Summary
Gen transfectie door elektroporatie is ongeveer twee keer verbeterd wanneer oriëntatie van het elektrisch veld wordt gewijzigd tijdens de puls toepassing, terwijl de levensvatbaarheid van de cellen wordt niet beïnvloed. De toename van de transfectie-gen wordt veroorzaakt door de toename van het membraan gebied dat is gemaakt bevoegd voor DNA binnenkomst in de cel.
Abstract
Gen Electroforetisch is een fysieke methode die wordt gebruikt om genen te leveren in de cellen door het toepassen van korte en intense elektrische pulsen, die destabilisatie van de celmembraan veroorzaken, waardoor het permeabel kleine moleculen en maakt de overdracht van grote moleculen, zoals DNA. Het vertegenwoordigt een alternatief voor de virale vectoren, vanwege de veiligheid, werkzaamheid en het gemak van toepassing. Voor gen Electroforetisch verschillende elektrische puls-protocollen worden gebruikt om een maximale gen transfectie te bereiken, een van hen is het elektrisch veld richting en oriëntatie te veranderen tijdens de puls levering. Wisselend elektrisch veld richting en oriëntatie verhoging van de membraan die bevoegd is voor DNA binnenkomst in de cel. In deze video, tonen we het verschil in genen Electroforetisch werkzaamheid als alle pulsen worden geleverd in dezelfde richting en wanneer pulsen worden geleverd door het veranderen van afwisselend het elektrisch veld richting en oriëntatie. Voor dit doel tip met geïntegreerde elektroden en high-voltage prototype generator, die het mogelijk maakt het veranderen van het elektrisch veld in verschillende richtingen tijdens de elektrische puls applicatie, werden gebruikt. Gene Electroforetisch werkzaamheid is bepaald 24 uur na puls toepassing als het aantal cellen die groen fluorescent eiwit verdeeld met het aantal van alle cellen. De resultaten tonen aan dat gen transfectie wordt verhoogd wanneer het elektrisch veld geaardheid in elektrische puls levering is veranderd.
Protocol
1. Celcultuur, plasmide en buffer voorbereiding voor het experiment
- In dit experiment de Chinese hamster ovarium cellen (CHO-K1) worden gebruikt. Cellen worden gekweekt in een mengsel voedingsstoffen HAM-F12 (PAA) aangevuld met 2 mM L-glutamine, 10% foetaal runderserum, 400 ul / l gentamicine (alle van Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Duitsland), en 1 ml / l crystacilin (Pliva, Zagreb, Kroatië). Cellen worden bewaard bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO 2 atmosfeer in de incubator voor 24u.
- Amplify plasmide pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc, Mountain View, CA, USA) die coderen voor groen fluorescerend eiwit (GFP) in DH5a stam van Escherichia coli en het met HiSpeed Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) te isoleren. Plasmide DNA concentratie (plasmide opgelost in TE-buffer) moet spectrofotometrisch worden bepaald bij 260 nm en is bevestigd door gelelektroforese.
- Bereid isoosmolar natriumfosfaat buffer (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 1 mM MgCl2, 250 mM sucrose, pH 7,4).
- Op de dag van het experiment voor te bereiden celsuspensie door trypsinebehandeling met 0,25% trypsine / EDTA-oplossing (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Duitsland). Centrifuge cellen voor 5 min bij 1000 tpm (180 xg) bij 4 ° C (Sigma, Duitsland) en resuspendeer celpellet in isoosmolar natriumfosfaatbuffer naar een cel dichtheid van 5 × 10 6 cellen / ml.
2. Hardware
- Cellen worden blootgesteld aan elektrische veld in pipetpunt (figuur 1) met geïntegreerde elektroden aangesloten op een high-voltage prototype generator. De tip en elektrode geometrie maakt de toepassing van relatief homogene elektrische veld en de generator kan de levering van elektrische pulsen in verschillende richtingen. De tip en de generator zijn ontwikkeld in Laboratorium voor Biocybernetics, Faculteit Elektrotechniek, Universiteit van Ljubljana 1.
Figuur 1. Verticale en horizontale (a) doorsnede en foto (b), van pipetpunt met geïntegreerde elektroden. In de doorsnede grijze kleur wordt gebruikt voor de kunststof behuizing en zwart voor de elektroden. De pipetpunt met geïntegreerde elektroden bestaat uit vier cilindrische staaf elektroden. De elektroden zijn gemaakt van roestvrij staal, de diameter is 1,4 mm, aangrenzende elektroden uit elkaar 1 mm, en tegenover elektroden zijn 2 mm van elkaar. De elektroden worden gelijmd in de plastic tip parallel en hun bepaling van de lengte is 30 mm 2.
3. Gene Electroforetisch protocol
- Voeg plasmide pEGFP-N1 naar een celsuspensie in de concentratie 10 ug / ml.
- Incubeer dit mengsel 2-3 minuten op kamertemperatuur, voor het aanbrengen van elektrische pulsen.
- Aspire 100 pi celsuspensie in de pipetpunt met geïntegreerde elektroden.
- Om zo goed mogelijk gen Electroforetisch effectiviteit bereiken en te handhaven levensvatbaarheid van de cellen zijn, moeten optimale parameters van elektrische pulsen worden gebruikt. In dit experiment een trein van 8 rechthoekige pulsen (elk met een duur van 1 ms, amplitude 225 V bij 1 Hz herhalingsfrequentie) wordt toegepast op elk monster, met behulp van high-voltage prototype generator. Twee verschillende elektrisch veld protocollen (figuur 2) worden gebruikt: in de eerste protocol alle pulsen worden geleverd in dezelfde richting, terwijl in het tweede protocol pulsen worden geleverd door het veranderen van afwisselend het elektrisch veld richting en oriëntatie. Het tweede protocol kan alleen worden gebruikt met de juiste puls generator, die de toepassing van elektrische pulsen in verschillende richtingen mogelijk maakt.
