Summary
전기장의 방향이 펄스 응용 프로그램 중에 변경되면 electroporation에 의해 유전자 transfection이 약 두 배 향상이며, 동시에 세포 생존 능력은 영향을받지 않습니다. 유전자 transfection의 증가는 세포로 DNA의 항목에 대해 관할 만들어 막 면적의 증가로 인해 발생할 수 있습니다.
Abstract
진 electrotransfer 작은 분자로 그 침투성하고, 세포막의 불안정의 원인이 짧고 강렬한 전기 펄스의 응용 프로그램에 의해 세포에 유전자를 전달하기 위해 사용하는 물리적 방법이고 이러한 DNA와 같은 큰 분자의 전송을 허용합니다. 이것은 안전성, 효능 및 응용 프로그램의 용이성으로 인해 바이러스 벡터에 대한 대안을 나타냅니다. 유전자 electrotransfer에 대해 다른 전기 펄스 프로토콜은 그 중 하나가 펄스 전송 중에 전기장 방향과 방향을 변화, 최대 유전자 transfection을 달성하기 위해 사용됩니다. 전기장 방향과 방향을 변경하면 세포에 DNA 항목에 대한 관할 멤브레인 영역을 향상시킬 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 모든 펄스가 같은 방향으로 전달되며 펄스가 또는 전기장의 방향과 방향을 변경하여 전달하는 경우 유전자 electrotransfer의 효율에 차이를 보여줍니다. 통합 전극과 전기 펄스 응용 프로그램을하는 동안 다른 방향으로 전기장의 변화를 수있는 고전압 프로토 타입 생성기,이 목적 팁 경우, 사용되었습니다. 진 electrotransfer의 효험은 모든 세포의 숫자로 나눈 녹색 형광 단백질을 표현 세포의 숫자와 같은 펄스 신청 후 24 시간 결정됩니다. 결과는 전기 펄스 전송 중에 전기장의 방향이 바뀌면 유전자 transfection이 증가는 것을 보여줍니다.
Protocol
1. 세포 배양, 플라스미드 및 실험을위한 버퍼 준비
- 본 실험 중국 햄스터 난소 세포는 (CHO - K1) 사용됩니다. 셀 2 MM L - 글루타민 10 % 태아 소 혈청, 400 μl / L gentamicin (시그마 - 알드리치 케미 GmbH를, Deisenhofen, 독일에서), 그리고 1 보충 영양 혼합 햄 - F12 (PAA)에 재배 ML / 리터 crystacilin (Pliva, 자그레브, 크로아티아). 전지는 37 24에 대한 보육의 humidified 5 % CO 2 분위기 ° C에 보관됩니다.
- 확대 플라스미드 pEGFP - N1 (Clontech Laboratories의 주식, 마운틴 뷰, CA, 미국) 대장균 DH5α의 변형에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩 및 HiSpeed 플라스미드 맥시 키트 (Qiagen, 힐든, 독일)로 분리. 플라스미드 DNA의 농도는 (TE 버퍼에 용해 플라스미드) spectrophotometrically 260 nm의에서 결정하여 겔 전기 영동으로 확인한다.
- isoosmolar 나트륨 인산 버퍼 (10 MM 나 2 HPO 4, 10 MM 아니 2 PO 4, 1 ㎜ MgCl 2, 250 MM의 자당, 산도 7.4) 준비합니다.
- 실험 당일 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 (시그마 - 알드리치 케미 GmbH를, Deisenhofen, 독일)과 trypsinization하여 세포 현탁액을 준비합니다. 4 1,000 RPM (180 XG)에서 5 분 원심 분리기 세포 ° C (시그마, 독일)와 5 세포 밀도 × 10 6 세포 / ML에 isoosmolar 인산 나트륨 버퍼에 resuspend 세포 펠릿.
