Summary
تم تحسين ترنسفكأيشن الجينات التي electroporation حوالي مرتين عند تغيير اتجاه الحقل الكهربائي خلال تطبيق النبض ، بينما لا يتأثر بقاء الخلية. ويتسبب في زيادة ترنسفكأيشن الجينات التي تزيد من مساحة الغشاء الذي يتكون المختصة لإدخال الحمض النووي في الخلية.
Abstract
الجينات هي طريقة electrotransfer الفعلية المستخدمة لتقديم الجينات إلى داخل الخلايا من خلال تطبيق نبضات كهربائية قصيرة ومكثفة ، والتي تتسبب في زعزعة الاستقرار في غشاء الخلية ، مما يجعلها قابلة للاختراق إلى جزيئات صغيرة ، وتتيح نقل الجزيئات الكبيرة مثل الحمض الريبي النووي. أنها تمثل بديلا للنواقل الفيروسية ، نظرا لكفاءته ، وسلامة وسهولة التطبيق. لجين electrotransfer تستخدم بروتوكولات مختلفة نبضة كهربائية من أجل تحقيق أقصى قدر من ترنسفكأيشن الجينات ، واحد منهم هو تغيير اتجاه الحقل الكهربائي والتوجه أثناء تسليم النبض. تغيير اتجاه الحقل الكهربائي والتوجه زيادة مساحة غشاء المختصة لإدخال الحمض النووي في الخلية. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح الاختلاف في الجينات electrotransfer فعالية عندما يتم تسليم جميع البقول في الاتجاه نفسه ، وعندما يتم تسليم الحبوب عن طريق تغيير اتجاه بدلا من الحقل الكهربائي والتوجه. لهذا الغرض مع طرف أقطاب متكاملة وعالية الجهد مولد النموذج ، والذي يسمح للتغيير الحقل الكهربائي في اتجاهات مختلفة خلال تطبيق النبضة الكهربائية ، واستخدمت. يتم تحديد الجين electrotransfer فعالية 24H بعد تطبيق نبضة على اعتبار أن عدد الخلايا التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء مقسمة مع عدد جميع الخلايا. وأظهرت النتائج أن يتم زيادة ترنسفكأيشن الجين عند تغيير اتجاه الحقل الكهربائي أثناء الولادة نبض الكهربائية.
Protocol
1. خلية ثقافة ، وإعداد البلازميد العازلة للتجربة
- في هذه التجربة الصينية تستخدم خلايا المبيض الهامستر (CHO - K1). تزرع الخلايا في خليط المغذيات HAM - F12 (PAA) تستكمل مع 2 مم L - الجلوتامين ، و 10 ٪ مصل بقري جنيني ، 400 ميكرولتر / لتر جنتاميسين (كل من شركة محدودة كيمي سيغما الدريخ ، Deisenhofen ، ألمانيا) ، و 1 مل / crystacilin ل (شركة بليفا ، زغرب ، كرواتيا). وتحفظ الخلايا في 37 درجة مئوية في ترطيب الاجواء 5 ٪ CO 2 في حاضنة لل24H.
- تضخيم البلازميد pEGFP - N1 (Clontech المختبرات ، وشركة ماونتن فيو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ترميز البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في سلالة DH5α القولونية وعزلها مع كيت HiSpeed ماكسي البلازميد (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا). وينبغي تركيز بلازميد الحمض النووي (البلازميد الذائبة في المخزن TE) تحدد في 260 نانومتر spectrophotometrically وأكدته هلام إستشراد.
- إعداد isoosmolar العازلة فوسفات الصوديوم (10 ملي نا 2 هبو 4 و 10 ملي ناه 2 ص 4 ، 1 ملم MgCl 2 ، 250 ملي السكروز ، ودرجة الحموضة 7.4).
- في يوم من تجربة إعداد تعليق خلية trypsinization مع 0.25 ٪ التربسين / EDTA الحل (سيغما الدريخ كيمي شركة محدودة ، Deisenhofen ، ألمانيا). خلايا جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 دورة في الدقيقة (180 x ج) في 4 درجات مئوية (سيغما ، ألمانيا) وبيليه في الخلية resuspend isoosmolar الصوديوم العازلة الفوسفات لكثافة خلية من 5 × 10 6 خلية / مل.
