Summary
Gene Transfektion durch Elektroporation etwa zwei Mal wird verbessert, wenn Ausrichtung des elektrischen Feldes während der Puls-Anwendung geändert wird, während die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt wird. Der Anstieg in Gentransfektion wird durch die Erhöhung der Membranfläche, die kompetent gemacht für die DNA-Eintritt in die Zelle verursacht wird.
Abstract
Gene Elektrotransfer ist eine physikalische Methode verwendet, um Gene in die Zellen liefern durch die Anwendung von kurzen und intensiven elektrischen Impulsen, die Destabilisierung der Zellmembran führen, wodurch es durchlässig für kleine Moleküle und ermöglicht die Übertragung von großen Molekülen wie DNA. Es stellt eine Alternative zu viralen Vektoren, wegen seiner Sicherheit, Wirksamkeit und einfache Anwendung. Für Gen Elektrotransfer verschiedenen elektrischen Impuls Protokolle verwendet werden, um eine maximale Gentransfektion zu erreichen, einer von ihnen verändert sich das elektrische Feld Richtung und Orientierung während der Impulsabgabe. Ändern elektrische Feld Richtung und Orientierung Erhöhung der Membranfläche zuständig für DNA Eintritt in die Zelle. In diesem Video zeigen wir den Unterschied in der Gen-Elektrotransfer Wirksamkeit, wenn alle Impulse in die gleiche Richtung geliefert werden und Impulse werden von wechselnden alternativ das elektrische Feld Richtung und Orientierung geliefert. Zu diesem Zweck Spitze mit integrierten Elektroden und Hochspannungs-Prototyp-Generator, der Wechsel des elektrischen Feldes in verschiedene Richtungen während der elektrische Impuls-Anwendung ermöglicht, verwendet wurden. Gene Elektrotransfer Wirksamkeit bestimmt 24 Stunden nach dem Puls-Anwendung als die Anzahl der Zellen, die grün fluoreszierendes Protein mit der Anzahl aller Zellen aufgeteilt. Die Ergebnisse zeigen, dass Gen-Transfektion erhöht wird, wenn das elektrische Feld Orientierung während der elektrische Impuls Lieferung geändert wird.
Protocol
1. Zellkultur, Plasmid-und Puffer-Vorbereitung für das Experiment
- In diesem Experiment chinesischen Hamsters (CHO-K1) eingesetzt werden. Die Zellen werden in ein Nährstoff Mischung HAM-F12 (PAA) mit 2 mM L-Glutamin, 10% fötalem Rinderserum, 400 ul / l Gentamycin (alle von Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Deutschland), und 1 ergänzt gewachsen ml / l crystacilin (Pliva, Zagreb, Kroatien). Die Zellen werden bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Atmosphäre in den Inkubator für 24 Stunden gehalten.
- Amplify Plasmid pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, USA) Kodierung grün fluoreszierende Protein (GFP) in DH5a Stamm von Escherichia coli und isolieren mit HiSpeed Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland). Plasmid-DNA-Konzentration (in TE-Puffer aufgelöst Plasmid) sollte spektrophotometrisch bei 260 nm bestimmt und bestätigt werden durch Gelelektrophorese.
- Bereiten isoosmolaren Natriumphosphat-Puffer (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 250 mM Saccharose, pH 7,4).
- Am Tag der Vorbereitung des Experiments Zellsuspension durch Trypsinierung mit 0,25% Trypsin / EDTA-Lösung (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Deutschland). Centrifuge Zellen für 5 min bei 1000 rpm (180 xg) bei 4 ° C (Sigma, Deutschland) und resuspendieren Zellpellet in isoosmolaren Natriumphosphatpuffer auf eine Zelldichte von 5 × 10 6 Zellen / ml.
2. Hardware-Ausstattung
- Zellen sind elektrische Feld in Pipettenspitze (Abbildung 1) mit integrierten Elektroden verbunden mit einem Hochspannungs-Prototyp-Generator ausgesetzt. Die Spitze und Elektrode Geometrie ermöglicht den Einsatz von relativ homogenen elektrischen Feld und der Generator ermöglicht Lieferung von elektrischen Impulsen in verschiedene Richtungen. Die Spitze und der Generator wurden im Labor von Biokybernetik, Fakultät für Elektrotechnik, Universität Ljubljana 1 entwickelt.
