Summary
細胞の生存率には影響されていない間の電界の向きは、パルス印加中に変更されたときにエレクトロポレーションによる遺伝子導入は、約2倍に向上しています。遺伝子導入の増加は、細胞へのDNAのエントリのための有能な作られている膜面積の増加によって引き起こされる。
Abstract
遺伝子electrotransferは小分子には、透過性化、細胞膜の不安定化を引き起こす短いし、強烈な電気パルスのアプリケーションによって細胞に遺伝子を提供するために使用される物理的な方法であり、DNAのような大きな分子の転送が可能になります。それは、その安全性、有効性と適用の容易さに起因するウイルスベクターに代わるものを、表します。遺伝子electrotransfer異なる電気パルスプロトコルは最大の遺伝子のトランスフェクションを達成するために使用されているため、そのうちの一つは、パルスの配信中に電界の方向と向きを変えている。電界の方向と向きを変更すると、細胞へのDNAのエントリのための有能な膜面積を増加させる。このビデオでは、我々はすべてのパルスが同じ方向に配信されると、パルスが交互に電界の方向と向きを変えることによって配信される際に遺伝子のelectrotransferの効果の違いを示しています。統合された電極と電気パルス印加時に別の方向に電界が変化することができる高電圧プロトタイプジェネレータ、とこの目的のためのヒントについては、使用されていました。遺伝子electrotransferの有効性は、すべてのセルの数で割った値、緑色蛍光タンパク質を発現する細胞の数などのパルス印加後24時間に決定されます。結果は、電気パルスの配信時の電界の向きが変更されたときに遺伝子導入が増加することを示している。
Protocol
1。細胞培養、プラスミドおよび実験用バッファの準備
- この実験ではチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO - K1）を使用しています。細胞は栄養混合2mMのL -グルタミン、10％ウシ胎児血清、400μlの/ lのゲンタマイシン（Sigma - Aldrich社ビックケミー社、Deisenhofenからすべて、ドイツ）、及び1 / mlの補足HAM - F12（PAA）で栽培されていますリットルcrystacilin（Pliva、ザグレブ、クロアチア）。細胞を37 24のためのインキュベーターで、加湿5％CO 2雰囲気中で℃で保存されています。
- 増幅プラスミドpEGFP - N1（クロンテックラボラトリーズ社、マウンテンビュー、CA、米国）大腸菌のDH5α株に緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードし、ハイスピードプラスミドマキシキット（キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）でそれを分離する。プラスミドDNAの濃度は、（TE緩衝液にプラスミドを溶解）分光測光法260 nmで測定し、ゲル電気泳動によって確認されるべきである。
- isoosmolarリン酸ナトリウム緩衝液（10 mMののNa 2 HPO 4、10mMののNaH 2 PO 4、1mMのMgCl 2、250mMスクロース、pH7.4）を準備します。
- 実験日に0.25％トリプシン/ EDTA溶液（Sigma - Aldrich社ビックケミー社、Deisenhofen、ドイツ）でトリプシン処理により細胞懸濁液を準備する。 4℃で1000rpm（180 × g）で5分間の遠心細胞° C（Sigma社、ドイツ）と5の細胞密度× 10 6細胞/ mlにisoosmolarリン酸ナトリウム緩衝液に再懸細胞ペレット。
2。ハードウェア機器
- 細胞は、高電圧プロトタイプ発生器に接続された集積電極をピペットチップに電界（図1）にさらされている。先端と電極の形状は比較的均一な電界を印加することができ、発電機は、異なる方向に電気パルスの配信が可能になります。先端と発電機は、リュブリャナ大学1、電気工学部、バイオサイバネティクスの研究室で開発されました。
図1（b）に統合された電極を有するピペットチップの垂直方向と水平方向（）断面と写真。断面のグレー色で電極用プラスチック製ハウジングと黒のために使用されます。統合された電極を有するピペットの先端には4つの円筒状のロッド電極から構成されています。電極はステンレス鋼から成っている、その直径は1.4 mmである、隣接する電極の間隔は1ミリメートルであり、そして反対側の電極が離れて2ミリメートルです。電極を並列にプラスチック製の先端に接着し、その該当する長さは30mm 2であるされています。
3。遺伝子electrotransferプロトコル
- 濃度10μg/ mlの中の細胞懸濁液にプラスミドpEGFP - N1を追加。
- 電気パルスを適用する前に、室温で2〜3分間混合物をインキュベートする。
- アスパイア統合された電極を有するピペットチップへの細胞懸濁液100μl。
- 最高の遺伝子electrotransferの有効性を達成し、細胞の生存を維持するために、電気パルスの最適なパラメータを使用する必要があります。この実験では、8の矩形パルス（1ミリ秒、1Hzの繰り返し周波数での振幅225 Vの持続時間と各）の列車は、高電圧プロトタイプのジェネレータを使用して、各サンプルに適用されます。二つの異なる電界のプロトコルは、（図2）が使用されています：第2のプロトコルパルスの代わりに電界の方向と向きを変えることによって配信されるのに対し、最初のプロトコルで、すべてのパルスは、同じ方向に配信されます。二番目のプロトコルは、異なる方向に電気パルスのアプリケーションを可能にする適切なパルス発生器、を使用することができます。