2. 하드웨어 장비
- 전지는 높은 전압 프로토 타입 발전기에 연결된 통합 전극과 피펫 팁의 전기장 (그림 1)에 노출되어 있습니다. 팁 및 전극 기하학은 비교적 균일한 전기장의 응용 프로그램을 허용하고 발전기가 다른 방향으로 전기 펄스의 전달을 허용합니다. 팁 및 발전기는 Biocybernetics의 연구소, 전기 공학부, 류블랴나 1 대학에서 개발되었다.
그림 1. 수직 및 수평 (A) 단면 및 사진 (b)는 통합 전극과 피펫 팁의. 단면 회색 색상의 전극에 대한 플라스틱 하우징 및 검정에 사용됩니다. 통합 전극과 피펫 팁 네 원통형 막대 전극으로 구성되어 있습니다. 전극은 스테인리스 스틸로 만들어진, 자신의 직경은 인접한 전극의 간격 1mm이며, 반대 전극의 간격 2mm 있으며, 1.4 mm이다. 전극은 병렬로 플라스틱 끝에 접착하고 해당 길이는 30mm 2입니다.
3. 진 electrotransfer 프로토콜
- 농도 10 μg / ML에 세포 현탁액에 플라스미드 pEGFP - N1을 추가합니다.
- 전기 펄스를 적용하기 전에, 상온에서 2~3분에 대한 혼합물을 품어.
- 통합 전극과 피펫 팁에 세포 현탁액의 바램이 100 μl.
- 최고의 유전자 electrotransfer의 효율을 달성하고 세포 생존을 유지하기 위해 전기 펄스의 최적의 매개 변수를 사용해야합니다. 이 실험에 8 직사각형 펄스 (각 1 Hz에서 반복 주파수 1 MS, 진폭 225 V의 기간과)의 기차는 고전압 프로토 타입 생성기를 사용하여 각 샘플에 적용됩니다. 두 개의 서로 다른 전기장 프로토콜은 (그림 2) 사용 : 두 번째 프로토콜 펄스에서 또는 전기장의 방향과 방향을 변경하여 전달됩니다 반면 첫 번째 프로토콜의 모든 펄스는 같은 방향으로 전달됩니다. 두 번째 프로토콜은 서로 다른 방향으로 전기 펄스의 응용 프로그램을 허용 적절한 펄스 발생기와 함께 사용할 수 있습니다.
- 펄스 응용 프로그램은 6 자 플레이트에 피펫 팁의 세포를 전송 및 태아 송아지 혈청 (FCS - 시그마, 미국) (샘플 볼륨의 25 %) 추가 직후.
- 37 5 분 세포를 품어 ° C 세포막의 resealing 수 있습니다.
- 물론 6 각 샘플에 햄 - F12 2 ML를 추가하고 인큐베이터에 humidified 5 % CO 2 분위기에서 37 24 시간을위한 세포 ° C를 품어.
. 그림 2 전기장 프로토콜 : (A) 모든 펄스가 같은 방향으로 전달됩니다은 (B) 펄스가 또는 전기장의 방향과 방향을 변경하여 전달됩니다.
4. 이미지 수집 및 유전자 electrotransfer의 효능의 결정
- 유전자 electrotransfer의 효능은 펄스 신청 후 GFP 24 시간을 표현 세포의 비율로 결정됩니다.
- 세포는 단색 시스템 (색채 IV, Visitron, 독일)와 배출이 507 nm의에서 감지로 생성된 488 NM에서 여기 광과 (우리의 경우에는 자이스 혈구 200 Axiovert, ZR 독일) 형광 현미경을 사용하여 관찰하고 있습니다. 이미지는 이미징 시스템 (MetaMorph 이미징 시스템, Visitr을 사용하여 기록됩니다에, 독일),하지만, 다른 유사한 수집 소프트웨어도 사용할 수 있습니다.
- 20x 객관적인 확대에 적어도 다섯 이미지 (위상 콘트라스트와 녹색 형광) 취득.
