter medel (t.ex. Pilca Med) eller genom att använda en fin rakapparat (t.ex. Wella Contura). Rakning måste utföras med försiktighet för att undvika att irritera huden. Om du använder en hårborttagningsprodukter agent, ger det 1-2 min för att tränga in i håret, därefter försiktigt gnugga tills allt hår och hårborttagningsprodukter agent tas bort.
  6. Har klar tidigare förberedda skal manschetten hälften av olika storlekar (två av varje storlek) och en 2,5 cm lång bit av 6-0 siden sutur för sammankoppling av halv skalen på platsen för halspulsådern ocklusion.
  7. Desinficera drift fältet med liberala mängd Betadine. Använd vass liten sax för att öppna huden och den underliggande fascia i nacken med en 4-5mm mediala snitt med början från toppen av bröstbenet (munröret).
  8. Expandera öppningen, shift rätt öronspottkörteln åt sidan och sätt i en kirurgisk spridare. Sedan rakt på sak dissekera in i den djupa, strax till vänster om luftstrupen (från kirurger vy), där rätten sternomastoideus muskeln korsar rätt omohyoid muskel, tills du kan identifiera den pulserande rättighet som är gemensam halspulsådern.
  9. Använda mycket fint vinklade eller böjda peang (t.ex. Dumont # 5 / 45), dissekera den högra gemensamma halspulsådern genom att försiktigt ta bort den omgivande bindväven. Separera halspulsådern från vagusnerven - den vita, trådiga objekt körs direkt längs halspulsådern - eftersom detta steg är nödvändigt att helt utsätta fartyget. Var noga med att varken skada vagusnerven eller en gren av den vänstra inre halsvenen, vilket också är i nära anslutning till halspulsådern.
  10. För att välja rätt manschettstorlek, jämföra diametern på den exponerade halspulsådern med det inre diameter av manschetten halv skal: Den största bredden på manschetterna lumen bör uppfylla ytterdiameter halspulsådern. Nu, försiktigt satte spetsen på pincetten under halspulsådern, öppna pincett, trä bit 6-0 siden sutur under halspulsådern och bildar en ögla. Mellan slingan och halspulsådern placera en manschett Half Shell under halspulsådern. Den sida av största förträngning måste nedströms.
  11. Placera den andra skalet manschetten hälften inom loopen på toppen av halspulsådern.
  12. Dra åt suturen slingan med suturering pincett och nod tråden. Genom att göra denna funktion skjuvspänningen modifierare bildas. För exakt montering av manschetten är det viktigt att suturen körs precis inom förformade spåret på utsidan av manschetten.
  13. Flytta rätt öronspottkörteln tillbaka i sitt ursprungliga läge, ungefärliga och nära huden antingen med hjälp av en liten mängd 6-0 prolene sutur eller alternativt kan du använda sår klipp.
  14. Injicera en engångsdos av 5 mg / kg Karprofen (t.ex. Rimadyl) subkutant som profylaktisk smärtbehandling och platsmusen i en värmande kammare tills den har återhämtat sig. Normalt tar detta 30-60 min när du använder ketamin / Xylazine anestesi. Vid användning av isofluran inhalationsanestesi återhämtningsperioden är betydligt kortare (10-20 min).
  15. Vår erfarenhet är att djur återfå normal obetonade aktivitet inom de första 24 timmarna efter manschetten implantation med interventionen utförs av en erfaren kirurg. Men om djuret verkar vara bedrövad ännu en dag efter operationen, upprepa den smärtstillande behandlingen och rådgöra med veterinär personal.