- Direct na de puls toepassing overdracht van de cellen van pipetpunt in 6 wells plaat en voeg foetaal kalf serum (FCS-Sigma, USA) (25% van het monster volume).
- Incubeer cellen voor 5 min op 37 ° C tot celmembraan opnieuw sluiten mogelijk te maken.
- Voeg 2 ml van de HAM-F12 aan elk monster in 6 goed en incubeer cellen voor 24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO 2 atmosfeer in de incubator.
. Figuur 2 Elektrisch veld protocollen: (a) alle pulsen worden geleverd in dezelfde richting, zijn (b) pulsen die door het veranderen van afwisselend het elektrisch veld richting en oriëntatie.
4. Beeldacquisitie en de bepaling van gen Electroforetisch werkzaamheid
- Werkzaamheid van gen Electroforetisch wordt bepaald als het percentage van de cellen die GFP 24 uur na de puls toepassing.
- De cellen worden waargenomen met behulp van een fluorescentie microscoop (in ons geval Zeiss 200, Axiovert, ZR Duitsland) met excitatie licht bij 488 nm gegenereerd met een monochromator-systeem (polychroom IV, Visitron, Duitsland) en emissie wordt gedetecteerd bij 507 nm. De beelden worden opgenomen met imaging-systeem (Metamorph imaging systeem, Visitrop, Duitsland), maar ook andere soortgelijke acquisitie software kan ook worden gebruikt.
- Te verwerven ten minste vijf beelden (fase contrast en groene fluorescentie) bij 20x vergroting doel.
- Tellen cellen in fase contrastrijk beeld en cellen die GFP uiten in groene fluorescentie beeld. Bepalen van het percentage van gen Electroforetisch werkzaamheid door het aantal cellen die GFP uiten met het aantal van alle cellen in de corresponderende afbeelding (figuur 3).
5. Representatieve resultaten:
Figuur 3. Het percentage van de cellen die GFP als alle pulsen worden geleverd in dezelfde richting en wanneer pulsen worden geleverd door het veranderen van afwisselend het elektrisch veld richting en oriëntatie is gepresenteerd. Cellen werden blootgesteld aan een trein van acht pulsen met amplitude 225 V, duur 1 ms en herhaling frequentie van 1 Hz. Resultaten werden verkregen met behulp van fluorescentie microscopie. Elke waarde in de grafiek vertegenwoordigen gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten ± standaarddeviatie. Door het veranderen van het elektrisch veld richting en oriëntatie van het percentage van de cellen die GFP toeneemt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gen Electroforetisch is een veelzijdige biotechnologie techniek die de overdracht van DNA in cellen in staat stelt door middel van het toepassen van korte, hoge voltage elektrische pulsen 3 en staat voor een veiliger alternatief voor virale vectoren vanwege de veiligheid, werkzaamheid en het gemak van toepassing. Hoewel vandaag de dag gen Electroforetisch wordt op grote schaal gebruikt om alle typen cellen en de eerste fase I klinische studie met deze methode transfecteren is gemeld 4, zijn de onderliggende mechanismen nog steeds niet helemaal begrepen. Het is bekend, dat de toepassing van elektrische pulsen van voldoende sterkte om de cel een toename van de transmembrane potentiaal, die het membraan destabilisatie 5 induceert veroorzaakt. Celmembraan permeabiliteit wordt verhoogd en anders nonpermeant moleculen de cel. Veel parameters zijn beschreven 6-9, die invloed hebben op de effectiviteit van gen Electroforetisch, in het bijzonder de toepassing van verschillende puls parameters werden bestudeerd om beter te genoverdracht 10-12 mogelijk te maken. Veranderen van het elektrisch veld richting en oriëntatie tijdens de puls levering verhoogt het gebied van de gepermeabiliseerde celmembraan 13 verhoogt daardoor bevoegd ruimte beschikbaar is voor de overdracht van DNA-moleculen. Er werd aangetoond, dat het percentage van cellen die overgedragen gen neemt toe als elektrisch veld richting en oriëntatie is gewijzigd tijdens de applicatie 14. Voor dit doel elektrische puls generator, die het mogelijk maakt de toepassing van elektrische pulsen in verschillende richtingen moet worden gebruikt: 1. Wij maken gebruik van een dergelijke puls generator en pipetpunt met geïntegreerde elektroden in om het verschil in gen Electroforetisch werkzaamheid, wanneer alle pulsen worden geleverd in dezelfde richting of wanneer pulsen worden geleverd door het veranderen van afwisselend het elektrisch veld richting en oriëntatie aan te tonen. Het percentage van cellen die overgedragen GFP-gen werd vastgesteld 24u einde van een impuls toepassing en de toename van succes getransfecteerde cellen wanneer de pulsen werden geleverd door het veranderen van afwisselend het elektrisch veld richting en oriëntatie (overleving 80,8% ± std 12%) in vergelijking met toen alle pulsen werden afgeleverd in dezelfde richting (overlevingskans 76% ± std 16,2%) werd verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Sloveense Research Agency (project J2-9770, infrastructurele centrum IP-0510 en programma P2-0249). Deze video is aanvullend materiaal voor de "Elektroporatie-based technologieën en behandelingen 'wetenschappelijke workshop en de postdoctorale opleiding, georganiseerd door de faculteit Elektrotechniek aan de Universiteit van Ljubljana, Slovenië. Auteurs danken ook Dusa Hodzic zo vriendelijk het verstrekken van plasmide DNA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