- 위상 콘트라스트 이미지와 녹색 형광 이미지에서 GFP를 표현 아르 세포에서 세포를 계산합니다. 각각의 해당 이미지의 모든 세포의 수를 (그림 3)과 GFP를 표현 아르 세포의 수를 나누어 유전자 electrotransfer의 효험의 백분율을 결정합니다.
5. 대표 결과 :
그림 3. 모든 펄스가 같은 방향으로 전달되며 펄스가 또는 전기장의 방향을 변경하고 방향을 제시하여 전달됩니다되었을 때 GFP를 표현하는 세포의 비율입니다. 전지는 진폭 225 V, 기간 1 MS 1 Hz의 반복 주파수의 8 펄스의 기차에 노출되었습니다. 결과는 형광 현미경에 의해 취득되었다. 그래프의 각 값은 세 가지 독립적인 실험 ± 표준 편차의 의미를 나타냅니다. 전기장의 방향과 방향 GFP 증가를 표현 세포의 비율을 변경하여.
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Discussion
진 electrotransfer 짧은, 고전압 전기 펄스 3 적용을 통해 세포로 DNA의 전송을 가능하게하고 안전성, 효능 및 응용 프로그램의 용이성으로 인해 바이러스 벡터에 대한 안전한 대안을 대표하는 다양한 생명 공학 기술입니다. 오늘날 유전자 electrotransfer 널리 4보고되었습니다이 방법을 사용하여 셀 및 첫 단계의 모든 종류의 I 임상 시험을 transfect하는 데 사용되지만, 기본 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않습니다. 그것은 세포에 충분한 강도의 전기 펄스의 응용 프로그램이 막 불안정 5 유도 transmembrane 잠재력에 증가를 일으키는 것을 알려져 있습니다. 세포막의 투과성이 증가하고 그렇지 않으면 nonpermeant 분자는 세포를 입력합니다. 많은 매개 변수는 더 나은 유전자 전송 10-12를 활성화하는 공부했다 유전자 electrotransfer 다른 펄스 파라미터 특히 응용 프로그램의 효능에 영향을 미치는 어떤, 6-9을 설명하고 있습니다. 펄스 전송 중에 전기장 방향과 방향을 변경하면 따라서 DNA 분자의 양도에 해당 관할 영역을 증가 permeabilized 세포막의 13 영역을 증가시킵니다. 이것은 전기장의 방향과 방향이 응용 프로그램을 14 동안 변경될 때 전송 유전자를 표현 세포의 비율이 증가시킬 수있다는 것을, 표시되었다. 다른 방향으로 전기 펄스의 응용 프로그램이 1 사용될 수있다 이러한 목적을 전기 펄스 발생기의 경우. 우리 모두는 펄스가 같은 방향으로 전달됩니다 또는 펄스가 또는 전기장의 방향과 방향을 변경하여 전달하는 경우 유전자 electrotransfer의 효능의 차이를 입증하기 위해 통합 전극과 같은 펄스 발생기 및 피펫 팁을 사용하고 있습니다. 양도 GFP 유전자를 표현하는 세포의 비율은 펄스 신청 후 24 시간 평가와 펄스가 비교 또는 전기장의 방향과 방향 (생존 비율 80,8 % ± 표준 12 %) 변경하여 배달되었고, 성공적으로 transfected 세포의 증가는 언제 그랬는데 모든 펄스는 (생존율 76% ± 표준 16,2 %) 같은 방향으로 배달되었고, 얻은 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 슬로베니아어 연구기구 (프로젝트 J2 - 9770, infrastructural 센터 IP - 0510 및 프로그램 P2 - 0249)에 의해 지원되었다. 이 비디오는 "Electroporation 기반 기술 및 트리 트먼트"류블랴나, 슬로베니아 대학 전기 공학부 주최 과학 워크샵 및 대학원 과정에 대한 보충 자료를 나타냅니다. 저자는 친절 플라스미드 DNA를 제공하고 또한 Duša 홋직 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
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