Abbildung 1. Vertikale und horizontale (a) Querschnitt und Foto (b) der Pipettenspitze mit integrierten Elektroden. In den Querschnitt graue Farbe wird für die Kunststoff-Gehäuse und schwarz für die Elektroden verwendet. Die Pipettenspitze mit integrierten Elektroden besteht aus vier zylinderförmigen Stab-Elektroden. Die Elektroden sind aus Edelstahl gefertigt, deren Durchmesser 1,4 mm, benachbarten Elektroden sind 1 mm auseinander und gegenüberliegenden Elektroden sind 2 mm voneinander entfernt. Die Elektroden werden in die Kunststoff-Spitze parallel verleimt und gegebenenfalls deren Länge beträgt 30 mm 2.
3. Gene Elektrotransfer Protokoll
- Add-Plasmid pEGFP-N1 eine Zellsuspension in einer Konzentration 10 pg / ml.
- Inkubieren Sie die Mischung für 2-3 Minuten bei Raumtemperatur, bevor elektrische Impulse.
- Aspire 100 ul Zellsuspension in die Pipettenspitze mit integrierten Elektroden.
- Um beste Gen Elektrotransfer Wirksamkeit erzielen und beizubehalten Lebensfähigkeit der Zellen, sollten die optimalen Parameter der elektrischen Impulse genutzt werden. In diesem Experiment ein Zug von 8 Rechteckimpulse (jeweils mit einer Dauer von 1 ms, Amplitude 225 V bei 1 Hz Wiederholfrequenz) ist zu jeder Probe aufgetragen, mit Hochspannungs-Prototyp-Generator. Zwei verschiedene elektrische Feld Protokolle (Abbildung 2) verwendet werden: in das erste Protokoll alle Impulse werden in die gleiche Richtung geliefert, während in dem zweiten Protokoll Impulse, indem alternativ das elektrische Feld Richtung und Orientierung geliefert werden. Das zweite Protokoll kann nur mit entsprechendem Impulsgeber, die Anwendung der elektrischen Impulse in verschiedene Richtungen ermöglicht werden.
- Direkt nach dem Puls-Anwendung übertragen die Zellen aus Pipettenspitze in 6-Well-Platte und stell fötalem Kälberserum (FCS-Sigma, USA) (25% des Probenvolumens).
- Inkubieren Zellen für 5 min bei 37 ° C, damit Zellmembran Wiederverschließen.
- 2 ml HAM-F12 zu jeder Probe in 6 gut und inkubieren Zellen für 24 Stunden bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Atmosphäre in den Inkubator.
. Abbildung 2 Elektrisches Feld Protokolle: (a) alle Impulse werden in die gleiche Richtung geliefert, (b) Impulse, indem alternativ das elektrische Feld Richtung und Orientierung geliefert.
4. Bildaufnahme und Bestimmung von Gen Elektrotransfer Wirksamkeit
- Die Wirksamkeit von Gen Elektrotransfer ist als der Prozentsatz von Zellen, die GFP 24h nach dem Puls Anwendung bestimmt.
- Die Zellen werden beobachtet mit einem Fluoreszenzmikroskop (in unserem Fall Zeiss 200, Axiovert, ZR Deutschland) mit Anregungslicht bei 488 nm mit einem Monochromator-System (Polychrome IV, Visitron, Deutschland) und Emission bei 507 nm detektiert generiert. Die Bilder werden aufgezeichnet mit bildgebenden Systems (MetaMorph Imaging-System, Visitrauf, Deutschland), aber auch andere ähnliche Software zur Erfassung kann ebenfalls verwendet werden.
- Erwerben Sie mindestens fünf Bilder (Phasenkontrast und grüne Fluoreszenz) bei 20x Objektiv-Vergrößerung.