- 直ちにパルス印加後、6ウェルプレートにピペットの先端から細胞を転送し、ウシ胎児血清（FCS - Sigma、米国）（サンプルの体積の25％）を追加します。
- 37℃で5分間細胞をインキュベート° C細胞膜の再シール性を可能にする。
- よく6で各サンプルにHAM - F12の2 mlを加えインキュベーターで、加湿5％CO 2雰囲気で37℃24時間のための細胞℃でインキュベートする。
図2電界プロトコル：（a）すべてのパルスが同じ方向に配信されるが、（b）のパルスが交互に電界の方向と向きを変えることによって配信されます。
4。画像収集と遺伝子electrotransferの有効性の判定
- 遺伝子electrotransferの有効性は、パルス印加後にGFPの24を発現する細胞の割合として決定されます。
- 細胞は、モノクロメーターシステム（ポリクロームIV、Visitron、ドイツ）と発光は507 nmで検出されると生成される488 nmで励起光を（私たちの場合はツァイス200、Axiovert、ZRドイツ）蛍光顕微鏡を用いて観察している。画像は、撮像システム（MetaMorphイメージングシステム、Visitrを使用して記録されます。で、ドイツ）が、他の同じような買収のソフトウェアを使用することもできます。
- 20倍対物レンズの倍率で少なくとも5枚の画像を（位相コントラストおよび緑色蛍光）を取得。
- 位相コントラスト画像と緑色蛍光画像でGFPを発現している細胞では細胞を数える。それぞれ対応するイメージ内のすべてのセルの数（図3）でGFPを発現している細胞の数を割ることによって遺伝子のelectrotransferの有効性の割合を決定します。
5。代表的な結果：
図3。すべてのパルスが同じ方向に配信されると、パルスが交互に電界方向を変えると方向が提示されることによって配信されたときにときにGFPを発現する細胞の割合。細胞は、振幅225 V、持続時間1ミリ秒と1 Hzの繰り返し周波数で8パルスのパルス列にさらされた。結果は、蛍光顕微鏡によって得られた。グラフ内の各値は、3つの独立した実験±標準偏差の平均を表しています。電界の方向と向きGFPの増加を発現する細胞の割合を変化させることにより。
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Discussion
遺伝子electrotransferは短く、高電圧電気パルス3を適用することにより、細胞へのDNAの転送を可能にし、その安全性、有効性およびアプリケーションの容易さのためのウイルスベクターの安全な代替を表す汎用性の高いバイオ技術です。今日遺伝子electrotransferが広く4報告されているこの方法を用いて細胞と第一段階のすべてのタイプI臨床試験をトランスフェクトするために使用されていますが、根本的なメカニズムはまだ完全に理解されていない。それは、細胞に十分な強度の電気パルスのアプリケーションは、膜の不安定化5を誘導する膜電位の増加を引き起こすことが、知られています。細胞膜の透過性が増加し、そうでなければnonpermeant分子は、細胞を入力してください。多くのパラメータは、遺伝子electrotransferの有効性に影響を与える6-9を 、記載されており、特に別のパルスパラメータのアプリケーションは、より良い遺伝子導入10月12日を有効にするために検討した。パルスの配信中に電界の方向と向きを変更すると、DNA分子の転送に利用可能な有能な面積を増加させるため、透過性に細胞膜13の面積を増加させる。それは、電界の方向と向きがアプリケーション14の間に変更されたときに導入遺伝子を発現する細胞の割合が増加すること、が示された。異なる方向に電気パルスのアプリケーションを可能にするこの目的のための電気パルス発生器、の場合は1を使用する必要があります。我々は、すべてのパルスが同じ方向に配信されるかのパルスを交互に電界の方向と向きを変えることによって配信される際に遺伝子のelectrotransferの効果の違いを、実証するために統合された電極を有するこのようなパルス発生器とピペットチップを使用しています。転送されたGFP遺伝子を発現する細胞の割合は、パルス印加後24時間を評価し、時と比較してパルスが交互に電界方向を変更することにより、配信された時には正常にトランスフェクトされた細胞の増加と配向性（生存率80,8％± STD 12％）したすべてのパルスが同じ方向に納入された（生存率76パーセント± STD 16,2％）を得た。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、スロベニアの研究機関（プロジェクトJ2 - 9770、インフラセンターIP - 0510とプログラムP2 - 0249）によってサポートされていました。このビデオでは、"エレクトロポレーションベースの技術と治療"リュブリャナ、スロベニアの大学で電気工学の学部が主催する科学的なワークショップや大学院のコースのための補助教材を表します。著者は、親切にプラスミドDNAを提供するためにもDušaホジッに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
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