2. الأجهزة المعدات
- تتعرض الخلايا إلى الحقل الكهربائي في تلميح ماصة (الشكل 1) مع أقطاب متكاملة متصلة مولد النموذج عالية الجهد. غيض والهندسة الكهربائي يسمح تطبيق الحقل الكهربائي متجانسة نسبيا ، ومولد النبضات يسمح بتسليم الكهربائية في اتجاهات مختلفة. وقد وضعت طرف والمولد في مختبر السبرانيات الأحيائية ، كلية الهندسة الكهربائية ، جامعة ليوبليانا 1.
الشكل 1. الرأسي والأفقي (أ) المقطع العرضي وصورة (ب) من طرف ماصة مع أقطاب كهربائية متكاملة. في اللون الرمادي عبر الباب يستخدم للسكن والبلاستيك السوداء لالأقطاب. غيض ماصة مع أقطاب متكاملة تتكون من أربعة أقطاب قضيب اسطواني. أقطاب كهربائية مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، وقطرها 1.4 ملم ، وأقطاب المجاورة لها 1 ملم وبصرف النظر ، والأقطاب الكهربائية العكس هي 2 ملم إربا. تلتصق الأقطاب في غيض من البلاستيك في موازاة تلك القوانين السارية وطول 30 مم 2.
3. الجينات electrotransfer بروتوكول
- إضافة البلازميد pEGFP - N1 على تعليق خلية في تركيز 10 ميكروغرام / مل.
- احتضان الخليط لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقبل تطبيق نبضات كهربائية.
- يطمح 100 ميكرولتر من التعليق الخلية إلى الحافة ماصة مع أقطاب متكاملة.
- لتحقيق أفضل كفاءة electrotransfer الجينات والمحافظة على سلامة الخلية ، يجب استخدام المعلمات الأمثل للنبضات الكهربائية. في هذه التجربة يتم تطبيقها قطار من 8 البقول مستطيلة (مع كل فترة من 1 مللي ثانية ، والخامس 225 السعة في 1 تكرار التردد هرتز) لكل عينة ، وذلك باستخدام عالية الجهد مولد النموذج. وتستخدم بروتوكولات مختلفة اثنين الحقل الكهربائي (الشكل 2) : في أول بروتوكول يتم تسليم جميع البقول في نفس الاتجاه ، في حين أنه في نبضات البروتوكول الثاني يتم تسليمها عن طريق تغيير اتجاه بدلا من الحقل الكهربائي والتوجه. لا يمكن إلا أن البروتوكول الثاني يمكن استخدامها مع مولد النبض المناسبة ، والتي تسمح بتطبيق نبضات الكهربائية في اتجاهات مختلفة.
- مباشرة بعد تطبيق نبضة نقل الخلايا من طرف ماصة إلى 6 لوحة جيدا وإضافة مصل العجل الجنين (FCS - سيغما ، الولايات المتحدة الأمريكية) (25 ٪ من حجم العينة).
- احتضان خلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية للسماح إعادة عزل خلايا الغشاء.
- إضافة 2 مل من HAM - F12 إلى كل عينة في 6 جيدا واحتضان خلايا 24H عند 37 درجة مئوية في ترطيب الاجواء 5 ٪ CO 2 في الحاضنة.
. الرقم الحقل الكهربائي 2 البروتوكولات : (أ) يتم تسليم جميع البقول في نفس الاتجاه ، يتم تسليم (ب) بدلا من البقول عن طريق تغيير اتجاه الحقل الكهربائي والتوجه.
4. الحصول على الصور وتحديد فعالية الجينات electrotransfer
- يتم تحديد كفاءة الجينات electrotransfer كنسبة مئوية من الخلايا معربا عن GFP 24H بعد تطبيق النبض.
- ويلاحظ في الخلايا باستخدام المجهر مضان (في حالتنا زايس 200 ، Axiovert ، ZR المانيا) مع الإثارة في ضوء 488 نانومتر ولدت مع نظام مستوحد اللون (فازة الرابع ، Visitron ، ألمانيا) ، ويتم الكشف عن الانبعاثات في 507 نانومتر. وتسجل الصور باستخدام التصوير النظام (نظام التصوير MetaMorph ، Visitrويمكن أيضا ، ألمانيا) ، ولكن غيرها من البرامج المماثلة اقتناء استخدامها.
- الحصول على ما لا يقل عن خمس صور (على النقيض المرحلة ومضان أخضر) في التكبير الهدف 20X.