3. Explantation manschetten och halspulsåder

  1. För histologisk analys halspulsåder måste skördas i slutet av observationstiden. Innan du börjar borttagning har att avliva djuret enligt IACUC riktlinjer.
  2. Om manschetten halv skal är avsedda för återanvändning, avlägsna noggrant alla vävnad fragment och den anslutande sutur från plasten element, DISsecting från halspulsåder, tvätta och lagra halv skalen i 70% alkohol lösning. Man bör hålla i minnet att manschetten är inbäddad i bindväv sammanväxningar efter flera veckor av implantation och att man måste dissekera manschetten med försiktighet för att inte skada kärlväggarna.
  3. Alternativt kan manschetten vara uttagna och inbyggda tillsammans med halspulsådern. Plastmaterialet på manschetten är resistent mot normala fixering lösningar och lösningsmedel som används för paraffininbäddning. Dessutom kan den inbyggda prover skäras med en vanlig mikrotom utrustad med normala blad.

4. Representativa resultat

Manschetten måste placeras alltid runt en av de två gemensamma halspulsåder av ett djur (Fig. 1A, 1B) - den kontralaterala sidan fungerar som en kontroll. På bilden presenterar två halva skal av manschetten (Fig. 1B) den koniska formen på inre lumen är synlig. Detta konisk form är viktigt för esprocess för att fastställa tre regioner med olika flödesdynamik. Typisk skjuvspänning mönster som framkallas av den gjutna beräknas från Doppler mätningar 11 och motsvarande hastigheter flödet baserat på faskontrast hastighet MR 12 ges i figur 2.

När manschetten är implanteras i ApoE knockoutmöss matas en västerländsk typ kost den förändrade flödesdynamik provocera shear stress aterosklerotiska plack nedfall (Fig. 3): uppströms koniska sammandragning låga laminärt skjuvspänningen leder till en massiv utveckling av aterosklerotiska plack av mer sårbara fenotyp, som kännetecknas av lipid kärnor nära den centrala lumen som endast omfattas av en tunn fibrös mössa (bild 3A1). Den koniska inre lumen på manschetten leder till en ökning i flödeshastighet. Nästan ingen plack nedfallet observeras på detta område. Direkt nedströms platsen för den flaskhals omedelbar breddning i artären resulterar i ett område med virvlar och oscillerande flow parametrar, som orsakar mindre utbredd plack utvecklingen av en mer stabil fenotyp (dvs mindre fett kärnor som är lokaliserade mer nära till media).

Figur 1
Figur 1 skjuvspänningen modifier - montering och placering (A) Schematisk bild av den implanterade manschetten..: Manschetten placeras runt rättighet som är gemensam halspulsådern (RCCA) - den kontralaterala sidan (LCCA = vänster gemensamma halspulsådern) fungerar som kontroll . (B) in vivo MRI angiografi i en mus: I den högsta nivån projektion av en tredimensionell time-of-flight MR angiografi den koniska förträngning orsakad av rösterna (vit pil) är synlig (för detaljer se 12). (H = huvud, F = fötter, R = höger, L = vänster). I det övre högra hörnet en makroskopisk syn på inre lumen och den yttre ytan på manschetten halv skal ges. När den monteras, två halv skal bildar en konisk cylinder som modifierarflödet dynamiken på fartyget i ett definierat sätt. För att säkerställa rätt passform, serverar ett spår på utsidan av manschetten (gul pil) som vägledande för länkning sutur.

Figur 2
Figur 2. Regioner med olika flödesdynamik och skjuvspänning. Implantation av manschetten förändrar flödesdynamik och därefter skjuvspänning i trånga halspulsådern på ett definierat sätt. I den övre schematisk bild av de olika flytegenskaper anges och den lokala ungefärliga värden för skjuvspänningen ges (baserat på Doppler mätningar 11). Nedan motsvarande flödeshastigheter för ett enskilt djur mätt med MRT före den implanterade manschetten visas i ett T1-viktade tvärsnittsstudier MRI-bild av halsen (faskontrast hastighet avbildning, för detaljer se 12).