- Zählen von Zellen in der Phase kontrastreiches Bild und Zellen, die GFP sind in grüne Fluoreszenz Bild. Bestimmen Sie den Prozentsatz der Gen Elektrotransfer Wirksamkeit, indem die Anzahl von Zellen, die GFP mit der Anzahl aller Zellen in jeder entsprechende Bild (Abbildung 3).
5. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 3. Der Prozentsatz an Zellen, die GFP, wenn alle Impulse in die gleiche Richtung geliefert werden und Impulse werden von wechselnden alternativ das elektrische Feld Richtung und Orientierung vorgelegt wird geliefert. Die Zellen wurden zu einem Zug von acht Impulsen mit einer Amplitude von 225 V, Dauer 1 ms und Wiederholung Frequenz von 1 Hz ausgesetzt. Die Ergebnisse wurden mittels Fluoreszenz-Mikroskopie erhalten. Jeder Wert in der Grafik stellen Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung. Durch die Veränderung des elektrischen Feldes Richtung und Orientierung der Anteil der Zellen, die GFP erhöht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gene Elektrotransfer ist eine vielseitige Technik, Biotechnologie Transfer von DNA in Zellen ermöglicht durch Anwendung kurz-, Hochspannungs-elektrische Impulse 3 und stellt eine sichere Alternative zu viralen Vektoren aufgrund ihrer Sicherheit, Wirksamkeit und einfache Anwendung. Obwohl heute Gen Elektrotransfer weit verbreitet ist, um alle Arten von Zellen und erste klinische Phase I Studie mit dieser Methode transfizieren wurde 4 berichtet, sind die zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht vollständig verstanden. Es ist bekannt, dass die Anwendung der elektrischen Impulse von ausreichender Stärke, um die Zelle eine Erhöhung der transmembrane Potential, das die Membran Destabilisierung 5 induziert Ursachen. Permeabilität der Zellmembran erhöht und sonst nonpermeant Moleküle in die Zelle eindringen. Viele Parameter wurden 6-9 beschrieben, die Einfluss auf die Wirksamkeit von Gen Elektrotransfer, insbesondere Anwendung verschiedener Pulsparameter wurden untersucht, um eine bessere Gentransfer 10-12 ermöglichen. Ändern des elektrischen Feldes Richtung und Orientierung während der Impulsabgabe erhöht die Fläche des permeabilisierten Zelle Membran 13 erhöht somit zuständige Bereich für die Übertragung von DNA-Molekülen. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil der Zellen, die übertragene Gen, wenn elektrische Feld Richtung und Orientierung während der Anwendung 14 geändert wird erhöht. Zu diesem Zweck elektrischen Impulsgeber, die Anwendung der elektrischen Impulse in verschiedene Richtungen hat 1 verwendet werden können. Wir verwenden solche Impulsgeber und Pipettenspitze mit integrierten Elektroden, um den Unterschied in der Gen-Elektrotransfer Wirksamkeit, wenn alle Impulse in die gleiche Richtung geliefert werden oder wenn Impulse werden von wechselnden alternativ das elektrische Feld Richtung und Orientierung geliefert zu demonstrieren. Der prozentuale Anteil von Zellen, die GFP-Gen übertragen wurde beurteilt 24h und nach Pulsapplikation die Erhöhung der erfolgreich transfizierten Zellen, wenn die Impulse, indem alternativ das elektrische Feld Richtung und Orientierung (Überlebensrate 80,8% ± std 12%) wurden im Vergleich geliefert, wenn alle Impulse wurden in die gleiche Richtung geliefert (Überlebensrate 76% ± std 16,2%) erhalten wurde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der slowenischen Research Agency (Projekt J2-9770, infrastrukturelle Zentrum IP-0510 und das Programm P2-0249) unterstützt. Dieses Video stellt ergänzendes Material für die "Elektroporation basierenden Technologien und Behandlungsmethoden" wissenschaftlichen Workshop und Aufbaustudium, von der Fakultät für Elektrotechnik an der University of Ljubljana, Slowenien organisiert. Autoren danken auch Duša Hodzic für die freundliche Bereitstellung Plasmid-DNA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