- عدد الخلايا في صورة النقيض من مرحلة والخلايا التي يتم التعبير عن GFP في صورة مضان أخضر. تحديد نسبة نجاعة electrotransfer الجين عن طريق قسمة عدد من الخلايا التي يتم التعبير عن GFP مع عدد من الخلايا في جميع كل صورة المقابلة (الشكل 3).
5. ممثل النتائج :
الشكل 3 ، وتبلغ نسبة الخلايا معربا عن GFP عندما يتم تسليم جميع البقول في الاتجاه نفسه ، وعندما يتم تسليم الحبوب عن طريق تغيير اتجاه بدلا من الحقل الكهربائي ويقدم التوجيه. تعرضت الخلايا لقطار ثمانية البقول مع سعة 225 V ، 1 مللي مدة ووتيرة تكرار 1 هرتز. تم الحصول على النتائج من خلال الفحص المجهري مضان. كل قيمة في الرسم البياني تمثل متوسط ثلاث تجارب مستقلة ± الانحراف المعياري. عن طريق تغيير اتجاه الحقل الكهربائي والتوجه نسبة الخلايا معربا عن زيادات GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجينات هي تقنية electrotransfer تنوعا التكنولوجيا الحيوية التي تمكن من نقل الحمض النووي في الخلايا عن طريق تطبيق قصيرة ، والبقول الكهربائية ذات الجهد العالي (3) وتمثل بديلا آمنا للناقلات فيروسية نظرا لكفاءته ، وسلامة وسهولة التطبيق. على الرغم من أن يستخدم على نطاق واسع اليوم electrotransfer transfect الجيني لجميع أنواع الخلايا ومرحلة التجارب السريرية الأولى التي باستخدام هذا الأسلوب قد تم الإبلاغ عن 4 ، لا تزال الآليات الكامنة غير مفهومة تماما. فمن المعروف ، أن تطبيق نبضات كهربائية من قوة كافية إلى الخلية يسبب زيادة في إمكانات عبر الغشاء ، مما يؤدي الى زعزعة استقرار الغشاء 5. هو زيادة نفاذية غشاء الخلية والجزيئات nonpermeant خلاف دخول الخلية. وقد وصفت العديد من المعالم 6-9 ، والتي تؤثر على فعالية electrotransfer الجينات ، وخصوصا من معلمات تطبيق نبضة مختلفة تمت دراستها بشكل أفضل لتمكين نقل الجينات 10-12. تغيير اتجاه الحقل الكهربائي والتوجه أثناء تسليم نبض يزيد من مساحة ال 13 غشاء الخلية permeabilized بالتالي يزيد منطقة المختصة المتاحة لنقل جزيئات الحمض النووي. وقد تبين أن النسبة المئوية للخلايا التعبير عن الجين المنقول الزيادات عند تغيير اتجاه الحقل الكهربائي والتوجه أثناء التطبيق 14. لهذا الغرض مولد نبض الكهربائية ، والتي تسمح بتطبيق نبضات الكهربائية في اتجاهات مختلفة لابد من استخدام 1. نحن نستخدم مثل مولد النبض وغيض ماصة مع أقطاب متكاملة من أجل إظهار الفرق في فعالية electrotransfer الجينات ، وعندما يتم تسليم جميع البقول في الاتجاه نفسه ، أو عندما يتم تسليم الحبوب عن طريق تغيير اتجاه بدلا من الحقل الكهربائي والتوجه. تم تقييم نسبة الخلايا معربا عن نقل الجينات GFP 24H بعد تطبيق النبض وعندما تزيد من الخلايا transfected بنجاح عندما تم تسليم البقول بدلا من ذلك بتغيير اتجاه الحقل الكهربائي والتوجه (80،8 ٪ معدل البقاء على قيد الحياة STD ± 12 ٪) مقارنة وتم تسليم جميع البقول في نفس الاتجاه (معدل البقاء على قيد الحياة 76 ٪ ± STD 16،2 ٪) التي حصل عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل وكالة أبحاث السلوفينية (مشروع J2 - 9770 ، البنية التحتية للملكية الفكرية ، 0510 مركز وبرنامج P2 - 0249). هذا الفيديو يمثل المواد التكميلية عن "تقنيات Electroporation القاعدة والعلاج" ورشة عمل علمية ودورة الدراسات العليا ، الذي نظمته كلية الهندسة الكهربائية في جامعة ليوبليانا ، سلوفينيا. الكتاب : نشكر أيضا Duša Hodžič لتوفير تتكرم DNA البلازميد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