Figur 3. Shear stress plack utveckling i ApoE knockoutmöss. Det övre vänstra hörnet visar makroskopiska syn på den öppnade halsen och blottade halspulsåder med en ApoE Knockoutmusens under hög fett (västerländsk typ) diet 8 veckor efter implantation av en skjuvspänning modifierare runt höger gemensamma halspulsådern (RCCA). Den ogenomskinliga vita regionen av fartyget (*) före manschetten motsvarar ett område av stor aterosklerotiska plack nedfall. Den gula pilen visar den tråd som kombinerar de två manschetten halvor. Däremot finns inga tecken av plack nedfall i vänster gemensamma kranskärl (LCCA).
(A) - (C) representant HE färgade tvärsnitt av rätten gemensamma halspulsådern av en ApoE knockout-mus under västerländsk typ kost 8 veckor efter implantation av manschetten. Den schematiska illustration ger motsvarande plan (streckade linjer) where sektionerna fanns. (A) uppströms manschetten ateroskleros leder till massiva plack nedfall. Stora lipid kärnor (röda pilar), som delvis ligger nära den centrala lumen (detalj A1) karakterisera känsliga karaktären av dessa plack. (B) Vid plan manschetten flaskhalsen nästan inga plack utveckling är uppenbar, medan direkt efter manschetten (C) oscillerande flöde leder till måttlig plack utvecklingen av en mer stabil typ (dvs. mindre eller ingen lipid kärnor). (C1, C2 = halv skal av manschetten, P = plack, asterisk = fartyg lumen)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att minimera experimentell variation är det rekommenderat att arbeta med djur på nästan samma ålder och med samma diet historia. En nyligen publicerad undersökning visar att skjuvspänningen modifier tillämpas i wildtype möss kan vara en bra modell för utredning av endoteldysfunktion och tidiga inflammatoriska reaktioner orsakade av förändrad flödesdynamik 13. Men för utredningen av aterosklerotiska plack transgena utveckling hyperlipidemic musmodeller (t.ex. ApoE Knockoutmusens) är obligatoriska. Progression och omfattningen av plack nedfallet i varje musmodell beror på vilken typ av kost. I allmänhet, ju högre kolesterol / fetthalten i kosten, desto snabbare progression av sjukdomen är.

Under manschetten implantation kirurgen ska försöka att minimera vävnadsskador och manipulation, för detta kommer att sänka inflammatoriska reaktioner på grund av skada. Minimera skador är särskilt viktigt närinflammatoriska processer i samband med åderförkalkning är i fokus för studien. För att uppskatta graden av postoperativa inflammationer är det starkt rekommenderat att implantera icke-konstriktiv kontroll muddar i vissa djur. Kontrollen manschetten ska vara en cylinder tillverkad av samma material, men med en kontinuerlig, icke-konstriktiv innerdiameter.

Det är också viktigt att alltid placera manschetten på samma position halspulsådern och att alltid välja samma sida, annars flödeshastigheter är inte reproducerbara. Kirurgen måste ta väl hand om de passar på manschetten vid kombination av de två skalen manschetten halv, eftersom felaktig justering resulterar i en inte lätt bildas koniska inre lumen vilket i sin tur leder till oförutsägbara flödet parametrar.

En stor fördel med skjuvspänningen modifierare är att det skapar tre väl definierade regioner med karakteristiska och reproducerbara mönster av flödeshastigheter inom samma fartyg (Fig. 2, tabell 1). I en hyperlipidemic miljön varje av dessa flödesmönster orsakar plack nedfall av en karakteristisk fenotyp (Fig. 2) som liknar sårbara och stabila plack hos människa.

