Summary
Trasfezione genica mediante elettroporazione è migliorato di circa due volte quando l'orientamento del campo elettrico viene modificato durante l'applicazione di impulsi, mentre la vitalità cellulare non è interessato. L'aumento della transfezione genetica è causata dalla crescita dell'area membrana che è competente per l'ingresso del DNA nella cellula.
Abstract
Gene electrotransfer è un metodo fisico usati per fornire i geni nelle cellule mediante l'applicazione di impulsi elettrici brevi e intensi, che causano destabilizzazione della membrana cellulare, rendendo permeabili a molecole piccole e permette il trasferimento di grandi molecole come il DNA. Rappresenta un'alternativa ai vettori virali, grazie alla sua sicurezza, efficacia e facilità di applicazione. Per gene electrotransfer diversi protocolli di impulsi elettrici vengono utilizzati al fine di ottenere il massimo transfezione genica, uno di loro sta cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento durante la consegna degli impulsi. Cambio di direzione del campo elettrico e l'orientamento aumentare la superficie della membrana competente per l'ingresso del DNA nella cellula. In questo video, dimostriamo la differenza di efficacia gene electrotransfer quando tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione e quando gli impulsi vengono consegnati alternativamente cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento. A questo scopo punta con elettrodi integrati e ad alta tensione prototipo di generatore, che permette di cambiare di campo elettrico in diverse direzioni durante l'applicazione di impulsi elettrici, sono stati utilizzati. Gene efficacia electrotransfer è determinato 24 ore dopo l'applicazione di impulsi come il numero di cellule che esprimono la proteina fluorescente verde divisa con il numero di tutte le cellule. I risultati mostrano che la transfezione genica è aumentata quando l'orientamento del campo elettrico durante la consegna degli impulsi elettrici è cambiato.
Protocol
1. Coltura cellulare, il plasmide e la preparazione del buffer per l'esperimento
- In questo esperimento le cellule ovariche di criceto cinese (CHO-K1) sono utilizzati. Le cellule sono coltivate in una miscela di nutrienti HAM-F12 (PAA) integrato con 2 mM di L-glutamina, 10% di siero fetale bovino, 400 microlitri / l gentamicina (tutti da Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Germania), e 1 ml / l crystacilin (Pliva, Zagabria, Croazia). Le cellule sono conservate a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 nell'atmosfera nell'incubatrice per 24 ore.
- Amplificare plasmide pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, USA) che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) in DH5α ceppo di Escherichia coli e isolare con HiSpeed plasmidi Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Germania). Concentrazione di DNA plasmide (plasmide disciolti in tampone TE) dovrebbe essere determinata spettrofotometricamente a 260 nm e confermato mediante elettroforesi su gel.
- Preparare isoosmolar tampone fosfato di sodio (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 1 mM MgCl2, 250 mM saccarosio, pH 7,4).
- Il giorno di esperimento preparare sospensione cellulare da tripsinizzazione con il 0,25% tripsina / EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Germania). Centrifugare le cellule per 5 min a 1000 rpm (180 xg) a 4 ° C (Sigma, Germania) e risospendere pellet di cellule in tampone isoosmolar fosfato di sodio per una densità cellulare di 5 × 10 6 cellule / ml.
2. Dotazione hardware
- Le cellule sono esposte a campo elettrico in puntale (Figura 1) con elettrodi integrata collegata ad un generatore ad alta tensione prototipo. La punta e la geometria di elettrodi permette l'applicazione della relativa omogeneità di campo elettrico e il generatore permette la consegna di impulsi elettrici in direzioni diverse. La punta e il generatore sono stati sviluppati presso il Laboratorio di Biocybernetics, Facoltà di Ingegneria Elettrica, Università di Lubiana 1.
Figura 1. Verticale e orizzontale (a), sezione fotografia e (b), della punta della pipetta con elettrodi integrati. Nella sezione colore grigio è utilizzato per la custodia in plastica e nero per gli elettrodi. La punta della pipetta con elettrodi integrato è costituito da quattro elettrodi barra cilindrica. Gli elettrodi sono in acciaio inox, il loro diametro è di 1,4 mm, elettrodi adiacenti sono 1 mm l'una dall'altra, e gli elettrodi opposti sono 2 mm. Gli elettrodi sono incollate in punta di plastica in parallelo e la loro lunghezza applicabile è di 30 mm 2.
3. Gene electrotransfer protocollo
- Aggiungi plasmide pEGFP-N1 ad una sospensione di cellule in concentrazione di 10 mcg / ml.
- Incubare la miscela per 2-3 minuti a temperatura ambiente, prima di applicare gli impulsi elettrici.
- Aspire 100 l di sospensione cellulare in la punta della pipetta con elettrodi integrati.
- Per ottenere il miglior efficacia electrotransfer genica e mantenere la vitalità cellulare, i parametri ottimali di impulsi elettrici devono essere utilizzati. In questo esperimento un treno di 8 impulsi rettangolari (ciascuno con durata di 1 ms, ampiezza 225 V a 1 Hz, frequenza di ripetizione) è applicato a ciascun campione, utilizzando ad alta tensione del generatore prototipo. Due differenti protocolli di campo elettrico (Figura 2) sono utilizzati: in primo protocollo tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione, mentre nel secondo protocollo impulsi vengono consegnati cambiando alternativamente la direzione del campo elettrico e l'orientamento. Il secondo protocollo può essere utilizzato solo con generatore di impulsi appropriati, che consente l'applicazione di impulsi elettrici in direzioni diverse.
- Immediatamente dopo l'applicazione di impulsi trasferimento alle cellule di puntale in 6 pozzetti e aggiungere siero fetale bovino (FCS-Sigma, USA) (25% del volume del campione).
- Incubare le cellule per 5 minuti a 37 ° C per consentire una nuova chiusura della membrana cellulare.
- Aggiungere 2 ml di HAM-F12 per ogni campione in 6 bene e incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 nell'atmosfera nell'incubatrice.
. Figura 2 protocolli di campo elettrico: (a) tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione, (b) gli impulsi vengono consegnati alternativamente cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento.
4. Acquisizione di immagini e la determinazione di efficacia gene electrotransfer
- L'efficacia del gene electrotransfer è determinato come percentuale di cellule che esprimono GFP 24 ore dopo l'applicazione di impulsi.
- Le cellule sono osservati utilizzando un microscopio a fluorescenza (nel nostro caso Zeiss 200, Axiovert, ZR Germania) con luce di eccitazione a 488 nm generata con un sistema monocromatore (policromia IV, Visitron, Germania) e di emissione è rilevata a 507 nm. Le immagini vengono registrate con sistema di imaging (MetaMorph sistema di imaging, Visitrsu, Germania), ma altri software di acquisizione simili possono anche essere utilizzati.
- Acquisire almeno cinque immagini (contrasto di fase e fluorescenza verde) a 20x obiettivo.
- Contare le celle in immagini a contrasto di fase e le cellule che esprimono GFP in verde immagine fluorescenza. Determinare la percentuale di efficacia gene electrotransfer dividendo il numero di cellule che esprimono GFP con il numero di tutte le cellule in ogni immagine corrispondente (Figura 3).
5. Rappresentante dei risultati:
Figura 3. La percentuale di cellule che esprimono GFP, quando tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione e quando gli impulsi vengono consegnati alternativamente cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento è presentato. Cellule sono state esposte ad un treno di otto impulsi di ampiezza 225 V, durata 1 ms e frequenza di ripetizione di 1 Hz. Risultati sono stati ottenuti mediante microscopia a fluorescenza. Ogni valore nel grafico rappresentano media di tre esperimenti indipendenti ± deviazione standard. Cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento della percentuale di cellule che esprimono GFP aumenta.
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Discussion
Gene electrotransfer è una tecnica biotecnologica versatile che consente il trasferimento del DNA nelle cellule mediante l'applicazione di brevi impulsi elettrici ad alta tensione 3 e rappresenta una alternativa più sicura di vettori virali per la sua sicurezza, efficacia e facilità di applicazione. Anche se gene electrotransfer oggi è ampiamente utilizzata per trasfettare tutti i tipi di cellule e prima fase io studio clinico con questo metodo è stato segnalato 4, i meccanismi alla base non sono ancora completamente compresi. E 'noto, che l'applicazione di impulsi elettrici di sufficiente resistenza alla cellula provoca un aumento del potenziale transmembrana, che induce la destabilizzazione della membrana 5. Permeabilità della membrana cellulare è aumentato e le molecole altrimenti nonpermeant entrare nella cellula. Molti parametri sono stati descritti 6-9, che influenzano l'efficacia del gene electrotransfer, in particolare l'applicazione dei parametri di impulsi diversi sono stati studiati per consentire un trasferimento genico meglio 10-12. Cambiare la direzione del campo elettrico e l'orientamento al momento della consegna degli impulsi aumenta l'area dei 13 cellulari permeabilizzate membrana aumenta quindi zona competente a disposizione per il trasferimento di molecole di DNA. E 'stato dimostrato, che la percentuale di cellule che esprimono gene trasferito aumenta quando la direzione del campo elettrico e l'orientamento è cambiato durante l'applicazione 14. A questo scopo generatore di impulsi elettrici, che permette l'applicazione di impulsi elettrici in diverse direzioni deve essere utilizzato a 1. Ci sono such Uso del Generatore di impulsi e la punta della pipetta con elettrodi integrati al fine di dimostrare la differenza di efficacia gene electrotransfer, quando tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione o quando gli impulsi vengono consegnati alternativamente cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento. La percentuale di cellule che esprimono trasferiti gene GFP è stata valutata 24 ore dopo l'applicazione di impulsi e l'aumento delle cellule transfettate con successo quando gli impulsi sono stati consegnati cambiando alternativamente la direzione del campo elettrico e l'orientamento (tasso di sopravvivenza 80,8% ± std 12%) in confronto quando tutti gli impulsi sono stati consegnati nella stessa direzione (tasso di sopravvivenza del 76% ± std 16,2%) è stato ottenuto.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agenzia di ricerca sloveno (progetto J2-9770, IP-0510 centro infrastrutturali e programma P2-0249). Questo video rappresenta materiale supplementare per il "Elettroporazione basato Tecnologie e Trattamenti" laboratorio scientifico e corso post-laurea, organizzato dalla Facoltà di Ingegneria Elettrica presso l'Università di Lubiana, Slovenia. Autori ringraziano anche Dusa Hodzic per la gentile fornitura del DNA plasmidico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
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