Således är den presenteras musen halspulsådern manschetten en värdefull in vivo modell för utredning av shear stress plack fenotyper (stabil och instabil). Dessutom kan det också vara en perfekt liten djurmodell för utveckling av nya molekylär avbildning sonder, som avser att tidigt identifiera platser av ateroskleros redan innan gått plack nedfall leder till stenos eller plack spricka, den första händelsen som gav upphov till livshotande kardiovaskulära händelser som blodproppar och hjärtinfarkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Denna studie stöddes delvis av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projekt GZ PI 771/1-1, SFB 656 "Hjärt Molecular Imaging", Münster, Tyskland (projekt C6, Z2, B3 och PM3), EU-NoE "Diagnostiska Molecular Imaging-Dimi "(WP 11,1 och 11,2). Studien har också finansierat en del av den brittiska Heart Foundation, Storbritannien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shear stress modifier (polyetherketone) Promolding BV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  2. Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab. Invest. 85, 9-23 (2005).
  3. Ali, F., Zakkar, M., Karu, K., Lidington, E. A., Hamdulay, S. S., Boyle, J. J., Zloh, M., Bauer, A., Haskard, D. O., Evans, P. C., Mason, J. C. Induction of the cytoprotective enzyme heme oxygenase-1 by statins is enhanced in vascular endothelium exposed to laminar shear stress and impaired by disturbed flow. J. Biol. Chem. 284, 18882-18892 (2009).
  4. Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293, C1824-C1833 (2007).
  5. Zheng, J., Abendschein, D. R., Okamoto, R. J., Yang, D., McCommis, K. S., Misselwitz, B., Gropler, R. J., Tang, D. MRI-based biomechanical imaging: initial study on early plaque progression and vessel remodeling. Magn. Reson. Imaging. 27, 1309-1318 (2009).
  6. Stone, P. H., Coskun, A. U., Kinlay, S., Clark, M. E., Sonka, M., Wahle, A., Ilegbusi, O. J., Yeghiazarians, Y., Popma, J. J., Orav, J., Kuntz, R. E., Feldman, C. L. Effect of endothelial shear stress on the progression of coronary artery disease, vascular remodeling, and in-stent restenosis in humans: in vivo 6-month follow-up study. Circulation. 108, 438-444 (2003).
  7. Pedersen, E. M., Oyre, S., Agerbaek, M., Kristensen, I. B., Ringgaard, S., Boesiger, P., Paaske, W. P. Distribution of early atherosclerotic lesions in the human abdominal aorta correlates with wall shear stresses measured in vivo. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 18, 328-333 (1999).
  8. Buchanan, J. R., Kleinstreuer, C., Truskey, G. A., Lei, M. Relation between non-uniform hemodynamics and sites of altered permeability and lesion growth at the rabbit aorto-celiac junction. Atherosclerosis. 143, 27-40 (1999).
  9. Nam, D., Ni, C. W., Rezvan, A., Suo, J., Budzyn, K., Llanos, A., Harrison, D., Giddens, D., Jo, H. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 1535-1543 (2009).
  10. Cheng, C., van Haperen, R., de Waard, M., van Damme, L. C., Tempel, D., Hanemaaijer, L., van Cappellen, G. W., Bos, J., Slager, C. J., Duncker, D. J., van der Steen, A. F., de Crom, R., Krams, R. Shear stress affects the intracellular distribution of eNOS: direct demonstration by a novel in vivo technique. Blood. 106, 3691-3698 (2005).
  11. Cheng, C., Tempel, D., van Haperen, R., van der Baan, A., Grosveld, F., Daemen, M. J., Krams, R., de Crom, R. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 113, 2744-2753 (2006).
  12. van Bochove, G. S., Straathof, R., Krams, R., Nicolay, K., Strijkers, G. J. MRI-determined carotid artery flow velocities and wall shear stress in a mouse model of vulnerable and stable atherosclerotic plaque. MAGMA. 23, 77-84 (2010).
  13. Cuhlmann, S., Van der Heiden, K., Saliba, D., Tremoleda, J. L., Khalil, M., Zakkar, M., Chaudhury, H., Luong, L. A., Mason, J. C., Udalova, I., Gsell, W., Jones, H., Haskard, D. O., Krams, R., Evans, P. C. Disturbed Blood Flow Induces RelA Expression via c-Jun N-Terminal Kinase 1: A Novel Mode of NF-{kappa}B Regulation That Promotes Arterial Inflammation. Circ. Res. 108, Forthcoming (2011).
Implantation av en Carotid Manschett för att utlösa Sear-stress åderförkalkning hos möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).More

Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter